Plos ONE: Primerjalna Proteomika analiza želodca rakavih matičnih celic

Povzetek

Rak matične celice (FT), so odgovorni za napredovanje raka, metastaz in ponovitve. Do danes, posebne markerje CSCS ostala neodkrita. Cilj te raziskave je bil ugotoviti novih biomarkerjev pri želodčnih CSCS za klinično diagnozo uporabo proteomike tehnologije. CSC-kot SP celice, OCUM-12 /SP celice, OCUM-2MD3 /SP celice, in njihove OCUM 12-celice matičnih in OCUM-2MD3 celice so bile uporabljene v tej študiji. Beljakovinski lizati iz vsake celične linije smo analizirali s QSTAR Elite tekočinske kromatografije z Tandem masno spektrometrijo, skupaj z izobarićnih oznake za relativno in absolutno kvantifikacije tehnologije. Kandidatke beljakovine, ki jih proteinomiko tehnologije odkrite so bile potrjene s imunohistokemičnim analizo 300 želodčnega raka. Na podlagi rezultatov LC-MS /MS, osem beljakovin, vključno RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA in KRT18, so se regulirane tako OCUM-12 /SP celic in OCUM-2MD3 /SP celice ko primerjavi z njihovimi ustreznimi matičnih celic. analizo RT-PCR je pokazala, da je raven izraz RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
in CK18
je bila visoka v OCUM-12 /SP in OCUM-2MD3 /SP, v primerjavi z nadzorom matične OCUM-12 in OCUM-2MD3. Te beljakovine so statistično pomembno povezane z napredno invazije globino, bezgavk metastaze, oddaljenih metastaz, ali napredno klinično fazi. RBBP6, DCTPP1, HSPA4 in ALDOA izraz zlasti so statistično pomembno povezane s slabo prognozo pri 300 bolnikih, ki so želodca z rakom. RBBP6 bil odločen, da je neodvisen napovedni dejavnik. Sposobnost-gibljivost spodbujanje iz OCUM-12 /SP celic in OCUM-2MD3 /SP celic je inhibira RBBP6
siRNA. Te ugotovitve bi lahko sklepali, da je osem proteini, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA in KRT18, uporabo primerjalno proteomika analizo, so bile sprejete, da so možni CSC markerji raka želodca. Od osmih proteinov kandidatke, je RBBP6 predlagal, da se obetaven prognostični biomarkerjev in terapevtski cilj za raka želodca

Navedba. Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Primerjalna Proteomika analiza želodca rakavih matičnih celic. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10,1371 /journal.pone.0110736

Urednik: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama v Birminghamu, Združene države Amerike

Prejeto: 3. maj 2014; Sprejeto: 16. september 2014; Objavljeno: 7. november 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Data Zaloga:. avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek. Pristopna številke za podatke beljakovin so vključeni kot UniProt /švicarsko-Prot v tabeli 2.

Financiranje: Ta študija se delno financira KAKENHI (Grant-v-pomoč za znanstvene raziskave, št 22390262, 23390329 in 26293307. ), National Cancer Center za raziskave in razvojni sklad (23-A-9), in prednostna raziskovalna naloga sklada Osaka City University. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Rak matične celice (FT) so opredeljene kot edinstveno podskupini v tumorjih, ki imajo sposobnost, da sproži rast tumorjev in ohranjanje samostojnosti obnovo [1]. Predlagano je bilo, da lahko povzročijo heterogeno rod rakavih celic, ki sestavljajo tumor kot tudi igrajo pomembno vlogo pri maligni napredovanje raka, kot daljni metastaz, ponovitve in chemoresistance [2] - [4]. CSCS bile na začetku identificiran v [5] akutne mieloične levkemije, vendar so pred kratkim poročali, da obstajajo v različnih vrst raka, vključno z rakom želodca [6]. Identifikacija CSC markerjev odprejo novo terapevtsko perspektivo na podlagi selektivno ciljanje to majhno populacijo celic [7], [8]. V zadnjem času pa so poročali, da je FT morda ne izražajo svoje edinstvene označevalci, kot je aldehid dehidrogenaze 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], in CD133 [12]. Vendar pa je veliko objavljenih označevalcev niso značilne za FT. Kvantitativna protein izraz profiliranje omogoča učinkovito identifikacijo točnimi in ponovljivimi diferencialnih izražanja vrednosti za beljakovine [13]. Isobaric oznake za relativno in absolutno kvantifikacijo (iTRAQ) v kombinaciji z več razsežnostmi tekočinske kromatografije (LC) in tandem masne spektrometrije analiza (LC-MS /MS) se pojavlja kot močan metodologije pri iskanju tumorskih biomarkerjev [14]. Smo že poročali, da so stranski prebivalstva (SP) celic lahko sami obnovi in ​​proizvajajo non-SP celice, in da so rakave celice v SP frakcij imajo velik potencial za pojav tumorjev, oddaljene metastaze [3], in chemoresistance [2]. To kaže, da SP celice raka želodca imajo raka izvornih celic podobne lastnosti. Zato je bil cilj te študije za odkrivanje nov CSC oznako (-e) raka želodca s primerjavo proteinski med matičnih celic in izvornih SP celice, celice, kot da so bili znano, da imajo bogato CSC prebivalstva [15].

materiali in metode

celičnih kultur

Dve želodca rakave celične linije, OCUM-2MD3 [16] in OCUM-12 [17], so bile uporabljene v tej študiji. Te celične linije izvirajo iz raka difuzna tipa želodca. Pogoj gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagle medij (DMEM; Nikken, Kyoto, Japonska) s 10% toplotno inaktiviramo fetalni telečji serum (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicilin in streptomicin in 0,5 mM natrijev piruvat, in inkubiramo pri 37 ° C. OCUM-12 /SP in OCUM-2MD3 /SP celične linije so bile SP celice, ki so bile ocenjene z analizo pretočno citometrijo uporabo Hoechst 33342 od njihovih celičnih linij matičnih, OCUM-2MD3 in OCUM-12 oz. Sortiranje je bila izvedena trikrat vzpostaviti stabilno populacijo, SP obogaten celic. Po treh mesecev inkubacijska obdobje po sortiranju, OCUM-12 /SP celice (6,5%) in OCUM-2MD3 /SP celice (12,2%) še vedno predstavljal visok odstotek frakcije SP, v primerjavi s staršev OCUM-12 (3,2% ) in OCUM-2MD3 (6,3%) celice (Slika S1). Kasneje so bili ti-SP obogaten celice s stabilno populacijo celične linije, ki se uporabljajo za analizo, kot je že poročali [18].

Človekove vzorci tkiva in informacije za bolnika

tkiva so bili osebki pridobljeni iz 300 bolnikov z diagnozo želodčnega raka dovoljene operacije na Osaka City University. Tabela 1 prikazuje clinicopathologic značilnosti 300 bolnikov želodca z rakom. Je bilo 208 moških in 92 ženskih bolnikih s srednjo starostjo 64 let (razpon, 28-85 let) v času obratovanja. Diagnoze so potrdili najmanj dve osebi. Uprizoritev je bila določena v skladu z japonskim klasifikacijo raka želodca (14 ^{th izdaja) [19]. Ta študija je bila odobrena s Mestni odbor Osaka University etiko (Osaka, Japonska). Pisno soglasje obvestil od darovalca je bila pridobljena za uporabo tega vzorca v raziskavah.
So}

Protein Identifikacija in količinska s QSTAR Elite LC-MS /MS

The rakavih celic (60 mikrogramov vsakega) homogenizira in nato lizirali z uporabo bodisi 100 xl T-PER liznega pufra (Thermo znanstvenega) ali 500 p.L 9 M Urea, in 2% CHAPS lize pufru z zaviralcem proteaze. Nato je celični lizat nato obdelamo z ultrazvokom. Po acetona padavin, so koncentracije beljakovin merjeno z BCA Protein Vsebnost (Pierce, IL, ZDA). Zmanjšanje, alkiliranje, prebavo in posledično peptid označevanje 50 ug beljakovin za vsakega vzorca smo izvedli z uporabo AB SCIEX iTRAQ reagent Multi-Plex Kit (AB SCIEX, Concord, ON, Kanada) [20]. iTRAQ z znakom Vzorci so natovori na ICAT kationsko izmenjalno vložek (AB SCIEX). Peptide smo eluirali kot šest frakcij (1 ml firme KCL raztopino 10, 50, 70, 100, 200 in 350 mm), in supernatant vsakega uparimo v vakuumski centrifugi. Vzorci so bili nato razsoljene in koncentrirali s pomočjo Sep-Pak svetlobe C18 kartuše (Waters Corporation, Milford, MA), uparimo v vakuumski centrifugi, resuspendiramo v 20 p.L 0,1% (v /v) mravljično kislino, nato nanesemo na QSTAR Elite LC -MS /MS. Vsak vzorec smo traja 150 minut. MS /MS Podatke smo iskali v primerjavi s švicarskim podatkovni bazi beljakovin (človek) z ProteinPilot programske opreme (različica 2.0, AB SCIEX) z tripsina nastavljenim kot encim prebave in metil methanethiosulfinate kot spremembo cistein. Da bi odstranili odvečne zadetkov in primerjalno kvantifikacijo, so bili rezultati iskanja pridobljeni nadalje obdelujejo ProteinPilot programske opreme z uporabo Paragon algoritem. To je povzročilo minimalni nabor upravičenih identificiranih proteinov. Vsi poročajo podatke je bila uporabljena pri 95% zaupanja cut-off omejitvijo. Relativno določanje količine peptidov je bil izračunan kot razmerje, ki ga delimo iTRAQ intenzivnost novinar. Razmerja peptidov, ki podpirajo obstoj enega proteina smo povprečje za relativno proteinske kvantifikacije. Nato so bile opravljene analize analiza ProteinPilot in Iznajdljivost pot (IPA) (Iznajdljivost sistem, Mountain View, CA). Po izvedbi Simple t-test na eni od izračunanih povprečnih razmerij beljakovin proti 1 za oceno veljavnosti beljakovin sprememb v izražanju, so poročali p-vrednost. Razmerja beljakovinski s p-vrednosti manj kot 0,05 bile obravnavane zanesljiv. Treba je znano, da je v 90% poskusnih voženj iTRAQ že naredili, je standardni odklon razmerja beljakovin, ki izhajajo iz tehničnih razlik, so poročali, da je manj kot 0,3. Zato je izraz spreminja večja od 1,2-krat ali manj kot 0,8-krat normiranih nivojih izražanja naj bi bile zunaj območja tehnične variabilnosti. Prav tako smo izvedli neoznačene analizo, in zazna prisotnost beljakovin samo v OCUM-12 /SP celic in OCUM-2MD3 /SP celic, ne pa v matičnih celic [21]. Vsak vzorec smo teči dvakrat. Uporabljena LC-MS /MS pregled skupaj z iTRAQ tehnologijo so poročali kot zanesljiv kvantitativno metodo za izražanje proteina, pri čemer je bolj občutljiva kot Western Blot, ki je odvisna od tipa uporabljenih protiteles [22].

IPA in izbor proteinov kandidatk

Baza IPA se uporablja predvsem na področju lastniških ontologijo, ki vsebuje do 300.000 bioloških izdelkov, vključno z geni, proteini, molekularne in celične procese. Zato je IPA uporabili za analizo proteinov molekularno funkcij, lokalizacije. Poleg tega smo dobili podrobne informacije v zvezi s funkcije in celične lokacije identificiranih proteinov. Na osnovi rezultatov LC MS /MS in analiz IPA, proteine, ki so bile opažene, da je prekomerno izražen v SP celičnih linij, v primerjavi z njihovimi ustrezni frekvenci izražanja v matičnih celic linij, so bili izbrani kot biomarkerjev kandidatke za SP celice raka želodca. Identifikacija mrež interakcije proteinov, kot tudi funkcionalne skupine in poti je ustvarila IPA in analiza odvisna od prej značilna združenja.

Kvantitativna realnem času povratne Transcription-verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR )

želodcu rakave celice smo gojili. In skupno celični RNA je bila vzeta s pomočjo RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNK smo pripravili iz 2 ug RNA s pomočjo naključne primerjev (Invitrogen). Za določitev pregibom spremembe v vsakem gena, je RT-PCR izvedli na ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster mesta, CA), s komercialno na voljo genske ekspresije teste (Applied Biosystems) za RBBP6
( retinoblastom veže protein 6
, Hs00544663), HSPA4
( toplotnega šoka 70kDa protein 4
, Hs00382884), HSPA9
( toplotnega šoka 70 kDa protein 9
, Hs00269818), GLG1
(Golgijev glikoprotein 1, Hs00939452), DCTPP1
( dCTP pyrophosphatase 1
, Hs00225433), VPS13A
( vacuolar protein 13 homolog
sortiranje, Hs00362891), CK18 (keratin 18
, Hs028277483), ALDOA (aldolase A
; Hs00605108), CD44
(Hs01075862), CD133
(Hs01009250) in NANOG
(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) je bila uporabljena kot interni standard za normalizacijo ravni mRNA. Vrednosti praga cikel (CT) so bili uporabljeni za izračun relativnih razmerij izražanja med nadzorom in obdelanih celic.

Western blot analiza

Izražanje raven RBBP6 in ALDOA v rakavih celicah je bila preučena, kot sledi. Celični lizati so po različnih tretmajev zbrani. Potem ko je bila prilagojena koncentracija protein vsakega vzorca, je elektroforeza izvedena z uporabo 10% Tris /Gly geli (Life Technologies, Carlsbad, CA). Beljakovinsko trakovi, pridobljene so bile prenesene na Immobilon-P Transfer membrano z (Amersham, Aylesbury, Velika Britanija). Nato smo membrano damo v raztopino PBS-T, ki vsebuje anti-RBBP6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, ZDA), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), in anti-beta-aktin (1:300 razredčitev; Sigma- Aldrich) in pustimo reagirati pri sobni temperaturi 2 uri. Ravni posebne beljakovine v vsakem lizat so odkrili z okrepljenim kemiluminiscentnim uporabo ECL plus (Amersham), nato pa avtoradiografijo.

male interferenčne RNA Design

sekvence za RBBP6
majhna interferenčna RNA (siRNA), ki so oblikovane kot sledi: si RBBP6
občutek, 5'-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 '; antisense, 5'AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ", in nontargeting siRNA (negativno-siRNA) so bila kupljena od Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP in OCUM-2MD3 /SP celice pripravljene na 60% sotočju v šest tudi jedi. Zmes transfekciji smo pripravili z dodatkom 150 tjj- Opti-MEM vključno 9 tjj- Lipofectamine RNK Imax Regant (Life Technologies) do 150 p.L Opti-MEM vključno 90 pmol z siRNA in inkubiranje 5 minut pri sobni temperaturi. Končno je bil zgornji transfekciji zmes dodamo k pripravljeno šest dobro posodo. Štiriindvajset ur po transfekciji je RT-PCR izvedli.

-celjenje ran Vsebnost

Rakave celice smo gojili v 96 vdolbinami (Essen Instruments, Birmingham, Velika Britanija). Potem ko so celice dosegle pol-sotočje je bila rana nastala v enoplastni celico s 96-dobro ga WoundMaker (Essen Bioscience, MI, ZDA). Opraskan področjih so bili sprejeti na sliki vsake 3 ure in smo spremljali z Incucyte živo-Cell Imaging sistema in programske opreme (Essen Instruments). Stopnja celične migracije smo analizirali 24 ur po zdravljenju ran kot odstotek ran sotočja. Povprečni 4 področjih, je bila izračunana kot vrednost vzorca.

Invasion Vsebnost

smo uporabili chemotaxicell komore (Kubota, Osaka, Japonska) s pore membranski filter z 12-im prevlečena z 50- mikrogramov Študiie (Collaborative Research Co., Bedford, MA). V komori (zgornja komponenta) je bila dana v kulturi ploščo 24-tudi (manjša komponenta). Želodčne rakave celice so ponovno suspendiramo do končne koncentracije 5 x 10 ^{3 celic /ml. Naslednji, 500, ul nižji komponente. Po inkubaciji 48 ur, smo rakave celice na zgornji površini membrane odstranimo z brisanjem in obarvali s hematoksilinom. Rakave celice, ki napadel skozi filter, prevlečene z Matrigel v spodnjo membrano smo ročno prešteli pod mikroskopom na x 200 povečavi. Šest naključno izbranih področjih šteli za vsak test. Srednja štirih polj je bila izračunana kot vrednost vzorca. Za vsako skupino je bila kultura poteka v treh izvodih.}

Potrditev Protein izražanja, ki ga Imunohistokemija

Imunohistokemija je bila izvedena na, vzorcev tkiva-parafin vgrajeni-formalin določen, da so deparaffinized v ksilena in dehidrirani prek ocenjena etanol. Sekcije smo segrevali 10 minut pri 105 ° C po avtoklavu v ciljne pridobivanje podatkov Rešitev (Dako). Vzorce smo nato inkubirali s 3% vodikovega peroksida, da blokira endogenega peroksidaze aktivnost. Naslednji protitelesa so bili uporabljeni v imunohistokemičnim postopku: anti-RBBP6 (retinoblastom vezavo proteinov 6; WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgijev glikoprotein 1; HPA010815, 1:80; ATLAS), anti-VPS13A (vacuolar protein sortiranje 13 homolog A; NBP1-85642, 1:500; Novus biološka zdravila), anti-ALDOA (aldolase A, fruktoza-bifosfat; HPA004177, 1:400; ATLAS), anti-DCTPP1 (dCTP pyrophosphatase 1; HPA002832, 1:200, ATLAS), anti-HSPA9 (toplotnega šoka 70 kDa protein 9, HPA000898, 1:200, ATLAS), anti-HSPA4 (toplotni šok 70kDa protein 4; HPA010023, 1:200, ATLAS), in anti-KRT18 (keratin 18; ab668, 1:500; Abcam). Vzorce inkubiramo pri vsaki protitelesom preko noči pri približno 4 ° C. Zatem smo vzorce inkubiramo v prisvojil imunoglobulina G 10 minut, nato pa tri opere s PBS. Vsi vzorci so bili nato obdelani z streptavidina-peroksidaza reagenta in inkubirali v PBS diaminobenzidine in 1% vodikovega peroksida (vol /vol), sledijo counterstaining s hematoksilinom Mayer.

Imunohistokemijsko Ocena

RBBP6, stopnje izraženosti GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA in KRT18 smo ovrednotili s tako intenzivnostjo barvanjem in delež obarvanih tumorskih celic. Intenzivnost obarvanja je dosegel na lestvici od 0-3 (0 = brez, 1 = blago, 2 = zmerno, 3 = intenzivno). Obarvajo deleži so bili dosegel na lestvici od 0-4 (odstotek je različen pri vsakem protitelesa), ki temelji na odstotku pozitivno obarvanih celic. Zato bi končno obarvanje ocena, ki je bila izračunana kot večkratnik oceno intenzivnosti obarvanja in rezultata za obarvanje delež, bi na lestvici od 0-12. Ravni izraz DCTPP1 je štela za pozitivno, ko je prejel rezultat 3. ravni izražanja HSPA4 je štela za pozitivno, ko je prejela rezultat 6. ravni izražanja ALDOA, KRT18, VPS13A in GLG1 je štela za pozitivno, če sta prejeli rezultat 8. RBBP6, ocena, ki je bila le ocena obarvanje delež se uporablja za izračun, je bil pozitiven, ko je prejela točk 3. HSPA9, ocenjevanje katerih je bila le ocena intenzivnost obarvanja, ki se uporablja za izračun, je bil pozitiven, tako pri prejetih točk 3. Vse ocene so bile narejene z dvema opazovalcev, ki so bili ne zavedajo kliničnih podatkov in rezultatov. Ko je bil najden neskladnih ocena med dvema neodvisnih opazovalcev, so diapozitivi ponovno preveri in prevrednotijo ​​po razpravi.

Statistična analiza

Program SPSS opreme (SPSS Japonska, Tokyo, Japonska) je bil uporabljen za Analiza podatkov. Statistična pomembnost združenj med ekspresijo proteinov in različnih clinicopathological spremenljivk, vključno starost, spol, makroskopski tip diferenciacije tumorja, skupno število odstranjenimi bezgavke in vrsto operacije je (D1 ali D2 želodca) ovrednotili s Fisher je in Chi -squared testi. Krivulji preživetja so bili izračunani na dan kirurškega posega do smrti ali do zadnjega spremljanja opazovanja z uporabo Kaplan-Meier metode. Poleg tega so bile ocenjene razlike med krivuljami preživetja uporabo Log-rank test je. Multivariatne analize so bile izvedene v skladu z Cox regresijski model za ugotavljanje povezave med clinicopathological spremenljivk in umrljivosti. P-vrednosti < 0,05 štela statistično značilno

Rezultati

stemness celičnih linij raka želodca

Odstotki SP celic so bile višje v OCUM-12. /SP in OCUM-2MD3 /SP celice kot v njihovi matični OCUM-12 in OCUM-2MD3 celic (Slika S1). Rak matičnih celic označevalci SP celic, OCUM-12 /SP in OCUM-2MD3 /SP, kot so CD44, CD133 in NANOG, smo analizirali z RT-PCR. Raven izražanje teh označevalcev smo v obeh celičnih linijah SP znatno povečal v primerjavi z njihovimi celičnih linij matičnih (Slika S2). Število Zrnce kolonije je bila bistveno višja v obeh OCUM-12 /SP in OCUM-2MD3 /SP celic od svojih matičnih OCUM-12 in OCUM-2MD3 celice (podatki niso prikazani).

Detekcija proteinov kandidatk

Ugotavljali smo, ali so bile beljakovine različno ali samostojno izražen v SP celicah, in primerjali naše ugotovitve s tistimi iz matičnih celic, ki uporabljajo QSTAR Elite LC-MS /MS. Pri analizi bioloških procesov in s 95% zaupanja cut-off stikala in p < 0,05, smo ugotovili, da so proteini res različno izražena. Rezultati teh ugotovitev so predstavljeni v sliki 1. Večina proteinov smo prekomerno izražen v citoplazmi tumorskih celic (slika 1A). Vrednost P vključen v analizo iznajdljivost je navedeno v tabeli S1. Ti proteini so bili odločeni, da se v zvezi s celične procese, kot so celične smrti, presnovo, celično organizacijo, metabolizem DNA, razgradnje beljakovin in predelavo RNA (slika 1B). Top kanonske poti, povezane s temi cilji in označene z IPA so prikazani v tabeli S2.

V primerjavi z njihovimi ustreznimi matičnih celic je bilo 40 proteini up-urejena v OCUM-12 /SP in 35 proteini so se -regulated v OCUM-2MD3 /SP. Med temi proteinov, osem so se regulirane tako OCUM-12 /SP celic in OCUM-2MD3 /SP celic, medtem ko so opazili, kot združenje ne med njihovimi ustreznimi matičnimi celicami (tabela 2 in slika 1C). Od teh osmih proteinov, tri proteine, RBBP6, GLG1 in VPS13A so neodvisno odkriti v obeh celičnih linijah SP, ne pa tudi v svojih ustreznih matičnih celic. Pet proteini, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA in KRT18 je značilno prekomerno izražen v primerjavi z njihovimi ustreznimi matičnih celic za vsaj 1,2-krat v obeh SP celicah.

Raven mRNA izraz teh 8 kandidatke molekule, RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
in CK18
je v OCUM-12 /SP (9,15-krat, 9,36-krat, 4,14-krat večja, 7,80 krat, 2,08 krat, 1,46 krat, 3,44-kratno in 1,99-krat, v tem zaporedju) in OCUM-2MD3 /SP (6,15 krat, 1,71 krat, 2,33 krat, 2,30 krat, 2,03 krat, 1,32 krat, 1,35-kratno in 1,31-kratno, zaporedju) celice, v primerjavi s tistimi nadzorom matičnega OCUM-12 in OCUM-2MD3 celice (Slika 1D). Western blot analiza je pokazala, da je bila raven izraz RBBP6 in ALDOA visoko CUM-12 /SP in OCUM-2MD3 /SP celic, v primerjavi s tem, da OCUM-12 in OCUM-2MD3 celic (Slika S3).

mreža predstavljena na sliki 1E je ustvarila IPA in analiza odvisna od prej značilna in poročali proteinskih interakcij. Tako RBBP6, ki so opazili, da je prekomerno izražen v CSC-, kot SP celice, OCUM-12 /SP celice in OCUM-2MD3 /SP celice, je neposredno povezana z HSPA4 in Rb, in posredno povezana z Hsp90 in TAGLN2. HSPA4, Hsp90 in TAGLN2 je bilo ugotovljeno tudi, da je up-urejena v CSC podobnih SP celic.

Vpliv siRBBP6 transfekciji o migraciji in invazivnih sposobnosti želodčnih rakavih celic

Slika 2A kaže, da si RBBP6
transfekciji znatno zmanjšal mRNA nivo ekspresije obeh SP celičnih linij (OCUM-12 /SP je bila 12%, p < 0,01 bila OCUM-2MD3 /SP 2,5% p. < 0,01), v primerjavi s da z negativno-siRNA transfekciji. RBBP6
siRNA rasklapanje občutno zmanjšala invazijo (slika 2B) in migracije aktivnost (slika 2C) obeh SP celic.

Imunohistokemično Ocena proteinov kandidatk in njihova zveza s Clinicopathological funkcije

RBBP6, DCTPP1 in HSPA9 so opazili, da se izrazi predvsem v citoplazmi in jedra želodca rakavih celic. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA in KRT18 so opazili, da se izrazi predvsem v citoplazmi (slika 3A). V normalnih epitelijskih celic, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1 in HSPA9 izražanja so bile ugotovljene nekatere celice v epitelijske žleze. KRT18 so bili izraženi v večini epitelijskih celic. HSPA4 in ALDOA izraz ni bilo mogoče najti v normalnih celicah. BBP6, DCTPP1 in HSPA9 so bili izraženi v citoplazmi in jedra normalnih epitelijskih celic. GLG1, VPS13A, HSPA9 in KRT18 so v citoplazmi epitelnih celic (slika 3B) opazili.

smo raziskovali povezavo med stopnjo ekspresije osmih proteinov kandidatk in clinicopathological funkcije. Število primerov za vsako oceno za osem ciljev, je prikazano v tabeli S3. Teh osem proteinov smo določili, da je povezana s potencialno malignih procesov, kot so oddaljene metastaze, limfnih (LN) metastaziranje, globina invazije ali stopnjo napredovanja (tabela 3). Izračunane vrednosti p so bili naslednji: RBBP6 je značilno povezana z globino invazije (p < 0,001), LN metastaze (p < 0,001), oddaljenih metastaz (p = 0,013), in klinični fazi (p < 0,001); GLG1 je značilno povezana z le daljni metastaze (p = 0,045). VPS13A je značilno povezana z globino invazije (p = 0,005), LN metastaze (p < 0,001) in fazi napredovanja (p = 0,005); DCTPP1 je značilno povezana z globino invazije (p < 0,001), LN metastaze (p < 0,001), oddaljenih metastaz (p < 0,001) in fazi napredovanje (p < 0,001); HSPA9 je značilno povezana z globino invazije (p < 0,001), LN metastaze (p < 0,001) in fazi napredovanje (p < 0,001); HSPA4 je značilno povezana z globino invazije (p < 0,001), LN metastaze (p < 0,001), oddaljenih metastaz (p = 0,007), in odrsko napredovanje (p < 0,001); ALDOA je značilno povezana z globino invazije (p = 0,034), LN metastaze (p = 0,004), in odrsko napredovanje (p = 0,029); in KRT18 je značilno povezana z globino invazije (p = 0,001), LN metastaze (p = 0,001), oddaljenih metastaz (p = 0,034), in odrsko napredovanje (p = 0,004).

Prognoza

Kaplan-Meier parcele je predlagal, da od osmih prekomerno izražene proteine, RBBP6, DCTPP1, HSPA4 in ALDOA, so statistično pomembno povezane s slabim preživetja pri vseh bolnikih (slika 4). Kumulativna petletno splošna stopnja preživetja RBBP6 pozitivnih primerov (61%) je bila znatno manjša (p = 0,002), kot je RBBP6 negativnih primerov (78%). Poleg tega je pri bolnikih v fazi III, je bila skupna stopnja preživetja RBBP6-pozitivnih primerov bistveno manj (p = 0,034), kot je RBBP6 negativnih primerov. Prognoza bolnikov z DCTPP1 pozitivnimi tumorji (63%) je bila bistveno slabši (p = 0,016), kot je DCTPP1 negativnih tumorjev (75%). Splošna stopnja preživetja petletna HSPA4 pozitivnih primerov (66%) je bila znatno manjša (p = 0,047), kot je HSPA4 negativnih primerov (75%). skupna stopnja preživetja petletna ALDOA pozitivnih tumorjev razstavlja prekomerno ekspresijo (61%) je bila bistveno slabši (p = 0,043), kot je ALDOA negativnih tumorjev (72%). V nasprotju s tem so med drugimi proteini in preživetja bolnikov opazili nobenih pomembnih korelacije. Po univariatno analizo, so bile stopnje izraženosti RBBP6, DCTPP1, HSPA4 in ALDOA značilno povezana s slabo prognozo pri 300 bolnikih želodca z rakom (tabela 4). Poleg tega makroskopske tip (tip 4), histološki tip (razpršeno), T kategorijo (T2-4), invazijo plovilo, pronicanja vzorec (INF b, c), peritonealna metastaze in LN metastaz bilo ugotovljeno, da so bistveno povezana z slabo prognozo. Multivariatna analiza je bila opravljena s pomočjo Cox sorazmernih tveganj model za vse pomembne spremenljivke v univariantne analize. Po zaključku analize, RBBP6 izražanja (p = 0,023), BORRMANN tipa 4 (p < 0,001), peritonej pozitiven (p = 0,001), LN metastaze (p = 0,003), in jetrne metastaze (p = 0,001) je bilo potrjeno, neodvisne dejavnike povezana s preživetjem (tabela 3). Od osmih beljakovine, je RBBP6 izraz neodvisen napovedni dejavnik.

Pogovor

želodcu rezultati raka v slabo prognozo zaradi pogostih metastatskih procesov, kot so LN metastaz in peritonealno metastaz [23]. CSCS bilo predlagano, da ima pomembno vlogo pri malignega potenciala rakavih celic, vključno z oddaljeno metastaz in chemoresistance [4]. Ker smo ugotovili, da SP celice, pridobljene iz želodca osebah z rakom imajo te CSC lastnosti [3]. Potrdili smo, da SP celice izkoriščena v tej študiji hitrih markerjev kandidat rak želodca izvornih celic, vključno s CD44 [24], CD133 [25], in NANOG [26] (Slika S2). Sferoidna oblikovanje kolonija dejavnost teh SP celicah je bila višja od matičnih celic [18]. Prav tako so ti CSC podobni SP celice kažejo chemoresistance da antikarcinomsko drog [2]. Te ugotovitve so potrdili, da lahko OCUM-12 /SP celice in OCUM-2MD3 /SP celice predstavljajo rak matičnih celic podobne lastnosti. Ker so posebne markerji za zdravljenje želodčnih FT ni bila objavljena kot doslej, bi pojasnitev posebnih signalnih poti in mehanizme, ki so podlaga za dejanja CSCS izboljša prognozo raka želodca. V tej študiji je bilo osem CSCS kandidatke markerji označene z proteomskimi tehnik z uporabo LC-MS /MS skupaj z iTRAQ tehnologijo. Tri beljakovine, RBBP6, GLG1 in VPS13A, so odkrili šele v celičnih linijah SP ne pa tudi v svojih staršev celičnih linijah. Poleg tega je bilo pet proteini, HSPA9, ALDOA, DCTPP1, HSPA4 in KRT18, prekomerno izražen v obeh celičnih linijah SP glede na njunih staršev celičnih linijah. analizo RT-PCR je navedeno tudi, da je raven izraz RBBP6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
in CK18
bila visoka OCUM-12 /SP in OCUM- 2MD3 /SP, v primerjavi z nadzorom matične OCUM-12 in OCUM-2MD3. sumijo, da je nova biomarkerjev za zdravljenje želodčnih CSCS Te beljakovine. To hipotezo smo preverili z imunohistokemičnim analizo 300 želodca primerov raka.

RBBP6 je jedrska protein, ki je znano, a do povezana in potencialno povezan s p53 in retinoblastom vezavo Q protein 1 (RBQ-1) [ ,,,0],27]. RBBP6 interakciji s tumorsko zaviralni beljakovine p53 in Rb, in igra pomembno vlogo pri indukcijo apoptoze, kot tudi regulacijo celičnega cikla [28], [29]. RBBP6 veže z divjim tipom P53 proteinov, vendar ne p53 mutanti [30]. Prav tako je bilo dokazano, da spodbujajo vezavo Mdm2 [31] bo E3 ubikvitin ligaza, ki cilja na p53 [32], in posegati v njegovo sposobnost, da transactivate ciljnih genov [33]. Up-ureditev je bila od RBBP6 močno povezana z napredovanja tumorja v požiralniku raka in raka materničnega vratu [32]. V tej študiji je bila RBBP6 izraz povezan s kategorijo raka "T" v zvezi z globino invazije, oddaljenih metastaz, bezgavk metastaz in klinični fazi. Poleg tega je bil RBBP6 izraz značilno povezana s slabim preživetje pri bolnikih na vseh stopnjah, zlasti na stopnji III, zaradi česar je sklepati, da je bila RBBP6 neodvisen dejavnik za preživetje. Opravili smo RBBP6
siRNA rasklapanje za RBBP6
gena uporabo OCUM-12 /SP celice in OCUM-2MD3 /SP celice v tej študiji.

• Plos ONE: Photoimmunotherapy želodčnega raka peritonealno karcinomatozo v Mouse Model
• Plos Genetics: zarodne Mutacije MAP3K6 so povezani z družinsko želodca Cancer