PLOS ONE: Photoimmunotherapy för magcancer Peritoneal karcinomatos i en musmodell

Abstrakt

Photoimmunotherapy (PIT) är en ny cancerbehandling som kombinerar specificiteten hos antikroppar för målsökning av tumörer med toxicitet inducerad av fotosensibilisatorer efter exponering för nära infraröd (NIR) ljus. Vi utförde PIT i en modell av disseminerad magcancer peritoneal karcinomatos och övervakas effekt med In vivo
GFP fluorescens avbildning. In vitro Mössor och In vivo
experiment utfördes med en HER2-uttryckande, GFP-uttryckande, magcancer cellinje (N87-GFP). Ett konjugat som består av en fotosensibiliserare, IR-700, konjugerad till trastuzumab (tra-IR700), följt av NIR ljus användes för PIT. In vitro
PIT utvärderades genom mätning av cytotoxicitet med död-färgning och en minskning av GFP-fluorescens. In vivo
PIT utvärderades i en sprids peritoneal karcinomatos modell och en flank xenograft med hjälp av tumörvolymmätningar och GFP fluorescensintensitet. In vivo
antitumöreffekter av PIT bekräftades av betydande minskningar i tumörvolym (vid dag 15, p < 0,0001 mot kontroll) och GFP fluorescensintensitet (flanken modell: vid dag 3, PIT behandlade vs. kontroll p < 0,01 och peritoneal disseminerad modell: vid dag 3 PIT behandlas jämfört med kontroll, p < 0,05). Cytotoxiska effekter in vitro
visade sig vara beroende av ljusdosen och orsakade nekrotisk cell bristning som leder till GFP utsläpp och en minskning i fluorescensintensitet in vitro.
Således, förlust av GFP fluorescens eras som en användbar biomarkör av cell nekros efter PIT

Citation. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy för magcancer Peritoneal karcinomatos i en musmodell. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10.1371 /journal.pone.0113276

Redaktör: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA

emottagen: 2 juli 2014; Accepteras: 21 okt, 2014; Publicerad: 17 November, 2014

Detta är ett öppet tillträde artikeln fri från all upphovsrätt, och kan fritt reproduceras, distribueras, överföras, modifieras, byggd på, eller på annat sätt användas av någon för något lagligt syfte. Arbetet görs tillgänglig under Creative Commons CC0 public domain engagemang

datatillgänglighet. Författarna bekräftar att all data som ligger till grund resultaten är helt utan begränsning. Alla relevanta uppgifter finns inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete stöddes av NIH Intramural programmet och JSPS Research Fellowship. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer orsakar mer än 740.000 cancerrelaterade dödsfall per år i hela världen, särskilt i Asien [1] - [3]. Majoriteten av gastric cancerpatienter närvarande med lokalt avancerad, recidiverande eller metastaserande sjukdom utgör hinder för kurativ kirurgi som oftast sköts av icke-kurativ behandling [1]. Peritoneal karcinomatos och levermetastaser är vanliga livshotande manifestationer av långt framskriden magcancer [1], [4]. Peritoneal karcinomatos förekommer också i äggstockarna, appendiceal, kolon, bukspottkörtel och magsäck. Prognosen är allmänt dålig och lokala behandlingar är alltid misslyckas med hög återfallsfrekvens och sjuklighet i samband med ascites och bowelbarriär. Systemisk terapi är också oftast misslyckas. Således behövs nya metoder för behandling av peritoneal karcinomatos.

Photoimmunotherapy (PIT) är ett nytt mål-cellspecifik cancerbehandling som utnyttjar en antikropp fotosensibilisator konjugat (frivilliga överenskommelsen) följt av nära infraröd (NIR) ljusexponering. En frivilliga överenskommelsen består av en cancercell-specifik monoklonal antikropp (mAb) och en fotosensibilisator, IR700, som är en kiseldioxid-ftalocyanin-derivat kovalent konjugerad till antikroppen. Den frivilliga överenskommelsen binder målmolekyler på cellmembranet och sedan inducerar nästan omedelbar cellnekros efter exponering för NIR-ljus vid 690 nm. In vitro
studier har visat PIT vara mycket cellspecifik därför icke uttryckande celler omedelbart intill målceller visar inga toxiska effekter [5]. Celler behandlade med PIT undergå snabb volymexpansion leder till bristning av cellmembranet, strängsprutning av cellinnehåll in i det extracellulära utrymmet, och irreversibel nekros [6] - [8]. Våra resultat och andra visar att cytotoxicitet inducerad av PIT inte helt förlitar sig på reaktiva syreradikaler eller förekomsten av singlettsyre släckare [9]. Vidare är cytotoxicitet inducerad av PIT främst inom cellmembranet snarare inom mitokondrierna som inträffar med PDT.

Medan PIT resulterar i snabb cellulär nekros, den totala volymen av tumören får inte ändra i flera dagar. Detta beror på att det tar åtminstone flera dagar för makrofager att komma in, process och lämnar den behandlade tumören. Därför nya metoder, bortom storleksmätningar, behövs för att övervaka effekterna av PIT. Fluorescensproteiner (fps) används vanligtvis för att visualisera cellulära processer [10], [11]. Medan de flesta apoptotisk celldöd resulterar i bevarandet av cellmembranet och kvarhållning av FP gör fluorescensen okänslig till celldöd [12], [13], i PIT, den plötsliga bristningar i cellmembran resulterar i extrudering av cytoplasmisk fps och därför ett relativt snabb avläsning av celldöd. En fördel med fps för In vivo
avbildning är att de inte kräver yttre injektioner av medel (såsom luciferin i fallet med bioluminescens) och kan övervakas i realtid [14] - [18]. Eftersom de kräver gen transfektion, skulle de förmodligen bara vara till nytta i prekliniska studier.

I denna studie undersökte vi effekten av PIT i en musmodell av disseminerad peritoneal gastric cancer med in vivo GFP fluorescens avbildning till övervaka svar.

Material och metoder

Reagens

Vattenlösliga lösliga~~POS=HEADCOMP, kisel-ftalocyanin-derivat, IRDye 700DX NHS-ester och IRDye 800 CW NHS-ester erhölls från LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, en fullt humaniserad IgG _{2 mAb riktad mot EGFR, köptes från Amgen (Thousand Oaks, Kalifornien, USA). Trastuzumab, 95% humaniserad IgG en mAb riktad mot HER2, köptes från Genentech (South San Francisco, CA, USA). Alla andra kemikalier var av reagenskvalitet.}

Syntes av IR700-konjugerad trastuzumab eller panitumumab och IR800-konjugerad trastuzumab

Konjugering av färgämnen med mAb utfördes enligt en tidigare rapport [19]. I korthet, panitumumab eller trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) inkuberades med IR700 NHS-ester (60,2 pg, 30,8 nmol) eller IRDye 800 CW NHS-ester (35,9 pg, 30,8 nmol) i 0,1 mol /L Na _{2HPO 4 (pH 8,6) vid rumstemperatur under en timme. Blandningen renades med en Sephadex G50-kolonn (PD-10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Proteinkoncentrationen bestämdes med Coomassie Plus-proteinanalys-kit (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA) genom mätning av absorptionen vid 595 nm med spektroskopi (8453 värdesystem; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Koncentrationen av IR700 eller IR800 mättes respektive genom absorption vid 689 nm eller 774 nm med spektroskopi för att bekräfta antalet fluoroforenheter molekyler konjugerade till varje mAb. Syntesen kontrollerades så att ett genomsnitt av fyra IR700 molekyler och två IR800-molekyler bundna till en enda antikropp. Vi utförde SDS-PAGE som en kvalitetskontroll för varje konjugat såsom tidigare rapporterats [19]. Vi förkorta IR700 konjugerad till trastuzumab som tra-IR700 till panitumumab som pan-IR700 och IR800 konjugerad till trastuzumab som tra-IR800.}

Cellodling

N87-GFP celler som stabilt uttrycker GFP köptes från ANTI CANCER (San Diego, CA, USA). Hög GFP-uttryck bekräftades i frånvaro av ett selektionsmedel med 10 passager. För att utvärdera specifik celldödning av PIT ades 3T3-celler som stabilt uttrycker DsRed (3T3 /DsRed) användes som en negativ kontroll [5]. Celler odlades i RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies) i vävnadsodlingskolvar i en fuktad inkubator vid 37 ° C vid en atmosfär av 95 % luft och 5% koldioxid

fluorescensmikroskopi

för att detektera antigenspecifik lokalisering av IR700 konjugat och förändringen i cellmorfologin efter PIT var fluorescensmikroskopi utfördes (IX61 eller IX81. Olympus America, Melville, NY, USA). Tiotusen celler såddes på cover-glas botten skålar och inkuberades under 24 h. Tra-IR700 tillsattes sedan till odlingsmediet (fenol rött fritt) vid 10 mikrogram /ml och inkuberades vid 37 ° C under 6 h. Cellerna tvättades sedan med PBS; Propidiumjodid (PI) (1:2000) eller Cytox Blue (1:500) (Life Technologies) tillsattes till mediet 30 min innan PIT för att detektera döda celler. Cellerna exponerades sedan för NIR ljus och seriella bilder erhölls. En dag efter PIT tvättades cellerna och inkuberades med nytt medium efter PIT (0,5 J /cm ^{2) och PI tillsattes ånyo. För att säkerställa att samma region avbildades markeringar gjordes på varje odlingsskål för att ange var bildförvärvades. Filtret var inställd för att detektera IR700 fluorescens med ett 590-650 nm excitationsfilter och ett 665-740 nm bandpassemissionsfilter. Analys av bilderna utfördes med ImageJ programvara (http://rsb.info.nih.gov/ij/).}

Flödescytometri

fluorescens från celler efter inkubation med pan-IR700 eller tra-IR700 mättes med användning av en flödescytometer (FACS Calibur, BD Biosciences, San José, CA, USA) och Cellquest mjukvara (BD Biosciences). Celler (1 x 10 ^{5) inkuberades med varje konjugat under 6 h vid 37 ° C. För att validera den specifika bindningen av den konjugerade antikroppen, avlägsnades överskott av antikropp (50 ^ g) används för att blockera 0,5 ^ g av färgämnes antikroppskonjugat [8].}

In vitro PIT

Hundratusen celler såddes i plattor med 24 brunnar och inkuberades under 24 h. Odlingsmedia ersattes med färskt odlingsmedium innehållande 10 ^ g /ml av tra-IR700 och cellerna inkuberades under 6 h vid 37 ° C. Efter tvättning med PBS, fenolrött fritt odlingsmedium tillsattes. Sedan cellerna bestrålas med NIR laserljus vid 685-695 nm våglängd (BWF5-690-8-600-0.37, B &. W TEK INC, Newark, DE, USA). Den faktiska effekttäthet mW /cm ^{2 mättes med en optisk effektmätare (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, USA).}

cytotoxicitetsanalys

De cytotoxiska effekterna av PIT med tra-IR700 bestämdes genom flödescytometrisk PI-färgning, som detekterar komprometterade cellmembran. För flödescytometrisk analys, trypsinerades cellerna 1 h efter behandling och tvättas med PBS. PI tillsattes i cellsuspensionen (slutlig 2

• PLOS ONE: MED30 Reglerar spridning och motilitet för magcancer Cells
• PLoS ONE: Jämförande Proteomics Analys för magcancer Stem Cells