Plos ONE: znotraj tumorskih Heterogenost HER2, FGFR2, cMet in ATM želodčnega raka: Optimizacija osebno zdravstveno nego z inovativno patološko in statistični Analysis

Povzetek

Aktualni razvojna prizadevanja zdravilo za raka želodca so usmerjeni proti več molekularna cilji ki spodbujajo rast tega neoplazme. Znotraj protitumorski biomarkerjev heterogenost pa pogosto opazimo raka želodca, lahko privede do pristranskega izbora pacientov. MET, ATM, FGFR2 in HER2 so profilirane na želodcu vzorcih raka biopsijo. Inovativna patološko ocena je bila izvedena s pomočjo točkovanja posameznih biopsije proti celih biopsije iz enega bolnika, da se omogoči ocena heterogenost. Po tem, so bili ocenjeni lažno negativni tveganja za vsako biomarker v silicij
. 166 želodca primerov raka z več biopsije iz posameznih bolnikov so bili zbrani od Shanghai Renji Hospital. Po vnaprej postavljenih kriterijev, 56 ~ 78% primerov je pokazala, nizka, 15 ~ 35% je pokazala, srednje in 0 ~ 11% je pokazala veliko heterogenost znotraj biomarkerjev profiliranih. Če bi bila 3 biopsije zbrani iz enega pacienta je bila lažno negativna tveganja za detekcije biomarkerjev blizu 5% (razen za FGFR2: 12,2%). Ko so bili zbrani 6 biopsije, lažna negativna tveganja približal 0%. Naša raziskava dokazuje koristi večkratnega vzorčenja biopsije pri obravnavi osebno strategijo bio-označevalce zdravstvenega varstva, in zagotavlja dober zgled za reševanje izziva znotraj tumorskemu biomarkerjev heterogenosti uporabo alternativnih patološko oceno in statističnih metod

Navedba. Ye P, Zhang M, Fan S Zhang T Fu H Su X, et al. (2015) znotraj tumorskih Heterogenost HER2, FGFR2, cMet in ATM želodčnega raka: Optimizacija osebno zdravstveno nego z inovativno patološko in statistični analizi. PLoS ONE 10 (11): e0143207. doi: 10,1371 /journal.pone.0143207

Urednik: Daniele Generali, Instituti Ospitalieri di Cremona, Italija

Prejeto: 30. julij 2015; Sprejeto: 2. november 2015; Objavljeno: 20. november 2015

Copyright: © 2015 Ye et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. AstraZeneca je sponzoriral to študijo. Financer zagotovila podporo v obliki plač za avtorje [Py, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG in XY] in predvidenega objekta in sredstev za dokončanje te študije. Posebne vloge teh avtorjev zglobni v poglavju "prispevki avtorski"

nasprotujočimi si interesi. Avtorji povezane z AstraZeneca so zaposleni za polni delovni čas in /ali deležniki AstraZeneca. Ta študija je potekala pod pokroviteljstvom AstraZeneca. To ne spremeni pripadnost avtorjev za PLoS ONE politik o izmenjavi podatkov in materialov. Avtorji izjavi, da nimajo nobenih drugih konkurenčnih interesov.

Uvod

Rak želodca (GC) je ena najpogostejših rakavih obolenj na svetu, s približno polovico vseh primerov, ki se pojavljajo v vzhodni Aziji (v glavnem Kitajska), in je tretji najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu [1]. Čeprav se število zmanjšuje, so v večini primerov GC diagnosticirali v zaključni fazi in prognoza bolezni še vedno slaba [2]. Srednji čas preživetja metastatskega GC je manj kot eno leto, medtem ko je celotna 5-letno preživetje je manj kot 7% ​​[3].

znotraj protitumorski heterogenost je pogosto opaziti v GC. V 1980-ih, de Aretxabala et al
ocenili 222 vzorcev iz 37 primerov GC in našel mešanico diploidnih in aneuploidno vzorcev ali različnih aneuploidno stemlines v isti zadevi (tako imenovani DNK vsebina heterogenosti) v 33% primarne tumorji [4]. Podobna raziskava Yonemura et al
je pokazala 69% vsebnost DNA heterogenosti je v 65 reseciranih vzorcih GC [5]. V zadnjem času, Yang et al
ocenili GC vzorci 148 bolnikov in ugotovljeno stopnjo heterogenosti 79,3% v človeški epitelijskih rastnega faktorja receptorja 2 (HER2) protein prekomerno in 44% v HER2
gen ojačanja [6]. Skladno s tem je visoka znotraj protitumorski heterogenost opazili pri GC lahko prispeva k odpornosti zdravljenja in slabšo prognozo bolnikov [7, 8], in na koncu predstavlja precejšen nenaslovljene problem z zdravniki, patologi in raziskovalci s katerimi se soočajo.

več molekularne tarče trenutno imajo v obeh potrjenih drog ali obetavnih terapij v postopku kliničnega razvoja v GC. HER2 igra pomembno vlogo pri tumorigeneze raka dojke, raka na jajčnikih in rak želodca [9] in trastuzumab, monoklonsko protitelo proti HER2 je bil odobren za zdravljenje GC [10]. Gen mezenhimskih-epitelijskih prehod faktorja (MET) kodira protein, ki je edini znani receptorja hepatocitnega rastnega faktorja (HGF) ligandom [11]. Met
pomnoževanje genov in beljakovin čezmernim se je pokazalo, da vodi k stalnem aktivacijo signalne poti MET, ki prispeva k rasti tumorja, angiogenezo in metastaze [12]. Več zaviralcev MET so trenutno v fazi kliničnih preskušanj GC, vključno Savolitinib (faza 1 (NCT02252913) [13]) in AMG337 (faza 2 (NCT02016534)). Podobno je fibroblastnega rastnega faktorja receptorja 2 (FGFR2) vpleten tudi v celično proliferacijo, diferenciacijo in gibljivosti in pomnoževanja FGFR2
gen igra pomembno vlogo pri tumorigeneze GC, s čimer so poudarili njegovo privlačnost kot razvoj drog ciljna [14-16]. Ataksija telangiectasia mutiral (ATM) je protein kinaze, ki spada v fosfatidilinozitol 3 'kinaze (PI3K) družine, in v normalnih pogojih se aktivira v odgovor na DNA dvojno sklop odmori [17]. Pomanjkljivost ATM je povezano z visoko stopnjo tkivnih malignostmi [18-20] in ATM-pomanjkanjem tumorjev celice so občutljive na poli (ADP-riboza) polimerazo-1 (PARP) inhibicije, potencialni ciljni ki je bil predlagan za zdravljenje GC v več predhodnih študijah [21-24]. Lynparza, prvi ameriški in evropski odobrila ciljanje inhibitor PARP BRCA1 /2 mutant raka na jajčnikih, je trenutno v fazi kliničnega preskušanja faze III pri GC (NCT01924533) in zaposluje pristop bolnik izbor bio-označevalce z uporabo izraza ATM z IHC (objave v medijih) .

v sedanjem času molekularno ciljnega razvoja zdravil, se biomarkerjev pričakuje, da natančno predvideti klinični odziv [25]. Visoko tumor heterogenost pa lahko privede do pristranskosti za odkrivanje biomarkerjev, če se vzorci pridobljeni iz majhnega tumorja regijo namesto celotnega tumorsko tkivo (npr kirurško odstranjenimi vzorci so običajno le 2 cm x 2 cm). V nasprotju s tem pa so biopsije vzorci navadno odvzamejo iz različnih regij celotnega tumorja in so verjetno bolj ustreza splošnem stanju biomarkerjev ekspresije pacienta, zavzemajo za svoj potencial, da se zmanjša vpliv znotraj tumorskemu heterogenosti na bolnika izbire pristranskosti.

v raziskavi, da bi bolje ocenili znotraj tumoralne heterogenost, smo uporabili kirurško biopsijo, kot je naša strategija vzorčenja tumor. Poleg tega smo izvedli inovativen patološko oceno s točkovanjem posameznih biopsije proti celih biopsije iz posameznih bolnikov. Tu smo uporabili tudi statistične metode za oceno lažno negativna tveganja za odkrivanje pri analizi končnega števila biopsije, da bi razumeli razmerje med številom biopsije in tveganje izbire lažno pozitiven pacienta za določeno zdravljenje ali vključitev v kliničnem preskušanju .

materiali in metode

podatki za bolnike

Archived GC biopsije vzorci so bili zbrani od 166 bolnikov, ki so prejemali gastroskopija pregled s številnimi biopsije iz različnih tumorskih področij vsakega bolnika med letoma 2007 in 2014 na Renji bolnišnici, Šanghaj, Kitajska. Predhodno pisno privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikih in protokol študija je odobril bolnišnice Renji Institutional Review Board. Vsi vzorci so bili pregledani dve usposobljeni patologi za GC diagnozo in štirideset vzorcev so izključili iz študije zaradi slabe kakovosti tkiva.

imunohistokemija (IHK)

formalin fiksnih in parafinske vgrajeni (FFPE) vzorcev so deljiva v debelini 4μm. Za obarvanje MET, je bila uporabljena zajec monoklonsko anti-skupna protitelesa MET (cMet SP44, Ventana Medical Systems, AZ, ZDA) in test je bil izveden na avtomatsko Stainer (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, ZDA). ATM obarvanje je bila izvedena s pomočjo zajec monoklonsko protitelo anti-ATM (ab32420, Abcam, MA, ZDA) na autostainer (Thermo znanstvenega, MA, ZDA). HER2 obarvanje je bila izvedena s pomočjo HercepTest komplet (Dako, Danska), po navodilih proizvajalca na avtomatsko Stainer (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, ZDA).

fluorescence in situ hibridizacija (FISH)

RIB test dvojnega barve smo izvedli kot je opisano predhodno [26]. HER2 /CEP17
sonde so bile kupljene od Vysis (IL, ZDA;. Cat-171060). MET
in FGFR2
sonde smo pripravili z označevanjem BAC (CTD-2270N20 in RP11-62L18, v tem zaporedju) DNK z Red-dUTP (Enzo Biochem, NY, ZDA;. CatN;23- 050), CEP10
-Spectrum Green in CEP7
-Spectrum Green sonde iz Vysis (kat so bile kupljene. -112010 in -132007, v tem zaporedju) in se uporabljajo kot notranjih kontrol za FGFR2
in Met
sonde

ocena Pathology na biopsije

na podlagi H &. E obarvanje, vsak biopsija z ustreznimi tumorskih celic (več kot 50 tumorske celice) je najprej zaznamovala patologa. Nato je bilo stanje biomarkerjev vključno IHC in FISH obarvanje MET, ATM, FGFR2 in HER2 ocenili na vsaki biopsijo. Posamezni rezultati za vsako biomarker bila dana vsakemu biopsijo (slika 1)

Po MetMab sojenja v GC (NCT01662869), za MET IHC barvanja, je biopsija kaže IHK 3+ opredeljena kot pozitivna.; za FISH MET, biopsija kaže Met
gene povprečno izvod število ≥ 5 je opredeljena kot pozitivna. Ker je v teku sojenja za drugega zaviralca MET, AZD6094 (NCT02449551), uporaba Met
število genov povprečna kopija ≥ 4, ko je prekinil za enkratno kraku sredstvo za bolnike GC, smo nadalje razdelili MET FISH negativno skupino na dva dela podskupine ( Met
gene povprečno kopija število ≥ 4 in < 5 in Met
gene povprečno število <copy; 4). Za ATM IHC barvanjem, je biopsija kaže IHC 0 definirana kot negativna po Olaparib sojenja (NCT01063517). Za FGFR2 FISH, biopsija kaže FGFR2
pomnožitev gena (povprečno kopija število ≥ 6), ki je opredeljena kot pozitivna po preskušanj AZD4547 (NCT01457846) in dovitinib (NCT01719549). Za HER2, biopsija kaže HER2 IHK 3+ ali HER2 IHC 2+ plus HER2
pomnožitev gena je opredeljena kot pozitivna po Toga sojenja (NCT01041404).

Za MET IHC, FISH MET, FGFR2 FISH in HER2, primeri s koli
od biopsije, ki kažejo pozitivni so opredeljene kot pozitivnih primerov. Za ATM IHC barvanja, so primeri z vsemi biopsije, ki kažejo negativno opredeljen kot negativnih primerov

Raznovrstnost stopnja ocena

Po pregledu patologa je, stopnja biomarkerjev heterogenosti je bila določena v skladu z naslednjimi merili:.

Visoka heterogenost: < 25% biopsij z MET IHK 3+, Met
pomnožitev gena, ATM IHC 0, FGFR2
pomnožitev gena, ali HER2 pozitivnost

Srednje heterogenost. 25% ~ 50% biopsij z MET IHK 3+, Met
pomnožitev gena, ATM IHC 0, FGFR2
pomnožitev gena, ali HER2 pozitivnost

Nizka heterogenost. ≥50% biopsije z MET IHK 3+, Met
pomnožitev gena, ATM IHC 0, FGFR2
pomnožitev gena, ali HER2 pozitivnost.

Za MET IHC, FISH MET, FGFR2 FISH in HER2 pozitivnost so bili izračunani povprečni odstotek pozitivnih biopsije v posameznem primeru med pozitivnih primerov. Za bila izračunana ATM IHC, povprečni odstotek ATM IHC negativnih biopsije v konkretnem primeru med primerih z vsaj eno ATM negativno biopsijo. 95% intervala zaupanja zgoraj navedenih povprečnih vrednosti ocenil metodo vezanja.

lažno negativnih tveganje pri odkrivanju
ocena

Za vsako biomarkerjev in vnaprej določeno število biopsij n
(0 <n < največje število biopsij iz vzorca), vse možne scenarije izberete n
biopsije iz vsakega vzorca in odločanju o statusu biomarkerjev za vzorec, ki temelji na n
izbrane biopsije so računsko ustvarili.

na podlagi scenarijev zgoraj naštetih, smo ocenili nevarnost lažnih negativnih rezultatov odkrivanja. Za MET IHC, FISH MET, FGFR2 FISH in HER2 pozitivnosti, tveganje za lažno negativnega zaznavanja s n
biopsije iz vsakega vzorca je bila opredeljena kot pričakovano število razmerja med številom pozitivnih vzorcev, ki so negativni Rezultati za odkrivanje z n
biopsije in celotnega števila pozitivnih vzorcev. Za ATM IHC, lažno negativnega tveganja pri odkrivanju s n
biopsije iz vsakega vzorca je bila opredeljena kot pričakovano vrednost razmerja med številom brez negativnih vzorcev z vsemi negativnimi biopsije s n
biopsije iz vsakega vzorca, in skupnim številom ATM brez negativnih vzorcev.

Vsi izračuni so bili natančni, razen ATM IHC z eno biopsijo iz vsakega vzorca zaradi izredno velikega števila možnih scenarijev. Za ATM IHC z eno biopsijo iz vsakega vzorca, je tveganje za lažno negativnega zaznavanja smo ocenili tako, da naključni podskupino 30 brez negativnih vzorcev brez zamenjave v času, računalništvo nevarnost lažnih negativnih rezultatov odkrivanja v podskupini, ponovimo postopek 22.000 krat in pri tem v povprečju tveganj lažno negativnega zaznavanja od 22.000 naključnih setih. Poleg tega so poročali o 95% interval zaupanja z dne te ocenjene nevarnosti.

Rezultati

Pregled GC številk biopsijo v kliničnih vzorcih

V tej kohorti, število biopsijo vzorci iz posameznega bolnika v razponu od 1 do 9, z mediano obeh skupaj in pozitivne biopsije (z tumorskih celic) na 4. pozitivni biopsije številke so nekoliko nižji od skupnih biopsije številk. Primeri s 3 ~ 4 in 5 ~ 6 pozitivnih biopsije znašal 47% oziroma za 25% vseh zbranih vzorcev (slika 2).

heterogenost stopnja in lažna negativna ocena

V 18 MET IHC pozitivni primeri (slika 3A), 61% primerov je pokazala nizko heterogenost, medtem ko je 33%, je pokazala, srednjih in 5,5%, so pokazali veliko heterogenost. Povprečni odstotek MET, pozitivnih biopsije v konkretnem primeru med temi 18 pozitivnih primerov je bila 65,78% (95% IZ: 52,14% -79,60%). Lažna negativna stopnja odkrivanja MET je bila ocenjena na približno 3,39% s 4 biopsije in se približal 0% pri vzorčenju 6 biopsije (slika 4a).

V 13 MET, RIB pozitivnih primerov (slika 3B), 77% od primeri pokazala nizko heterogenost, medtem ko 15% pokazala srednji in 8% pokazala veliko heterogenost. Povprečni odstotek RIB MET pozitivnih biopsije v konkretnem primeru med temi 13 pozitivnih primerov je bila 74,05% (95% IZ: 57,53% -89,10%). lažna negativna stopnja odkrivanja FISH MET je bila ocenjena na približno 3,30% s 4 biopsije in se približal 0% pri vzorčenju 7 biopsije (slika 4b). Poleg tega je bilo ugotovljeno, značilna korelacija med oceno MET IHC in se srečal rezultate FISH (p < 0,01, κ = 0,62, Fisherjev natančni test)

V 58 primerih z vsaj eno ATM negativno biopsijo (slika 3C) 62% primerov je pokazala nizko heterogenost, medtem ko je 35%, je pokazala, srednjih in 3,6%, so pokazali veliko heterogenost. Povprečni odstotek ATM IHC negativnih biopsije v konkretnem primeru med teh 58 primerih je bila 63,07% (95% IZ: 54,93% -71,39%). Lažna negativna stopnja odkrivanja ATM IHC je bila ocenjena na približno 0,19% s 4 biopsije, in s 5 biopsije (slika 4c) približal 0%.

V 9 FGFR2 RIB pozitivnih primerov, 56% primerov je pokazala nizko heterogenost, medtem ko 33% pokazala srednje- in 11% pokazala veliko heterogenost (slika 3D). Povprečni odstotek FGFR2 RIB pozitivnih biopsije v konkretnem primeru med temi 9 pozitivnih primerov je bila 56,30% (95% IZ: 36,85% -76,85%). FGFR2 FISH lažna negativna stopnja odkrivanja je bila ocenjena na približno 3,70% s 4 biopsije in s 6 biopsije (slika 4D) približal 0%.

V 32 HER2 pozitivnih primerov, 78% primerov je pokazala nizko heterogenost, medtem ko 22% pokazala mediju heterogenost in nobeden od primerov je pokazala veliko heterogenost (Slika 3E). Povprečni odstotek HER2 pozitivnih biopsije v konkretnem primeru med temi 32 pozitivnih primerov je bila 75,16% (95% IZ: 65,88% -85,11%). Lažna negativna stopnja odkrivanja HER2 je bila ocenjena na približno 0,21% s 4 biopsije in s 5 biopsije (slika 4e) približal 0%.

Pogovor
je

znotraj protitumorski biomarkerjev heterogenost že dolgo vprašanje pri izbiri bolnikov za klinična preskušanja, in zato je razumevanje tumorja heterogenost je ključnega pomena za uspešno izvajanje prilagojenega biomarkerjev (PHB), strategijo za zdravstveno varstvo. Vendar so le malo študij doslej obravnavala to težavo in ni standardiziran strategija merjenje stopnje tumorja heterogenosti. V tej študiji smo nov pristop s štetjem vsak posamezni biopsijo in izračunu stopnje heterogenosti v vsakem primeru. Naši rezultati so pokazali, da so bile visoke stopnje heterogenosti najti le v 0 ~ 11% pozitiven (ali negativna ATM) primerih, medtem ko je večina pozitivnih primerov (56% ~ 78%) je pokazala nizko heterogenost, kar kaže na relativno nizko raven heterogenosti za naši izbrani biomarkerjev v tej kohorti primerov GC.

Poleg tega smo izvedli tudi lažno negativne ocene za vsako biomarker bi ocenili lažno negativne stopnje, povezane z zbiranjem različnih število biopsij. Rezultati so pokazali, da ko so bili zbrani 3 ali več biopsije, so lažno negativna tveganja blizu 5% vseh testiranih biomarkerjev (7,14%, 5,16%, 0,86% in 1,41% za MET IHC, FISH MET, ATM IHC in HER2 ). Ta številka (3-4 biopsije) je približno enako povprečno število biopsij, zbranih v klinični praksi za to kohorte in kot tak, kaže na relativno nizko lažno negativnih tveganj, povezanih s temi biomarkerjev v našem kohorti. Izjema, ki FGFR2 FISH pokazala višjo lažno negativno stopnjo (12,2% lažno negativni mere za 3 biopsije), bi lahko zaradi omejene velikosti vzorca FGFR2 pozitivni (9 pozitivnih vzorcev). Ko so skupaj 6 biopsije zbrane iz enega bolnika, lažna negativna tveganja za MET, ATM, FGFR2 in HER2 v tej kohorti približal 0%. Ti rezultati so primer, kako povečati biopsijo številke bi lahko uporabili za reševanje izziva biomarkerjev heterogenosti pri uvajanju kliničnih izbor pristopov bolnikov.

Glede na pomembnost natančnega izbora bolnikov v kliničnih preskušanjih, verjamemo, da ustrezno obravnavo biomarkerjev heterogenost je ključnega pomena za uspeh. Na primer, MetMab pokazala pomembno izboljšanje v preživetja brez napredovanja bolezni (2,9 v primerjavi z 1,5 mesecev) in celokupno preživetje (12,6 v primerjavi s 3,8 mesecev) [27] v 2. faze sojenja (NCT01590719) pa je to izboljšanje ni uspešno prenesli nastavitvi 3. faze (NCT01662869). Predvsem je bil MET protein prekomerno (z imunohistokemijo) izbrana kot bolnik izbirnih meril [28]. Čeprav je še vedno vprašanje razprave, je možno, da je bila obljuba MetMab v fazi 2 vendar je njegova napaka v fazi 3 vsaj deloma posledica tumorja heterogenosti in nezmožnost strategije za izbiro bolnika (IHK) odločneje obravnavati izziv znotraj tumorskemu heterogenosti v GC.

na koncu smo primerjali tudi stopnja pozitivnosti (ali mero negativnosti za upravljanje zračnega prometa) od biomarkerjev odkritih v tej kohorti biopsijo vzorcev s kirurškim vzorcev iz naših predhodnih študijah ( tabela 1). Z izjemo ATM, sta bila biopsija in kirurški vzorci odvzeti iz iste lokalne bolnišnice. Rezultati so pokazali, da je (so stopnje negativnosti so za ATM nižje), čeprav so stopnje pozitivnosti višje v biopsijo vzorcev, so bili skupni rezultati v biopsijo vzorcih podobna kirurških vzorcev. To povečanje stopnje pozitivnosti (ali zmanjša stopnjo negativnosti za ATM) je verjetno mogoče pojasniti z odkrivanjem pozitivnih primerov uporabe več biopsije, ki niso bili doseženi z uporabo prejšnje strategije vzorčenja (tj. Kirurški resekciji).

Če povzamemo, to študija je obravnavala vprašanja tumorja heterogenosti z inovativnim kota s pomočjo biopsije kot pristop za vzorčenje tumorja in daje posameznim biomarkerjev ocene za vsako biopsijo. Naši rezultati kažejo relativno nizko raven heterogenosti čez biomarkerjev analiziranih v tej kohorti. Vendar pa se lahko stopnja heterogenosti znotraj drugih skupin bolnikov, je drugačen in ga je treba analizirati za vsak primer posebej. Poleg tega naši rezultati so pokazali zmanjšanje stopnje lažnih negativnih rezultatov odkrivanja, ki ustreza s povečanjem števila biopsije vseh biomarkerjev testiranih tukaj, kar kaže na korist večkratnega vzorčenja biopsijo in služi kot primer za reševanje znotraj tumoralne heterogenost s statističnimi metodami.

Priznanja

zahvaljujemo družbo AstraZeneca, za sponzoriranje to študijo.

• Plos ONE: Visoka Raznolikost Vaca cagA Helicobacter pylori genotipov pri bolnikih z in brez želodca raka
• Plos ONE: In vitro Karakterizacija hitrega citotoksičnosti proti raku peptid HPRP-A2 skozi membranski uničevanje in celično mehanizma proti želodca rakave celične linije