PLoS ONE: intratumorale Heterogenität von HER2, FGFR2-, cMET und ATM in Magenkrebs: Optimierung der personalisierten Medizin durch innovative Pathologische und statistische Analyse

Abstrakt

Aktuelle Arzneimittelentwicklung Bemühungen auf Magenkrebs sind gegen mehrere molekulare Ziele gerichtet, das Wachstum dieser Neubildung der Fahrt. Intratumorale Biomarker Heterogenität jedoch häufig bei Magenkrebs beobachtet, zu verzerrten Auswahl der Patienten führen könnte. MET, ATM, FGFR2- und HER2 wurden auf Magenkrebs Biopsie-Proben profiliert. Eine innovative pathologische Beurteilung wurde durch Scoring der einzelnen Biopsien gegen ganze Biopsien von einem einzelnen Patienten durchgeführt Heterogenität Auswertung zu ermöglichen. Im Anschluss daran falsch negativen Risiken für die einzelnen Biomarker wurden geschätzt in silico
. 166 Magenkrebs-Fälle mit mehreren Biopsien von einzelnen Patienten wurden aus Shanghai Renji Krankenhaus gesammelt. Nach vorgegebenen Kriterien, 56 ~ 78% der Fälle zeigten eine geringe, 15 ~ 35% zeigten mittlere und 0 ~ 11% zeigten eine hohe Heterogenität innerhalb der profilierten Biomarkern. Wenn 3-Biopsien von einem einzigen Patienten gesammelt wurden, die falsch-negative Risiko für den Nachweis der Biomarker war knapp 5% (Ausnahme für FGFR2-: 12,2%). Wenn sechs Biopsien gesammelt wurden, näherte sich der falsch negativen Risiko 0%. Unsere Studie den Nutzen mehrerer Biopsien zeigt, wenn die personalisierte Medizin Biomarker-Strategie unter Berücksichtigung und stellt ein Beispiel der Herausforderung, intratumorale Biomarker Heterogenität unter Verwendung alternativer pathologischen Beurteilung und statistische Methoden zur Adresse

Citation:. Ye P, Zhang M, Fan S, Zhang T, Fu H, Su X et al. (2015) intratumorale Heterogenität von HER2, FGFR2-, cMET und ATM in Magenkrebs: Optimierung der personalisierten Medizin durch innovative Pathologische und statistische Analyse. PLoS ONE 10 (11): e0143207. doi: 10.1371 /journal.pone.0143207

Editor: Daniele Generali, Instituti Ospitalieri di Cremona, Italien in

Empfangen: 30. Juli 2015; Akzeptiert: 2. November 2015; Veröffentlicht: 20. November 2015

Copyright: © 2015 Ye et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb der Papier

Finanzierung:. Zeneca diese Studie gefördert hat. Die Geldgeber zur Verfügung gestellt Unterstützung in Form von Gehältern für Autoren [PY, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG und XY] und bereitgestellten Einrichtungen und Ressourcen für diese Studie abgeschlossen. Die spezifischen Rollen dieser Autoren sind in der "Autor Beiträge" Abschnitt artikuliert

Konkurrierende Interessen:. Autoren mit dem Unternehmen assoziiert Zeneca sind Vollzeit-Mitarbeiter und /oder Interessengruppen von Astrazeneca. Diese Studie wurde von Astrazeneca gefördert. Dabei werden nicht die Einhaltung der Autoren ändern ONE Politik auf den Austausch von Daten und Materialien zu Plos. Die Autoren erklären, dass sie keine anderen konkurrierenden Interessen haben.

Einführung

Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten Krebserkrankungen weltweit mit rund der Hälfte aller Fälle in Ostasien vorkommende (hauptsächlich China), und ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1]. Obwohl die Häufigkeit abnimmt, sind die meisten GC-Fälle in einem fortgeschrittenen Stadium und Prognose der Erkrankung bleibt schlecht diagnostiziert [2]. Die mediane Überlebenszeit bei metastasierendem GC ist weniger als ein Jahr, während die gesamte 5-Jahres-Überlebensrate beträgt weniger als 7% [3].

intratumorale Heterogenität wird üblicherweise in GC beobachtet. In den 1980er Jahren, de Aretxabala et al
ausgewertet 222 Proben von 37 GC-Fälle und fand eine Mischung aus diploiden und aneuploid Proben oder verschiedene aneuploid stemlines im gleichen Fall (so genannte DNA-Gehalt Heterogenität) in 33% der primären Tumoren [4]. Eine ähnliche Studie von Yonemura et al
zeigte eine 69% DNA-Gehalt Heterogenität in 65 reseziert GC-Proben [5]. Vor kurzem Yang et al
ausgewertet GC-Proben von 148 Patienten und fand eine Heterogenität Rate von 79,3% in humanen epithelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) Protein-Überexpression und 44% in HER2
Genamplifikation [6]. Dementsprechend ist die hohe intratumorale Heterogenität in GC beobachtet wurde, ist wahrscheinlich auf die Behandlung Widerstand und eine schlechtere Prognose der Patienten [7, 8], beizutragen und schließlich stellt eine erhebliche unadressierte Problem von Ärzten konfrontiert, Pathologen und Forscher.

Mehrere molekulare Ziele verfügen derzeit entweder genehmigt medikamentöse Behandlungen oder vielversprechende Therapeutika der klinischen Entwicklung in GC unterzogen. HER2 spielt eine wichtige Rolle in der Tumorgenese von Brustkrebs, Eierstockkrebs und Magenkrebs [9] und Trastuzumab, einem monoklonalen Antikörper gegen HER2, wurde für die Behandlung von GC bestätigt [10]. Die mesenchymalen-epithelial Gangsfaktor (MET) Gen kodiert für ein Protein, das die einzige bekannte Rezeptor für Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) Ligand ist [11]. MET
Gen-Amplifikation und Proteinexpression wurden konstante Aktivierung des MET-Signalweg, der das Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung [12] trägt zu führen gezeigt. Mehrere MET-Inhibitoren befinden sich derzeit in GC klinischen Studien, einschließlich Savolitinib (Phase 1 (NCT02252913) [13]) und AMG337 (Phase 2 (NCT02016534)). Ähnlich Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (FGFR2) wird auch bei der Zellproliferation, Differenzierung und Motilität beteiligt, und Amplifikation der FGFR2
Gen spielt eine wichtige Rolle in der Tumorgenese von GC, wodurch seine Attraktivität als Arzneimittelentwicklung unterstreicht Ziel [14-16]. Ataxia telangiectasia mutiert (ATM) ist eine Proteinkinase zur Phosphatidylinositol gehör 3'-Kinase (PI3K) -Familie, und unter normalen Bedingungen wird als Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüchen [17] aktiviert. ATM-Mangel ist mit einer hohen Inzidenz von Gewebe Malignitäten [18-20] und ATM-defizienten Tumorzellen sind ein potentielles Ziel empfindlich auf Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP) Hemmung, bezogen, die zur Behandlung von vorgeschlagen wurde GC in mehreren früheren Studien [21-24]. Lynparza, der erste US-und europäischen zugelassenen PARP-Inhibitor Targeting BRCA1 /2-Mutante Eierstockkrebs, wird derzeit eine Phase-III-Studie in GC (NCT01924533) unterziehen und wird eine Auswahl der Patienten Biomarker-Ansatz unter Verwendung von mit ATM-Expression durch IHC (Veröffentlichung in der Presse) .

In der gegenwärtigen Ära der molekular gezielten Wirkstoffentwicklung werden Biomarker zu erwarten klinische Reaktion genau vorhersagen [25]. Hohe Tumor Heterogenität jedoch zu einer biomarker Detektions Bias führen kann, wenn die Proben von einem kleinen Tumorregion erhalten werden, anstatt das gesamte Tumorgewebe (z.B. operativ resezierten Proben sind in der Regel 2 cm x 2 cm only). Im Gegensatz dazu sind Biopsieproben in der Regel aus verschiedenen Regionen des gesamten Tumors erhalten und sind wahrscheinlich mehr repräsentativ für die Patienten insgesamt Biomarker Ausdruck Status zu sein, mit dem Argument für ihr Potenzial, die Auswirkungen der intratumoralen Heterogenität der Patientenselektionsbias zu reduzieren.

in unserer Studie um intratumorale Heterogenität besser beurteilen, wir chirurgische Biopsie als unsere Tumorprobenahmestrategie eingesetzt. Darüber hinaus führten wir eine innovative pathologische Beurteilung durch Scoring der einzelnen Biopsien gegen ganze Biopsien von einzelnen Patienten. Wir berichten hier auch statistische Methoden zur Abschätzung der falsch-negativen Erkennung Risiken eingesetzt bei der Analyse von endlichen Anzahl von Biopsien, um die Beziehung zwischen der Anzahl von Biopsien und das Risiko der Auswahl eines falsch-positiven Patienten für eine bestimmte Behandlung oder die Aufnahme in einer klinischen Studie zu verstehen,
.

Materialien und Methoden

Patienteninformation

archivierten GC Biopsieproben von 166 Patienten gesammelt wurden, die zwischen 2007 Gastroskopie Untersuchung mit mehreren Biopsien von verschiedenen Tumorbereichen eines jeden Patienten erhalten und 2014 Renji Krankenhaus, Shanghai, China. Eine vorherige schriftliche Einwilligung wurde von allen Patienten erhalten, und das Studienprotokoll wurde von der Renji Krankenhaus Institutional Review Board genehmigt. Alle Proben wurden von zwei ausgebildeten Pathologen für die GC-Diagnose überprüft und vierzig Proben wurden aufgrund der schlechten Qualität des Gewebes in der Studie ausgeschlossen.

Immunhistochemie (IHC)

Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Proben wurden bei 4 um Dicke geschnitten. Für MET-Färbung, ein Kaninchen monoklonale anti-total MET-Antikörper (cMET SP44, Ventana Medical Systems, AZ, USA) wurde verwendet, und der Test wurde auf einem Färbeautomaten (Discovery-XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA) durchgeführt. ATM-Färbung wurde unter Verwendung eines Kaninchen monoklonalen Anti-ATM-Antikörper (ab32420, Abcam, MA, USA) durchgeführt auf einem Autostainer (Thermo Scientific, MA, USA). HER2-Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers auf einem Färbeautomaten (Discovery-XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA) unter Verwendung des HercepTest Kit (DAKO, Dänemark) durchgeführt.

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Der Assay zweifarbige FISH wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [26]. HER2 /CEP17
Sonden wurden von Vysis gekauft (IL, USA; Kat.-171060). MET
und FGFR2-
Sonden durch Kennzeichnung BAC (CTD-2270N20 und RP11-62L18, jeweils) DNA mit Red-dUTP (Enzo Biochem, NY, USA hergestellt wurden, Kat.N;23- 050), CEP10
-spectrum Grün und CEP7
-spectrum Grüne Sonden aus Vysis (Kat gekauft wurden. -112010 und -132007, beziehungsweise) und als interne Kontrollen verwendet für FGFR2-
und MET
Sonden

Pathologie Beurteilung auf Biopsien

Basierend auf H &. E-Färbung, jeder Biopsie mit ausreichender Tumorzellen (mehr als 50 Tumorzellen) wurde zunächst durch einen Pathologen markiert. Dann Status Biomarker einschließlich IHC und FISH-Färbung von MET, ATM, FGFR2- und HER2 wurden auf jeder Biopsie ausgewertet. Einzelne Messwerte für jedes Biomarker wurden zu jeder Biopsie (Bild 1) gegeben

Nach MetMAb Studie bei GC (NCT01662869), MWB-IHC-Färbung, eine Biopsie IHC 3+ zeigt, ist als positiv definiert. MWB-FISH, zeigt Biopsie MET
Gen durchschnittliche Kopienzahl ≥ 5 ist als positiv definiert. Seit der laufenden Studie für einen weiteren MET Inhibitor AZD6094 (NCT02449551), verwendet MET
Gen durchschnittliche Kopienzahl ≥ 4 als Einzelmittel Behandlungsarm auf GC Patienten abgeschnitten, teilten wir weiter die MET FISH negativ Gruppe in zwei Untergruppen ( Gen
MET durchschnittliche Kopienzahl ≥ 4 und < 5 und Gen durchschnittliche Kopienzahl <
MET; 4). Für ATM-IHC-Färbung, zeigt Biopsie IHC 0 als negativ definiert gemäß Olaparib Studie (NCT01063517). Für FGFR2- FISH, zeigt Biopsie FGFR2-
Gen-Amplifikation (durchschnittliche Kopienzahl ≥ 6) als positiv definiert gemäß Studien von AZD4547 (NCT01457846) und dovitinib (NCT01719549). Für HER2, zeigt Biopsie HER2 IHC 3+ oder HER2 IHC 2+ und HER2
Genamplifikation als positiv nach ToGA Studie (NCT01041404) definiert ist.

Für MET IHC, MET FISH, FGFR2- FISH und HER2, Fälle mit jeder
der Biopsien positiv zeigen, werden als positive Fälle definiert. Für ATM-IHC-Färbung, Fälle mit allen Biopsien negativ zeigt, wie negative Fälle definiert sind

Heterogene Grad-Beurteilung

Nach dem Pathologen Überprüfung der Grad der Heterogenität Biomarker bestimmt wurde nach den folgenden Kriterien:.

Hohe Heterogenität: < 25% der Biopsien mit MET IHC 3+, MET
Genamplifikation, ATM IHC 0, FGFR2-
Genamplifikation oder HER2-Positivität

Medium Heterogenität. 25% ~ 50% der Biopsien mit MET IHC 3+, MET
Genamplifikation, ATM IHC 0, FGFR2-
Genamplifikation oder HER2-Positivität

Niedrige Heterogenität. ≥50% Biopsien mit MET IHC 3+, MET
Genamplifikation, ATM IHC 0, FGFR2-
Genamplifikation oder HER2-Positivität.

Für MET IHC, MET FISH, FGFR2- FISH und HER2-Positivität, die mittleren Prozentsätze der positiven Biopsien im Einzelfall unter den positiven Fällen wurden berechnet. Für ATM IHC wurde der mittlere Prozentsatz der ATM IHC negativen Biopsien im Einzelfall unter Fällen mit mindestens einer ATM negativen Biopsie berechnet. Die 95% Konfidenzintervall der obigen Mittelwerte wurden von Bootstrapping bewertet.

Falsch negative Erkennung Risikobewertung

Für jedes Biomarker und eine vorgegebene Anzahl von Biopsien n
(0 < n < maximale Anzahl von Biopsien aus einer Probe), alle möglichen Szenarien der Wahl n
Biopsien von jeder Probe und machen eine Bestimmung des Status des Biomarkers für die auf dem n
basierend Probe ausgewählt Biopsien wurden rechnerisch erzeugt.

Basierend auf den oben genannten Szenarien aufgezählt wurden die Risiken von falsch-negativen Erkennung beurteilt. Für MET IHC, MET FISH, FGFR2- FISH und HER2-Positivität, das Risiko von falsch-negativen Erkennung mit n
Biopsien von jeder Probe wurde als die erwartete Anzahl der das Verhältnis zwischen der Anzahl der positiven Proben definiert, die negativen haben Detektionsergebnisse mit n
Biopsien und die Gesamtzahl der positiven Proben. Für ATM IHC, die falsch-negative Aufdeckungsrisiko mit n
Biopsien von jeder Probe als Erwartungswert des Verhältnisses zwischen der Anzahl der nicht-negativen Proben mit allen negativen Biopsien mit n
definiert wurde Biopsien von jeder Probe, und die Gesamtanzahl der ATM nicht-negativen Proben.

Alle Berechnungen wurden exakt außer ATM IHC mit einer Biopsie von jeder Probe wegen der extrem großen Anzahl von möglichen Szenarien. Für ATM IHC mit einer Biopsie von jeder Probe wurde das Risiko von falsch-negativen Erkennung geschätzt durch eine zufällige Teilmenge von 30 nicht-negativen Proben ohne Ersatz zu einer Zeit, um das Risiko von falsch-negativen Erkennung in der Teilmenge Berechnung Wiederholung des Prozesses mit 22.000 Zeiten und einen Durchschnitt der Risiken von falsch-negativen Erkennung von den 22.000 zufälligen Untergruppen nehmen. Darüber hinaus wurde das 95% Konfidenzintervall dieses geschätzten Risiko berichtet.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Hohe Vielfalt von vacA und CagA Helicobacter pylori Genotypen bei Patienten mit und ohne Magen Cancer
• PLoS ONE: In-vitro-Charakterisierung des Rapid-Zytotoxizität von Anti-Krebs-Peptid HPRP-A2 durch Membran Zerstörung und der intrazelluläre Mechanismus gegen Gastric Cancer Cell Lines