PLoS ONE: intratumoral Uensartede regler om HER2, FGFR2, cMET og ATM i Gastric Cancer: Optimering Personlig Healthcare gennem Innovativ Patologisk og statistisk analyse

Abstrakt

Den nuværende indsats udvikling af lægemidler på mavekræft er rettet mod flere molekylære mål driver væksten i denne neoplasma. Intra-tumoral biomarkør heterogenitet dog ofte hos mavekræft, kan føre til forudindtaget udvalg af patienterne. MET, ATM, FGFR2, og HER2 blev profileret på mavekræft biopsiprøver. En innovativ patologisk evaluering blev udført ved scoring af individuelle biopsier mod hele biopsier fra en enkelt patient for at aktivere heterogenitet evaluering. Herefter blev falsk negative risici for hver biomarkør anslået i silico
. 166 gastrisk kræfttilfælde med flere biopsier fra enkelte patienter blev indsamlet fra Shanghai Renji Hospital. Efter forud fastsatte kriterier, viste 56 ~ 78% tilfælde lav, 15 ~ 35% viste medium og 0 ~ 11% viste høj heterogenitet inden for de biomarkører profilerede. Hvis 3 biopsier blev indsamlet fra en enkelt patient, den falske negative risiko for detektion af biomarkører var tæt på 5% (undtagelse for FGFR2: 12,2%). Når 6 biopsier blev indsamlet, den falske negative risiko nærmede 0%. Vores undersøgelse viser fordelen ved prøveudtagning flere biopsi, når de overvejer personlig sundhedspleje biomarkør strategi, og giver et eksempel for at løse udfordringen med intratumoral biomarkør heterogenitet hjælp alternativ patologisk vurdering og statistiske metoder

Henvisning:. Ye P, Zhang M, Fan S, Zhang T, Fu H, Su X, et al. (2015) intratumoral Uensartede regler om HER2, FGFR2, cMET og ATM i Gastric Cancer: Optimering Personlig Healthcare gennem Innovativ Patologisk og statistisk analyse. PLoS ONE 10 (11): e0143207. doi: 10,1371 /journal.pone.0143207

Redaktør: Daniele Generali, Instituti Ospitalieri di Cremona, Italien

Modtaget: 30 juli, 2015; Accepteret: November 2, 2015; Udgivet: 20. november 2015

Copyright: © 2015 Ye et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. AstraZeneca har sponsoreret denne undersøgelse. Den bidragyder ydet støtte i form af løn til forfattere [PY, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG og XY] og forudsat facilitet og ressourcer til at fuldføre denne undersøgelse. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i afsnittet "forfatter bidrag"

Konkurrerende interesser:. Forfattere tilknyttet AstraZeneca er fuldtidsansatte og /eller interessenter AstraZeneca. Denne undersøgelse blev sponsoreret af AstraZeneca. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Forfatterne erklærer, at de ikke har andre konkurrerende interesser.

Introduktion

mavekræft (GC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden, med omkring halvdelen af ​​alle tilfælde, der opstår i det østlige Asien (primært Kina), og er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Selvom forekomsten er faldende, er de fleste GC tilfælde diagnosticeret på et fremskredent stadium og prognose af sygdommen forbliver fattige [2]. Den mediane overlevelse for metastatisk GC er mindre end et år, mens den samlede 5-års overlevelse er mindre end 7% [3].

Intra-tumoral heterogenitet er almindeligt observeret i GC. I 1980'erne, de Aretxabala et al
evalueret 222 prøver fra 37 GC sager og fundet en blanding af diploide og aneuploide prøver eller forskellige aneuploide stemlines i samme sag (såkaldt indhold DNA heterogenitet) i 33% af den primære tumorer [4]. En lignende undersøgelse fra Yonemura et al
viste en 69% DNA-indhold heterogenitet i 65 resektion GC prøver [5]. For nylig, Yang et al
evalueret GC prøver fra 148 patienter og fundet en heterogenitet på 79,3% i human epitelial vækstfaktor receptor 2 (HER2) protein overekspression og 44% i HER2
genamplifikation [6]. Derfor den høje intratumoral heterogenitet observeret i GC er sandsynligvis bidrage til behandling modstand og dårligere patient prognose [7, 8], og i sidste ende udgør en betydelig adresseløse problem af klinikere, patologer og forskere står.

Adskillige molekylære mål i øjeblikket har i enten godkendte medicinske behandlingsmetoder eller lovende lægemidler undergår klinisk udvikling i GC. HER2 spiller vigtige roller i tumorigenese af brystcancer, ovariecancer og gastrisk cancer [9] og Trastuzumab, et monoklonalt antistof mod HER2, er blevet godkendt til behandling af GC [10]. Den mesenchymale-epithelial overgang faktor (MET) genet koder for et protein, som er den eneste kendte receptor for hepatocytvækstfaktor (HGF) ligand [11]. MET
genamplifikation og protein overekspression har vist sig at føre til konstant aktivering af MET-signalvejen, som bidrager til tumorvækst, angiogenese og metastase [12]. Flere MET inhibitorer undergår i øjeblikket GC kliniske forsøg, inklusive Savolitinib (fase 1 (NCT02252913) [13]) og AMG337 (fase 2 (NCT02016534)). Tilsvarende er fibroblastvækstfaktorreceptor 2 (FGFR2) også impliceret i celleproliferation, differentiering og motilitet, og amplifikation af FGFR2
gen spiller en vigtig rolle i tumorigenese af GC, hvorved understreger dens tiltrækning som lægemiddeludvikling mål [14-16]. Ataxia telangiectasia muteret (ATM) er en proteinkinase, der tilhører phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K) -familien, og under normale forhold er aktiveret i respons på DNA dobbelt-strenget pauser [17]. ATM-mangel er relateret til en høj forekomst af væv maligniteter [18-20] og ATM-deficiente tumorer celler er følsomme for poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP) inhibering, et potentielt mål, som er blevet foreslået til behandling af GC i flere tidligere undersøgelser [21-24]. Lynparza, den første amerikanske og europæiske godkendt PARP inhibitor målrettet BRCA1 /2 mutant kræft i æggestokkene, er i øjeblikket i et klinisk fase III forsøg i GC (NCT01924533) og ansætte en patient udvalg biomarkør tilgang med ATM udtryk ved IHC (offentliggørelse i pressen) .

i den nuværende æra af molekylært målrettet lægemiddeludvikling, er biomarkører forventes præcist forudsige klinisk respons [25]. Høj tumor heterogenitet kan imidlertid føre til en biomarkør detektering skævhed når de er fremstillet prøverne fra en lille tumor region i stedet for hele tumorvæv (fx kirurgisk resektion prøver er normalt 2 cm x 2 cm kun). I modsætning hertil er biopsiprøver normalt fås fra forskellige regioner i hele tumor og vil sandsynligvis være mere repræsentativ for patienternes samlede biomarkør udtryk status, argumentere for deres potentiale til at reducere virkningen af ​​intratumoral heterogenitet på patientens selektionsbias.

i vores undersøgelse, for bedre at kunne vurdere intratumoral heterogenitet, vi ansat kirurgisk biopsi som vores tumor sampling strategi. Desuden har vi udført et innovativt patologisk vurdering gennem scoring af individuelle biopsier mod hele biopsier fra enkelte patienter. Heri vi også ansat statistiske metoder til at estimere de falske risici negative detektion ved analyse finite antal biopsier for at forstå forholdet mellem antallet af biopsier og risikoen for at vælge en falsk positiv patient for en bestemt behandling eller optagelse i et klinisk forsøg .

Materialer og metoder

Patientinformation

arkiverede GC biopsi prøver blev indsamlet fra 166 patienter, som fik gastroskopi undersøgelse med flere biopsier fra forskellige tumor områder af hver patient mellem 2007 og 2014 Renji hospital, Shanghai, Kina. Forudgående skriftlig informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og forsøgsprotokollen blev godkendt af Renji Hospital Board Institutional Review. Alle prøver blev gennemgået af to trænede patologer til GC diagnose og fyrre prøver blev udelukket i undersøgelsen på grund af dårlig væv kvalitet.

immunhistokemisk (IHC)

formalin faste og paraffin indlejret (FFPE) prøver blev snittet på 4 um tykkelse. For MET-farvning, blev en kanin monoklonalt anti-total MET antistof (cMET SP44, Ventana Medical Systems, AZ, USA) anvendt, og assayet blev udført på en automatisk farvningsværktøjet (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA). ATM-farvning blev udført under anvendelse af et kanin monoklonalt anti-ATM-antistof (ab32420, Abcam, MA, USA) på en automatiske farvningsanordning (Thermo Scientific, MA, USA). HER2-farvning blev udført under anvendelse af HercepTest kit (DAKO, Danmark) ifølge producentens instruktioner på et automatisk farvningsværktøjet (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA).

Fluorescens in situ hybridisering (FISH)

Den tofarvede FISH-assayet blev udført som tidligere beskrevet [26]. HER2 /CEP17
sonder blev købt fra Vysis (IL, USA;. Cat-171.060). MET
og FGFR2
sonder fremstilles ved mærkning BAC (CTD-2270N20 og RP11-62L18 henholdsvis) DNA med rød-dUTP (Enzo Biochem, NY, USA;. CatN;23- 050), CEP10
spektrets Grøn og CEP7
spektrets Grønne sonder blev købt fra Vysis (Kat. -112.010 og til 132.007, henholdsvis) og anvendes som interne kontroller for FGFR2
MET
sonder

Patologi vurdering af biopsier

Baseret på H &. E farvning, hver biopsi med passende tumorceller (mere end 50 tumorceller) blev først præget af en patolog. Så biomarkør status, herunder IHC og FISH farvning af MET, ATM, FGFR2 og HER2 blev evalueret på hver biopsi. Individuelle scores for hver biomarkør blev givet til hver biopsi (figur 1)

Ifølge MetMab retssag i GC (NCT01662869), om markedsøkonomisk behandling IHC farvning, er en biopsi viser IHC 3+ defineret som positiv.; for MET FISH, biopsi viser MET
gen gennemsnitlige antal kopier ≥ 5 er defineret som positiv. Da den igangværende retssag for en anden MET-hæmmer, AZD6094 (NCT02449551), anvendelser MET
gen gennemsnitlige antal kopier ≥ 4 som afskåret til enkeltstofbehandling behandling arm på GC patienter, vi yderligere inddelt MET FISH negative gruppe i to undergrupper ( MET
gen gennemsnitlige kopi nummer ≥ 4 og < 5, og MET
gen gennemsnitlige antal kopier < 4). For ATM IHC farvning, biopsi viser IHC 0 er defineret som negativ ifølge Olaparib forsøg (NCT01063517). For FGFR2 FISH, biopsi viser FGFR2
genamplifikation (gennemsnitlig kopi nummer ≥ 6) defineres som positiv i henhold til forsøg med AZD4547 (NCT01457846) og dovitinib (NCT01719549). For HER2, biopsi viser HER2 IHC 3+ eller HER2 IHC 2+ plus HER2
genamplifikation er defineret som positiv i henhold til ToGA forsøg (NCT01041404).

For MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH og HER2, tilfælde med nogen
af biopsier viser positive er defineret som positive tilfælde. For ATM IHC farvning, er tilfælde med alle biopsier viser negativ defineres som negative sager

Heterogenitet grad vurdering

Efter patolog gennemgang, graden af ​​biomarkør heterogenitet blev bestemt i henhold til følgende kriterier:.

høj heterogenitet: < 25% af biopsier med MET IHC 3+, MET
genamplifikation, ATM IHC 0, FGFR2
genamplifikation eller HER2 positivitet

Medium heterogenitet:. 25% ~ 50% af biopsier med MET IHC 3+, MET
genamplifikation, ATM IHC 0, FGFR2
genamplifikation eller HER2 positivitet

lav heterogenitet:. ≥50% biopsier med MET IHC 3+, MET
genamplifikation, ATM IHC 0, FGFR2
genamplifikation eller HER2-positivitet.

For MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH , og HER2 positivitet, de gennemsnitlige procentdele af positive biopsier i en individuel sag blandt de positive tilfælde blev beregnet. For ATM IHC, den gennemsnitlige procentdel af ATM IHC negative biopsier i det enkelte tilfælde blandt tilfælde med mindst én ATM negativ biopsi blev beregnet. intervaller De 95% tillid af ovennævnte middelværdier blev vurderet ved bootstrapping.

vurdering
Falsk negative afsløring risiko

For hver biomarkør og et foruddefineret antal biopsier n
(0 <n < maksimale antal biopsier fra en prøve), alle mulige scenarier for at vælge n
biopsier fra hver prøve og gøre en bestemmelse af biomarkør status for prøven baseret på n
udvalgte biopsier blev genereret beregningsmæssigt.

Baseret på de scenarier, opregnet ovenfor, er risikoen for falsk negative afsløring blev vurderet. For MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH, og HER2 positivitet, risikoen for falsk negative detektion med n
biopsier fra hver prøve blev defineret som det forventede antal af forholdet mellem antallet af positive prøver, der har negativ afsløring resultater med n
biopsier og det samlede antal positive prøver. For ATM IHC, den falske negative afsløring risiko med n
biopsier fra hver prøve blev defineret som den forventede værdi af forholdet mellem antallet af ikke-negative prøver med alle negative biopsier med n
biopsier fra hver prøve, og det samlede antal af ATM ikke-negative prøver.

Alle beregninger var nøjagtig undtagen ATM IHC med én biopsi fra hver prøve på grund af det ekstremt store antal mulige scenarier. For ATM IHC med én biopsi fra hver prøve, blev risikoen for falsk negative detektion estimeret ved at tage en tilfældig delmængde af 30 ikke-negative prøver uden udskiftning på et tidspunkt, beregning af risikoen for falsk negative detektion i delmængde, gentage processen 22.000 tider og tage et gennemsnit af risikoen for falsk negative afsløring fra 22.000 tilfældige delmængder. Desuden blev 95% konfidensinterval af denne anslåede risiko rapporteret.

Resultater

Oversigt over GC biopsi tal i kliniske prøver

I denne kohorte, at antallet af biopsi prøver fra en enkelt patient varierede fra 1 til 9, med medianen af ​​både totalt og positive biopsier (med tumorceller) ved 4. de positive biopsi tal var lidt mindre end de samlede biopsi numre. Tilfælde med 3 ~ 4 og 5 ~ 6 positive biopsier tegnede sig for 47% og 25% af alle de indsamlede prøver (Fig 2).

Uensartede grad og falsk negative vurdering

I 18 MET IHC positive tilfælde (fig 3A), 61% af tilfældene viste lav heterogenitet, mens 33% viste medium og 5,5% viste høj heterogenitet. Den gennemsnitlige procentdel af MET positive biopsier i det enkelte tilfælde blandt de 18 positive tilfælde var 65,78% (95% CI: 52,14% -79,60%). Den MET falsk negative opdagelse sats blev anslået til omkring 3,39% med 4 biopsier og nærmede 0% når prøvetagning 6 biopsier (Fig 4A).

I de 13 MET FISH positive tilfælde (Fig 3B), 77% af tilfælde viste lav heterogenitet, mens 15% viste medium og 8% viste høj heterogenitet. Den gennemsnitlige procentdel af MET FISH positive biopsier i det enkelte tilfælde blandt de 13 positive tilfælde var 74,05% (95% CI: 57,53% -89,10%). Den MET FISH falsk negativ opdagelse sats blev anslået til omkring 3,30% med 4 biopsier og nærmede 0% når prøvetagning 7 biopsier (Fig 4B). Desuden blev signifikant sammenhæng fundet mellem MET IHC score og MET FISH resultater (p < 0,01, κ = 0,62, Fishers eksakte test)

I de 58 tilfælde med mindst én ATM negativ biopsi (fig 3C) 62% af tilfældene viste lav heterogenitet, mens 35% viste medium og 3,6% viste høj heterogenitet. Den gennemsnitlige procentdel af ATM IHC negative biopsier i det enkelte tilfælde blandt de 58 sager var 63,07% (95% CI: 54,93% -71,39%). ATM IHC falsk negativ opdagelse sats blev anslået til omkring 0,19% med 4 biopsier, og nærmede sig 0% med 5 biopsier (Fig 4C).

I de 9 FGFR2 FISH positive tilfælde, 56% af tilfældene viste lav heterogenitet, mens 33% viste medium og 11% viste høj heterogenitet (fig 3D). Den gennemsnitlige procentdel af FGFR2 FISH positive biopsier i det enkelte tilfælde blandt de 9 positive tilfælde var 56,30% (95% CI: 36,85% -76,85%). Den FGFR2 FISH falsk negativ opdagelse sats blev anslået til omkring 3,70% med 4 biopsier og nærmede 0% med 6 biopsier (Fig 4D).

I de 32 HER2 positive tilfælde, 78% af tilfældene viste lav heterogenitet, mens 22% viste medium heterogenitet og ingen af ​​tilfældene viste høj heterogenitet (fig 3E). Den gennemsnitlige procentdel af HER2 positive biopsier i det enkelte tilfælde blandt de 32 positive tilfælde var 75,16% (95% CI: 65,88% -85,11%). HER2 falsk negative opdagelse sats blev anslået til omkring 0,21% med 4 biopsier og nærmede 0% med 5 biopsier (Fig 4E).

Diskussion

Intra-tumoral biomarkør heterogenitet har længe været et problem i udvælgelsen af ​​patienter til kliniske forsøg, og derfor, forståelse tumor heterogenitet er afgørende for en vellykket implementering af en personlig sundhedspleje biomarkør (PHB) strategi. Imidlertid har kun få undersøgelser hidtil behandlet dette problem, og der er nogen standardiseret strategi i at måle tumor heterogenitet. I denne undersøgelse fandt vi en hidtil ukendt fremgangsmåde ved at score enkelte biopsi og beregningen af ​​heterogenitet i hvert skab. Vores resultater viste, at høje niveauer af heterogenitet kun blev fundet i 0 ~ 11% af det positive (eller negative for ATM) tilfælde, mens de fleste positive tilfælde (56% ~ 78%) viste lav heterogenitet, hvilket indikerer et relativt lavt niveau af heterogenitet for vores udvalgte biomarkører i denne kohorte af GC tilfælde.

Derudover har vi udførte også falske negative vurderinger for hver biomarkør til at estimere falsk negative forbundet med at indsamle forskellige antal biopsier. Resultaterne viste, at når 3 eller flere biopsier blev opsamlet, de falske negative risici var tæt på 5% for alle testede biomarkører (7,14%, 5,16%, 0,86% og 1,41% for henholdsvis MET IHC, MET FISH, ATM IHC, og HER2 ). Dette antal (3-4 biopsier) svarer omtrent til det gennemsnitlige antal biopsier indsamlet i klinisk praksis for denne kohorte, og som sådan, indikerer den relativt lave falsk negativ risiko forbundet med disse biomarkører i vores kohorte. En undtagelse at FGFR2 FISH viste en højere falsk negativ rate (12,2% falsk negative sats for 3 biopsier), kan skyldes, at den begrænsede FGFR2-positiv prøve størrelse (9 positive prøver). Når alt 6 biopsier blev indsamlet fra en enkelt patient, den falske negative risiko for MET, ATM, FGFR2 og HER2 nærmede 0% i denne kohorte. Disse resultater giver et eksempel på, hvordan stigende biopsi numre kan bruges til at løse den udfordring, biomarkør heterogenitet i udbygningen kliniske patientudvælgelse tilgange.

I betragtning af betydningen af ​​præcise patientudvælgelse i kliniske forsøg, vi overbevist om, at tilstrækkeligt adressering biomarkør heterogenitet er afgørende for succes. For eksempel viste MetMab en signifikant forbedring i både progressionsfri overlevelse (2,9 vs. 1,5 måneder) og samlet overlevelse (12,6 vs. 3,8 måneder) [27] i en fase 2-forsøg (NCT01590719) men denne forbedring ikke lykkedes at overføre til indstillingen fase 3 (NCT01662869). Især blev MET protein overekspression (ved IHC) valgt som en patient udvælgelseskriterier [28]. Selv om der stadig et problem for debat, er det muligt at løftet om MetMab i fase 2, men dens fiasko i fase 3 var i det mindste delvist en følge af tumor heterogenitet, og en manglende evne af patienten udvælgelsesstrategi (IHC) til hårdt ind udfordring intratumoral heterogenitet i GC.

Endelig har vi også sammenlignet den positivitet sats (eller negativitet sats for ATM) af de fundne i denne kohorte af biopsiprøver med de kirurgiske prøver fra vores tidligere undersøgelser biomarkører ( tabel 1). Med undtagelse af ATM, blev begge biopsi og kirurgiske prøver indsamlet fra samme lokale hospital. Resultaterne viste, at selv om positivitet er højere (for ATM, negativitet er lavere) i biopsiprøver, de samlede resultater i biopsiprøver lignede kirurgiske prøver. Denne stigning i positivitet sats (eller et fald i negativitet sats for ATM) er sandsynligvis forklares ved påvisning af positive tilfælde ved hjælp af flere biopsier, der blev forpasset hjælp tidligere stikprøvestrategier (dvs.. Kirurgiske resektioner).

Tilsammen har dette undersøgelse har behandlet den udfordring tumor heterogenitet fra en innovativ vinkel ved at bruge biopsier som tumor stikprøve og give individuelle biomarkør scoringer til hver biopsi. Vores resultater viser et relativt lavt niveau af heterogenitet på tværs af de analyseret i denne kohorte biomarkører. Ikke desto mindre kan graden af ​​heterogenitet inden andre patientkohorter være forskellige og bør analyseres fra sag til sag. Endvidere viste vores resultater et fald i hastigheden for falsk negative detektion svarende til en stigning i biopsi nummeret for alle testede heri biomarkører, hvilket viser fordelen ved prøveudtagning multipel biopsi og tjener som et eksempel på adressering intratumoral heterogenitet hjælp af statistiske metoder.

tak

Vi takker AstraZeneca til at sponsorere denne undersøgelse.

• PLoS ONE: Høj mangfoldighed VacA og CagA Helicobacter pylori genotyper hos patienter med og uden Gastric Cancer
• PLoS ONE: In vitro karakterisering af den hurtige cytotoksicitet Anticancer peptid HPRP-A2 gennem Membrane Destruction og intracellulære mekanisme mod mavekræft Cell Lines