PLoS ONE: Intra-Опухолевый Неоднородность HER2, FGFR2, CMET и ATM в рака желудка: Оптимизация персонализированное здравоохранение за счет инновационного патологической и статистический анализ

Абстрактный
<р> В настоящее время усилия по разработке лекарств на рак желудка направлены против нескольких молекулярных мишеней стимулирует рост этого новообразования. Intra-опухолевое биомаркером гетерогенность однако, обычно наблюдается при раке желудка, может привести к необъективной отбора пациентов. MET, ATM, FGFR2 и HER2 были профилированные на образцах биопсии рака желудка. Инновационная патологическая оценка была проведена через озвучивание отдельных биопсий против целых биопсий от одного пациента, чтобы дать оценку гетерогенности. Вслед за этим, были оценены ложные негативные риски для каждого биомаркера в силикомарганца
. 166 случаев заболевания раком желудка с множественными биопсий из отдельных пациентов были собраны из Шанхая Ренджи больницы. Следуя заранее установленным критериям, 56 ~ 78% случаев показали низкий, 15 ~ 35% показали средний и 0 ~ 11% показали высокую гетерогенность в пределах биомаркеров профилированных. Если 3 биопсий были собраны из одного пациента, ложный отрицательный риск для обнаружения биомаркеров была близка к 5% (за исключением для FGFR2: 12,2%). Когда было собрано 6 биопсий, ложный отрицательный риск приблизился к 0%. Наше исследование демонстрирует пользу выборки множественной биопсии при рассмотрении вопроса о персонализированных стратегии здравоохранения биомаркеров, и представляет собой пример для решения проблемы внутри опухолевого биомаркера гетерогенности использования альтернативных патологическую оценки и статистические методы
<р> Образец цитирования:. Е. P, Чжан M, S Вентилятор, Чжан T, H-фу, Су X и др. (2015) Intra-Опухолевый Неоднородность HER2, FGFR2, CMET и ATM в рака желудка: Оптимизация персонализированное здравоохранение за счет инновационного патологической и статистического анализа. PLoS ONE 10 (11): e0143207. DOI: 10.1371 /journal.pone.0143207
<р> Редактор: Даниэле Generali, Instituti Ospitalieri ди Кремона, Италия
<р> Поступило: 30 июля 2015 года; Принято: 2 ноября 2015 года; Опубликовано: 20 ноября 2015
<р> Copyright: © 2015 Е. и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе
<р> Финансирование:. AstraZeneca спонсировала это исследование. Финансирующей оказывал поддержку в виде заработной платы для авторов [PY, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG и XY] и при условии установки и ресурсов для завершения этого исследования. Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе "автор вклады"
<р> Конкурирующие интересы:. Авторы аффилированных с AstraZeneca являются штатными сотрудниками и /или заинтересованные лица АстраЗенека. Это исследование было организовано AstraZeneca. Это не меняет приверженность авторов к PLoS ONE политики в отношении данных и материалов совместного использования. Авторы заявляют, что у них нет никаких других конкурирующих интересов.

Введение
<р> Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных видов рака во всем мире, причем около половины всех случаев, происходящих в Восточной Азии (в основном, Китай), и является третьей ведущей причиной связанной с раком смерти во всем мире [1]. Хотя частота снижается, в большинстве случаев GC диагностируются на продвинутой стадии и прогноз заболевания остается на низком уровне [2]. Медиана выживаемости при метастатическом GC менее чем за один год, в то время как общий показатель 5-летней выживаемости составляет менее 7% [3].
<Р> Intra-опухолевое гетерогенности обычно наблюдается в GC. В 1980-х годах, де Aretxabala и др
оценивали 222 образцов из 37 случаев GC и обнаружили смесь диплоидных и анеуплоидных образцов или различных анеуплоидных stemlines в том же случае (так называемая ДНК содержание гетерогенности) в 33% первичных опухоли [4]. Аналогичное исследование Yonemura и др
показали 69% гетерогенность на содержание ДНК в 65 образцах резецированными GC [5]. В последнее время Ян и др
оцениваемые образцы GC из 148 пациентов и обнаружили, скорость гетерогенности 79,3% в человеческий рецептор эпителиального фактора роста 2 (HER2) избыточная экспрессия белка и 44% в Her2
амплификации гена [6]. Соответственно, высокая внутри опухолевой гетерогенности наблюдается в GC, вероятно, способствовать резистентности к лечению и неблагоприятным прогнозом пациентов [7, 8], и в конечном счете представляет собой значительную проблему безадресных, с которыми сталкиваются врачи, патологоанатомы и исследователей.
<Р> Несколько молекулярных мишеней в настоящее время имеется в либо утвержденных медикаментозного лечения или перспективных терапевтических средств, проходящих клинические разработки в GC. HER2 играет важную роль в онкогенеза рака молочной железы, рака яичников и рака желудка [9] и трастузумаб, моноклональное антитело против HER2, был одобрен для лечения GC [10]. Ген мезенхимальных-эпителиального фактора перехода (МЕТ) кодирует белок, который является единственным известным рецептором для фактора роста гепатоцитов (HGF) лиганда [11].
встретились амплификации гена и белка суперэкспрессия было показано, что приводит к постоянной активации сигнального пути MET, который способствует росту опухоли, ангиогенез и метастазирование [12]. Несколько MET ингибиторов в настоящее время проходят клинические испытания GC, в том числе Savolitinib (Phase 1 (NCT02252913) [13]) и AMG337 (фаза 2 (NCT02016534)). Аналогичным образом, фактор роста фибробластов рецептор 2 (FGFR2) также участвует в клеточной пролиферации, дифференцировки и моторики, а также амплификацию <ЕМ> Fgfr2
ген играет важную роль в онкогенеза ГК, тем самым подчеркивает ее привлекательность в качестве разработки лекарственных средств мишень [14-16]. Атаксия телеангиэктазия мутировал (ATM) является протеинкиназа принадлежащих к 3 'семейства киназ фосфатидилинозитол (PI3K), и при нормальных условиях активируется в ответ на ДНК двухцепочечной разрывы [17]. Дефицит АТМ связано с высоким уровнем заболеваемости злокачественными опухолями тканей [18-20] и ATM-дефицитных опухолей клетки чувствительны к поли (АДФ-рибоза) полимеразы-1 на ингибирование (ППА), потенциальной мишенью, который был предложен для лечения GC в нескольких предыдущих исследованиях [21-24]. Lynparza, первый американский и европейский одобренный ингибитор PARP ориентации BRCA1 /2 мутантный рака яичников, в настоящее время проходит III фазы клинических испытаний в GC (NCT01924533) и применяя пациента выбора биомаркеров подход с использованием выражения ATM с помощью IHC (публикации в прессе) .
<р> в нынешнюю эпоху целенаправленного развития молекулярно наркотиков, биомаркеры, как ожидается, точно предсказать клинический ответ [25]. Высокая гетерогенность опухоли, однако, может привести к смещению обнаружения биомаркеров, если образцы получены из небольшой области опухоли, а не опухолевой ткани в целом (например, хирургически удаленных образцов, как правило, только 2 см х 2 см). В отличие от этого, образцы биопсии, как правило, получают из разных областей всей опухоли и, вероятно, будут более репрезентативными общего состояния экспрессии биомаркеров пациентов, доводы в пользу их потенциал, чтобы уменьшить влияние внутри опухолевой гетерогенности по смещению выбора пациента.

в нашем исследовании, для того, чтобы лучше оценить внутри опухолевой гетерогенности, мы использовали в качестве хирургической биопсии нашей стратегии выборки опухоли. Кроме того, мы провели оценку инновационной патологическую через озвучивание отдельных биопсий против целых биопсий отдельных пациентов. Здесь мы также использовали статистические методы для оценки ложноотрицательных риска обнаружения при анализе конечных числа биопсий для того, чтобы понять взаимосвязь между количеством биопсий и риск выбора ложноположительную пациента для конкретного лечения или включения в клиническом испытании .

материалы и методы

информация для пациентов
<р> образцы биопсии GC архивации были собраны от 166 пациентов, которые получали гастроскопия обследование с несколькими биопсий из различных опухолевых областей каждого пациента в период между 2007 и 2014 в Renji больнице, Шанхай, Китай. Предварительное письменное информированное согласие было получено от всех пациентов и протокол исследования был одобрен Институциональным наблюдательным советом Ренджи больницы. Все образцы были рассмотрены два подготовленных патологоанатомами для диагностики GC и сорок образцов были исключены в исследовании из-за плохого качества ткани.

иммуногистохимии (IHC)

Фиксированные в формалине и залитых парафином (FFPE) образцы рассекают при толщине 4 мкм. Для MET окрашивания использовали кроликом моноклональное анти-MET общее антитело (CMET SP44, Ventana Medical Systems, AZ, США) и анализ проводили на автоматическом ситечко (Discovery XT, Ventana Medical Systems, Аризона, США). Окрашивание ATM проводили с использованием кролика моноклональных анти-ATM антитела (ab32420, Abcam, MA, USA) на autostainer (Thermo Scientific, MA, USA). HER2 окрашивание проводили с использованием HercepTest набора (DAKO, Дания) в соответствии с инструкциями завода-изготовителя на автоматическом ситечко (Discovery XT, Ventana Medical Systems, Аризона, США).

Флуоресцентная гибридизация (FISH) <бр> <р> FISH анализ двухцветными проводили, как описано ранее [26]. HER2 /CEP17
зонды были приобретены у Vysis (Иллинойс, США;. Cat-171060). MET
и Fgfr2
зонды были получены этикетирование BAC (ДСТ-2270N20 и RP11-62L18, соответственно) ДНК с красно-дУТФ (Enzo Biochem, штат Нью-Йорк, США;. CatN;23- 050), CEP10
-спектра Зеленый и CEP7
-спектра Зеленые зонды были приобретены у Vysis (Cat. -112010 и 32-132007 #, соответственно) и используемые в качестве внутреннего контроля для FGFR2
и Met
зонды

оценка Патология на биопсий
<р> на основе H &усилителя;. E окрашивание, каждая биопсия с адекватными опухолевыми клетками (более 50 опухолевые клетки) впервые был отмечен патологоанатомом. Затем оценивали состояние биомаркеров, включая IHC и FISH окрашивания MET, ATM, FGFR2 и HER2 на каждой биопсии. Индивидуальные оценки для каждого биомаркера были даны каждой биопсии (рис 1)
<р> Согласно MetMab испытания в ГК (NCT01662869), для MET IHC окрашивания, биопсия показывает IHC 3+ определяется как положительная. для MET FISH, биопсия показывает Met
гена в среднем число копий ≥ 5 определяется как положительная. Так как текущего судебного процесса для другого ингибитора MET, AZD6094 (NCT02449551), использует Met
количество генов в среднем копия ≥ 4, как оторваны от одного плеча обрабатывающего агента на пациентах GC, далее мы разделили MET FISH отрицательную группу на две части подгруппы ( Met
гена в среднем число копий ≥ 4 и &л; 5, и Met
гена в среднем количество копий &л; 4). Для ATM IHC окрашивания, биопсия показывает IHC 0 определяется как отрицательный согласно Olaparib испытания (NCT01063517). Для FGFR2 FISH, биопсия показывает Fgfr2
амплификации гена (среднее число копий ≥ 6) определяется как положительная согласно испытаний AZD4547 (NCT01457846) и dovitinib (NCT01719549). Для HER2, биопсия показывает HER2 IHC 3+ или HER2 IHC 2+ плюс Her2
амплификации гена определяется как положительная согласно ToGA проб (NCT01041404).
<Р> Для MET IHC, Met рыба, FGFR2 FISH и HER2, случаи с любой
биопсий, показывающих положительное определяются как положительных случаев. Для ATM IHC окрашивания, случаи со всеми биопсий, показывая отрицательный определяются как отрицательные случаи

Неоднородность степени оценка
<р> После обзора патологоанатома, степень неоднородности биомаркеров была определена в соответствии со следующими критериями:.
<р> Высокая гетерогенность: &л; 25% биопсий с MET IHC 3+, Met
амплификации гена, ATM IHC 0, Fgfr2
амплификации гена, или HER2 положительность
<р> Средняя гетерогенность:. 25% ~ 50% биопсий с MET IHC 3+, Met
амплификации гена, ATM IHC 0, Fgfr2
амплификации гена, или HER2 положительность
<р> Низкая гетерогенность:. ≥50% биопсия с MET IHC 3+, Met
амплификации гена, ATM IHC 0, Fgfr2
амплификации гена, или HER2 позитивности.
<р> Для MET IHC, FISH MET, FGFR2 FISH и HER2 положительность, были рассчитаны средние проценты положительных биопсий в индивидуальном случае среди положительных случаев. Для рассчитывалась банкомата ВВК, средний процент АТМ IHC отрицательных биопсий в конкретном случае, среди случаев по меньшей мере одним ATM отрицательной биопсии. 95% доверительные интервалы указанных выше средних значений были оценены самонастройки.

Ложноотрицательный риск необнаружения оценка
<р> Для каждого биомаркером и заданное число биопсий п
(0 &л; п &л; максимальное число биопсий из образца), все возможные сценарии выбора п
биопсию из каждого образца и сделать определение статуса биомаркеров для образца на основе п
выбранные биопсий были получены в вычислительном отношении.
<р> на основе сценариев, перечисленных выше, были оценены риски ложного отрицательного обнаружения. Для MET IHC, Met рыба, рыба, FGFR2 и HER2 позитивности, риск ложного отрицательного обнаружения с п
биопсий из каждого образца определяется как ожидаемое число соотношения между числом положительных образцов, которые имеют отрицательный результаты обнаружения с помощью п
биопсий и общее количество положительных образцов. Для ATM IHC, ложного отрицательного риска обнаружения с п
биопсий из каждого образца определяется как ожидаемое значение соотношения между числом неотрицательных образцов со всеми отрицательными биопсий с п
биопсий из каждого образца, а общее количество банкоматов неотрицательных образцов.
<р> Все вычисления были точными, за исключением ATM IHC с одной биопсии из каждого образца из-за чрезвычайно большого числа возможных сценариев. Для ATM IHC с одной биопсии из каждого образца, риск ложного отрицательного обнаружения оценивалась путем принимать случайное подмножество 30 неотрицательных образцов без замены в то время, вычисления риска ложного отрицательного обнаружения в подмножестве, повторяя процесс 22000 раз и принимая в среднем рисков ложного отрицательного обнаружения от 22000 случайных подмножеств. Кроме того, сообщалось, 95% доверительный интервал этого предполагаемого риска.

Результаты

Обзор номеров биопсии GC в клинических образцах
<р> В этой когорте, количество биопсии образцы из одного пациента в диапазоне от 1 до 9, с медианой обоих полных и положительных биопсий (с опухолевыми клетками) на 4. положительные биопсии оказались несколько меньше общей биопсии чисел. Случаи с 3 ~ 4 и 5 ~ 6 положительных биопсий составили 47% и 25% соответственно от всех собранных образцов (рис 2).

степень Неоднородность и ложноотрицательный
оценка <р> В 18 МЕТ IHC положительных случаев (рис 3, а), 61% случаев показали низкую гетерогенность, в то время как 33% показали средний и 5,5% показали высокую гетерогенность. Средний процент МЕТ положительных биопсий в каждом конкретном случае среди этих 18 положительных случаев было 65,78% (95% ДИ: 52,14% -79,60%). Частота ложных обнаружение отрицательных MET оценивался на уровне около 3,39% с 4 биопсий и приблизилась к 0% при отборе проб 6 биопсий (рис 4а)
. <Р> В 13 МЕТ FISH положительных случаев (рис 3B), 77% случаи показали низкую гетерогенность, в то время как 15% показали средний и 8% показали высокую гетерогенность. Средний процент MET FISH положительных биопсий в каждом конкретном случае среди этих 13 положительных случаев было 74,05% (95% ДИ: 57,53% -89,10%). Частота ложных обнаружения отрицательного MET FISH оценивается на уровне около 3,30% с 4 биопсий и приблизилась к 0% при отборе проб 7 биопсий (рис 4В). Кроме того, значительная корреляция между MET IHC балла и результатов FISH МЕТ (р &л; 0,01, κ = 0,62, точный критерий Фишера)
<р> В 58 случаях, по крайней мере, один ATM отрицательной биопсии (рис 3C) , 62% случаев показали низкую гетерогенность, в то время как 35% показали средний и 3,6% показали высокую гетерогенность. Средний процент ATM IHC отрицательных биопсий в конкретном случае, среди тех 58 случаев было 63,07% (95% ДИ: 54,93% -71,39%). Частота ложных обнаружение отрицательных ATM IHC оценивался на уровне около 0,19% с 4 биопсий, и приблизилась к 0% с 5 биопсий (рис 4в).
<Р> В 9 FGFR2 FISH положительных случаев, 56% случаев показали низкий неоднородность, в то время как 33% показали средний и 11% показали высокую гетерогенность (рис 3D). Средний процент FGFR2 FISH положительных биопсий в каждом конкретном случае среди этих 9 положительных случаев было 56,30% (95% ДИ: 36,85% -76,85%). FGFR2 FISH ложных обнаружения отрицательной оценивался на уровне около 3,70% с 4 биопсий и приблизилась к 0% с 6 биопсий (рис 4D)
.

В 32 HER2 положительных случаев, 78% случаев показали низкую гетерогенность, в то время как 22% показали среднюю гетерогенность и ни один из случаев не показали высокую гетерогенность (рис 3E). Средний процент HER2 положительных биопсий в каждом конкретном случае среди этих 32 положительных случаев было 75,16% (95% ДИ: 65,88% -85,11%). Частота ложных обнаружение отрицательных HER2 оценивался на уровне около 0,21% с 4 биопсий и приблизилась к 0% с 5 биопсий (рис 4д).

Обсуждение
<р> Intra-опухолевое биомаркером гетерогенность уже давно является проблемой при отборе пациентов для клинических испытаний и поэтому, понимание опухолевой гетерогенности имеет решающее значение для успешного внедрения персонифицированного здравоохранения биомаркеров (ПГБ) стратегии. Тем не менее, несколько исследований до сих пор решили эту проблему, и не существует стандартизированной стратегии в измерении степени опухолевой гетерогенности. В данном исследовании мы взяли новый подход, забив каждой отдельной биопсии и расчета уровня гетерогенности в пределах каждого конкретного случая. Наши результаты показали, что высокие уровни неоднородности были обнаружены только в 0 ~ 11% положительный (или отрицательный для ATM) случаев, в то время как большинство положительных случаев (56% ~ 78%) показали низкую гетерогенность, что указывает на относительно низкий уровень неоднородности для наши выбранные биомаркеры в этой группе случаев GC.
<р> Кроме того, мы также провели ложные негативные оценки для каждого биомаркеров для оценки ложных отрицательных ставок, связанных со сбором различного количества биопсий. Результаты показали, что, когда было собрано 3 или более биопсий, ложные негативные риски были близки к 5% для всех протестированных биомаркеров (7,14%, 5,16%, 0,86% и 1,41% соответственно для MET IHC, Met FISH, ATM IHC и HER2 ). Это число (3-4 биопсий) примерно соответствует среднему числу биопсий, собранных в клинической практике для этой когорте и, как таковые, указывает на относительно низкую ложноотрицательный риск, связанный с этими биомаркеров в когорте. Единственным исключением, что FGFR2 FISH показали более высокую ложную отрицательную скорость (12,2% ложноотрицательный скорости на 3 биопсий), может быть из-за ограниченного размера выборки FGFR2-положительных (9 положительных образцов). Когда в общей сложности 6 биопсий были собраны из одного пациента, ложный отрицательный риск MET, ATM, FGFR2 и HER2 приблизилась 0% в этой группе. Эти результаты дают пример того, как увеличение числа биопсии могут быть использованы для решения проблемы биомаркеров гетерогенности при развертывании клинических пациентов подходы выбора.
<Р> Учитывая важность точного отбора пациентов в клинических испытаниях, мы твердо убеждены в том, что надлежащим образом решить биомаркером гетерогенность имеет решающее значение для успеха. Например, MetMab показали значительное улучшение как выживаемость без прогрессирования (2,9 против прогноза 1,5 месяцев) и общей выживаемости (12,6 против 3,8 месяцев) [27] в фазе 2 исследования (NCT01590719), однако, это улучшение не успешно клонировать к установке 3 фазы (NCT01662869). Следует отметить, что белок МЕТ избыточная экспрессия (по IHC) была выбрана в качестве критериев отбора пациентов [28]. Хотя еще вопрос дебатов, вполне возможно, что обещание MetMab в фазе 2, но его провал в фазе 3 была, по меньшей мере, частично является следствием опухоли неоднородности, а также неспособность стратегии выбора пациента (IHC), чтобы решительно выступить перед вызов внутри опухолевой гетерогенности в GC.
<р> Наконец, мы также сравнили скорость положительность (или отрицательность скорости для ATM) из биомаркеров, обнаруженных в этой когорте биопсии образцов с хирургических образцов из наших предыдущих исследований ( Таблица 1). За исключением банкомата, как биопсия и хирургические образцы были собраны из той же местной больницы. Результаты показали, что хотя уровень позитивности выше (для ATM, уровень негативности ниже) в образцах биопсии, общие результаты в образцах биопсии были похожи на хирургические образцов. Это увеличение скорости положительности (или уменьшение скорости негатива для ATM), вероятно, объясняется обнаружением положительных случаев с использованием нескольких биопсий, которые были пропущены с использованием предыдущих стратегий для взятия проб (то есть. Хирургических резекций).
<Р> Взятые вместе, это исследование обратилась с проблемой опухоли гетерогенности от инновационного угла с помощью биопсий в качестве подхода выборки опухоли и давать индивидуальные биомаркеров баллов для каждой биопсии. Наши результаты показывают относительно низкий уровень неоднородности через биомаркеров анализируемых в этой когорте. Тем не менее, степень неоднородности в других когорт пациентов могут быть различными и должны быть проанализированы на основе случая к случаю. Кроме того, полученные нами результаты показали уменьшение скорости ложноотрицательных обнаружения соответствующего с увеличением числа биопсии для всех биомаркеров, протестированных в настоящем документе, демонстрируя преимущество выборки множественной биопсией и служащий в качестве примера адресации внутри опухолевую гетерогенность с использованием статистических методов.

Выражение признательности
<р> Мы благодарим AstraZeneca за организацию этого исследования.

• PLoS ONE: высокое разнообразие Вака и CagA Helicobacter Pylori генотипов у больных с и без Желудочный Cancer
• PLoS ONE: В пробирке Характеристика быстрого цитотоксичности противоракового пептидных HPRP-A2 через мембрану разр…