PLoS ONE: intratumorale heterogeniteit van de HER2, FGFR2, CMET en ATM bij maagkanker: het optimaliseren van gepersonaliseerde gezondheidszorg door middel van innovatieve Pathologische and Statistical Analysis

Abstract

De huidige ontwikkeling van geneesmiddelen inspanningen op maagkanker zijn gericht tegen verschillende moleculaire doelen besturen van de groei van het neoplasma. Intratumorale heterogeniteit biomarker echter vaak waargenomen bij maagkanker, kan leiden tot vertekende selectie van patiënten. BMO, ATM, FGFR2 en HER2 werden geprofileerd op maagkanker biopsie monsters. Een innovatieve pathologische evaluatie werd uitgevoerd door middel van scoring van de afzonderlijke biopten tegen hele biopten van een enkele patiënt te heterogeniteit evaluatie mogelijk te maken. Naar aanleiding hiervan werden vals-negatieve risico's voor elke biomarker geschat in silico
. 166 maagkanker gevallen met meerdere biopten van enkele patiënten werden verzameld uit Shanghai Renji Hospital. Naar aanleiding van vooraf vastgestelde criteria, 56 ~ 78% van de gevallen bleek laag, 15 ~ 35% toonde medium en 0 ~ 11% toonde een hoge heterogeniteit binnen de biomarkers geprofileerd. Als 3 biopten werden verzameld uit een patiënt, de valse negatieve risico voor detectie van de biomarkers werd steeds 5% (behalve voor FGFR2: 12,2%). Toen 6 biopten werden verzameld, de valse negatieve risico benaderd 0%. Ons onderzoek toont het voordeel van meerdere biopsie bemonstering bij het overwegen van gepersonaliseerde gezondheidszorg biomarker strategie, en geeft een voorbeeld voor de uitdaging van de intra-tumorale biomarker heterogeniteit aan te pakken met behulp van alternatieve pathologisch assessment en statistische methoden

Visum:. Ye P, Zhang M, S Fan, Zhang T, Fu H, Su X, et al. (2015) intratumorale heterogeniteit van de HER2, FGFR2, CMET en ATM bij maagkanker: het optimaliseren van gepersonaliseerde gezondheidszorg door middel van innovatieve Pathologische en statistische analyse. PLoS ONE 10 (11): e0143207. doi: 10.1371 /journal.pone.0143207

Editor: Daniele Generali, inst Ospitalieri di Cremona, Italië |

Ontvangen: 30 juli 2015; Aanvaard: 2 november 2015; Gepubliceerd: 20 november 2015

Copyright: © 2015 Ye et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. AstraZeneca heeft dit onderzoek gesponsord. De financier heeft steun verleend in de vorm van salarissen voor auteurs [PY, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG en XY] en voorzien van faciliteiten en middelen voor het voltooien van deze studie. De specifieke rol van deze auteurs worden verwoord in de sectie 'auteur bijdragen "

Competing belangen:. Auteurs aangesloten bij AstraZeneca zijn full-time medewerkers en /of stakeholders van AstraZeneca. Deze studie werd gesponsord door AstraZeneca. Dit betekent niet naleving van de auteurs om ONE beleid op het delen van gegevens en materialen PLOS veranderen. De auteurs verklaren dat ze geen andere concurrerende belangen.

Introductie

Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende vormen van kanker in de wereld, met ongeveer de helft van alle gevallen die zich in Oost-Azië (hoofdzakelijk China), en is de derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Hoewel de incidentie afneemt, worden de meeste GC gevallen gediagnosticeerd in een vergevorderd stadium en de prognose van de ziekte blijft armen [2]. De mediane overleving bij uitgezaaide GC is minder dan één jaar, terwijl de totale 5-jaarsoverleving is minder dan 7% [3].

Intra-tumorale heterogeniteit is vaak waargenomen in GC. In de jaren 1980, de Aretxabala et al
geëvalueerd 222 monsters van 37 GC gevallen en vond een mengsel van diploïde en aneuploïd monsters of andere aneuploïd stemlines in dezelfde zaak (de zogenaamde DNA-gehalte heterogeniteit) in 33% van de primaire tumoren [4]. Een soortgelijke studie van Yonemura et al
toonde een 69% DNA-gehalte heterogeniteit in 65 resected GC monsters [5]. Onlangs, Yang et al
geëvalueerd GC monsters van 148 patiënten en vond een heterogeniteit tarief van 79,3% in de menselijke epitheliale groeifactor receptor 2 (HER2) overexpressie eiwit en 44% in de HER2
genamplificatie [6]. Bijgevolg is de hoge intra-tumorale heterogeniteit waargenomen in GC zal waarschijnlijk bijdragen aan de behandeling weerstand en een slechtere prognose voor de patiënt [7, 8], en uiteindelijk een aanzienlijke ongeadresseerde probleem van clinici, pathologen, en onderzoekers.

verschillende moleculaire doelwitten momenteel voorzien in een van beide goedgekeurde geneesmiddel behandelingen of veelbelovende therapieën klinische ontwikkeling ondergaan in GC. HER2 speelt een belangrijke rol in de tumorigenese van borstkanker, eierstokkanker en maagkanker [9] en Trastuzumab, een monoklonaal antilichaam tegen HER2, is goedgekeurd voor de behandeling van GC [10]. De mesenchymale-epitheliale vermenigvuldigingsfactoren (MET) gen codeert voor een eiwit dat de enige bekende receptor voor hepatocyt groeifactor (HGF) ligand [11]. MET
genamplificatie en eiwitoverexpressie is aangetoond dat leidt tot voortdurende activering van het MET signaleringsroute die bijdraagt ​​tot tumorgroei, angiogenese en metastase [12]. Verschillende BMO-remmers worden momenteel GC klinische proeven, met inbegrip Savolitinib (fase 1 (NCT02252913) [13]) en AMG337 (fase 2 (NCT02016534)). Evenzo wordt fibroblast groeifactor receptor 2 (FGFR2) ook betrokken bij celproliferatie, differentiatie en motiliteit en amplificatie van de FGFR2
gen speelt een belangrijke rol bij de tumorigenese van GC, waardoor de aantrekkelijkheid benadrukken als geneesmiddelontwikkeling doel [14-16]. Ataxia telangiectasia gemuteerde (ATM) is een proteïne kinase die tot fosfatidylinositol 3'-kinase (PI3K) familie, en onder normale omstandigheden is geactiveerd in respons op DNA dubbelstrengs breuken [17]. ATM deficiëntie komt voor bij een hoge incidentie van weefsel maligniteiten [18-20] en ATM-deficiënte tumorcellen gevoelig zijn poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP) remming, een potentieel doelwit die voor de behandeling van voorgesteld GC in een aantal eerdere studies [21-24]. Lynparza, de eerste Amerikaanse en Europese goedgekeurde PARP-remmer gericht BRCA1 /2 mutant eierstokkanker, is momenteel een Fase III klinische trial in GC (NCT01924533) ondergaan en is het gebruik van een patiënt selectie biomarker benadering met behulp van ATM expressie door IHC (bekendmaking in press) .

In het huidige tijdperk van moleculair gerichte ontwikkeling van geneesmiddelen, biomarkers naar verwachting klinische respons [25] precies te voorspellen. Hoge tumor heterogeniteit kan echter leiden tot een biomarker detectie voorspanning indien de monsters worden verkregen van een kleine tumor gebied dan het gehele tumorweefsel (bijvoorbeeld chirurgisch weggesneden monsters meestal slechts 2 cm x 2 cm). Daarentegen zijn biopsie monsters meestal verkregen uit verschillende regio's van de gehele tumor en zullen waarschijnlijk meer representatief is voor de algehele toestand van de patiënt 'biomarker expressie, met het argument voor hun potentieel om het effect van de intra-tumorale heterogeniteit van de patiënt selectie vertekening te verminderen.

in onze studie om intratumorale heterogeniteit beter te evalueren, gebruikten we biopsie onze tumor samplingstrategie. Daarnaast voerden we een innovatieve pathologische evaluatie door middel van individuele scoring biopsies tegen hele biopten uit één patiënt. Hierin gebruikten we ook statistische methoden om vals negatieve detectie risico schatten wanneer de analyse eindige aantallen biopten teneinde de verhouding tussen het aantal biopsieën en het risico van het selecteren van een vals positieve patiënt voor een bepaalde behandeling of opname in een klinische proef begrijpen .

Materialen en methoden

Patiënteninformatie

Gearchiveerd GC biopsie monsters werden verzameld van 166 patiënten die een gastroscopie onderzoek met meerdere biopten van verschillende tumor gebieden van elke patiënt tussen 2007 ontvangen en 2014 Renji ziekenhuis, Shanghai, China. Voorafgaande schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten en het studieprotocol werd goedgekeurd door de Renji Hospital Institutional Review Board. Alle monsters werden beoordeeld door twee getrainde pathologen voor GC diagnose en veertig monsters werden uitgesloten van de studie als gevolg van slechte weefsel kwaliteit.

Immunohistochemie (IHC)

formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) monsters werden coupes 4 urn dikte. Voor MET kleuring, werd een konijn monoklonaal anti-MET totale antilichaam (CMET SP44, Ventana Medical Systems, AZ, USA) gebruikt en de test werd uitgevoerd op een automatische Stainer (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA). ATM kleuring werd uitgevoerd met een monoklonaal anti-konijn antilichaam ATM (ab32420, Abcam, MA, USA) op Autostainer (Thermo Scientific, MA, USA). HER2 kleuring werd uitgevoerd met het HercepTest kit (DAKO, Denemarken) volgens de instructies van de fabrikant op een automatische Stainer (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA).

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

De tweekleurige FISH assay werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [26]. HER2 /CEP17
probes werden gekocht van Vysis (IL, USA;. Cat-171060). BMO Kopen en FGFR2
probes werden bereid door middel van etikettering BAC (CTD-2270N20 en RP11-62L18, respectievelijk) DNA met Red-dUTP (Enzo Biochem, NY, USA;. CatN;23- 050), CEP10
-spectrum Green en CEP7
-spectrum Green probes werden gekocht van Vysis (Cat. -112010 en 32-132007 #, respectievelijk) en gebruikt als interne controles voor FGFR2 Kopen en BMO
probes

Pathology beoordeling van biopten

op basis van H &. E kleuring, elk biopt met voldoende tumorcellen (meer dan 50 tumorcellen) werd eerst gekenmerkt door een patholoog. Dan biomarker-status met inbegrip van IHC en FISH kleuring van BMO, ATM, FGFR2 en HER2 werden geëvalueerd op elke biopsie. Individuele punten per biomarker kregen elke biopsie (figuur 1)

Volgens MetMab proces in GC (NCT01662869) BMO IHC, een biopsie toont IHC 3+ is gedefinieerd als positief.; voor BMO FISH, biopsie tonen BMO
gen gemiddeld aantal kopieën ≥ 5 is gedefinieerd als positief. Aangezien de lopende proef voor een ander BMO inhibitor, AZD6094 (NCT02449551), gebruik BMO
gen gemiddeld aantal kopieën ≥ 4 als afgesneden voor enkele agent behandeling arm op GC patiënten, we verder de BMO FISH negatieve groep verdeeld in twee subgroepen ( BMO
gen gemiddeld aantal kopieën ≥ 4 en < 5, en BMO
gen gemiddeld aantal kopieën < 4). Voor ATM IHC kleuring, biopsie toont IHC 0 wordt gedefinieerd als negatief volgens Olaparib trial (NCT01063517). Voor FGFR2 FISH, biopsie tonen FGFR2
genamplificatie (gemiddeld aantal kopieën ≥ 6) wordt gedefinieerd als positief volgens de beproevingen van AZD4547 (NCT01457846) en dovitinib (NCT01719549). Voor HER2, biopsie tonen HER2-IHC 3+ of HER2 IHC 2+ plus HER2
genamplificatie is gedefinieerd als positieve volgens ToGA trial (NCT01041404).

Voor BMO IHC, BMO FISH, FGFR2 FISH en HER2, gevallen geen Website van biopsies die zich positief worden gedefinieerd als positieve gevallen. ATM IHC worden gevallen met negatieve biopten toont gedefinieerd als negatieve gevallen

Heterogeniteit graden beoordeling

Na beoordeling patholoog, de graad van heterogeniteit biomarker werd bepaald volgens de volgende criteria:.

High heterogeniteit: < 25% van de biopten met BMO IHC 3+, BMO
genamplificatie, ATM IHC 0, FGFR2
genamplificatie of HER2 positiviteit

Medium heterogeniteit:. 25% ~ 50% van de biopten met BMO IHC 3+, BMO
genamplificatie, ATM IHC 0, FGFR2
genamplificatie of HER2 positiviteit

Lage heterogeniteit. ≥50% biopsies met BMO IHC 3+, BMO
genamplificatie, ATM IHC 0, FGFR2
genamplificatie of HER2 positiviteit.

Voor BMO IHC, BMO FISH, FGFR2 FISH en HER2 positiviteit, de gemiddelde percentages positieve biopten per individueel geval onder de positieve gevallen werden berekend. ATM IHC, het gemiddelde percentage ATM IHC negatieve biopten per individueel geval bij gevallen met ten minste één ATM negatieve biopsie berekend. De 95% betrouwbaarheidsintervallen van de bovenstaande gemiddelde waarden werden beoordeeld door bootstrapping.

Valse negatieve detectie risicobeoordeling

Voor elke biomarker en een vooraf bepaald aantal biopsieën n
(0 < n < maximum aantal biopten van een monster), alle mogelijke scenario's van het kiezen van n
biopten van elk monster en het maken van een bepaling van de status van de biomarker voor de steekproef op basis van de n
gekozen biopsies werden computationeel gegenereerd.

op basis van de scenario's hierboven aangegeven, de risico's van vals-negatieve detectie werden beoordeeld. Voor BMO IHC, BMO FISH, FGFR2 FISH en HER2 positiviteit, het risico van een vals-negatieve detectie met n
biopten van elk monster werd gedefinieerd als het verwachte aantal van de verhouding tussen het aantal positieve monsters die negatief hebben detectie resultaten met n
biopsies en het totale aantal positieve monsters. ATM IHC, de valse negatieve ontdekkingsrisico met n
biopten van elk monster werd gedefinieerd als de verwachte waarde van de verhouding tussen het aantal niet-negatieve monsters met negatieve biopten met n
biopten van elk monster, en het totale aantal ATM niet-negatieve monsters.

Alle berekeningen waren exact behalve ATM IHC met een biopsie van elk monster door het zeer grote aantal mogelijke scenario's. ATM IHC met een biopsie uit elk monster, het risico op vals-negatieve detectie werd geschat door middel van een willekeurige subset van 30 niet-negatieve monsters zonder vervanging tegelijk berekenen van het risico op vals-negatieve detectie in de subset, het proces herhaald 22.000 tijden en het nemen van een gemiddelde van de risico's van vals negatieve detectie van de 22.000 willekeurige deelverzamelingen. Bovendien, de 95% betrouwbaarheidsinterval van het geschatte risico gemeld.

Resultaten

Overzicht van GC biopsie getallen in klinische monsters

In dit cohort, het aantal biopsie monsters van een patiënt varieerde van 1 tot 9, waarbij de mediaan van totale positieve biopten (met tumorcellen) en 4. de positieve biopsie getallen waren iets kleiner dan het aantal biopsie. Gevallen met 3 ~ 4 en 5 ~ 6 positieve biopten goed voor 47% en 25% van alle verzamelde monsters (figuur 2).

heterogeniteit graad en vals negatieve beoordeling

In de 18 BMO IHC positieve gevallen (figuur 3A), 61% van de gevallen bleek lage heterogeniteit, terwijl 33% liet medium en 5,5% vertoonde hoge heterogeniteit. Het gemiddelde percentage van BMO positieve biopten in een individueel geval onder die 18 positieve gevallen was 65,78% (95% CI: 52,14% -79,60%). De MET vals-negatieve detectie werd geschat op ongeveer 3,39% met 4 biopten en benaderde 0% bij de bemonstering van 6 biopten (figuur 4A).

In de 13 BMO FISH positieve gevallen (figuur 3B), 77% van de gevallen toonde lage heterogeniteit, terwijl 15% liet medium en 8% vertoonde een hoge heterogeniteit. Het gemiddelde percentage van BMO FISH positieve biopten in een individueel geval onder die 13 positieve gevallen was 74,05% (95% CI: 57,53% -89,10%). De MET FISH vals-negatieve detectie werd geschat op ongeveer 3,30% met 4 biopten en benaderde 0% bij de bemonstering van 7 biopten (figuur 4B). Daarnaast werd significante correlatie gevonden tussen BMO IHC score en MET FISH resultaten (p < 0,01, κ = 0,62, Fisher's exact test)

In de 58 gevallen met ten minste één ATM negatieve biopsie (Fig 3C) , 62% van de gevallen bleek lage heterogeniteit, terwijl 35% liet medium en 3,6% vertoonde hoge heterogeniteit. Het gemiddelde percentage van ATM IHC negatieve biopten in een individueel geval onder die 58 gevallen was 63,07% (95% CI: 54,93% -71,39%). De ATM IHC vals-negatieve detectie werd geschat op ongeveer 0,19% met 4 biopten, en benaderde 0% met 5 biopten (figuur 4C).

In de 9 FGFR2 FISH positieve gevallen, 56% van de gevallen bleek laag heterogeniteit, terwijl 33% liet medium en 11% vertoonde een hoge heterogeniteit (figuur 3D). Het gemiddelde percentage van FGFR2 FISH positieve biopten in een individueel geval onder degenen 9 positieve gevallen was 56,30% (95% CI: 36,85% -76,85%). De FGFR2 FISH vals-negatieve detectie werd geschat op ongeveer 3,70% met 4 biopten en benaderde 0% met 6 biopten (figuur 4D).

In de 32 HER2-positieve gevallen, 78% van de gevallen bleek lage heterogeniteit, terwijl 22% liet medium heterogeniteit en geen van de gevallen bleek een hoge heterogeniteit (figuur 3E). Het gemiddelde percentage van HER2-positieve biopten in een individueel geval onder die 32 positieve gevallen was 75,16% (95% CI: 65,88% -85,11%). De HER2 vals-negatieve detectie werd geschat op ongeveer 0,21% met 4 biopten en benaderde 0% met 5 biopten (figuur 4E).

Discussie

Intra-tumorale biomarker heterogeniteit is al lange tijd een probleem bij de selectie van patiënten voor klinische proeven en daarom begrijpen tumor heterogeniteit is essentieel voor de succesvolle implementatie van een persoonlijke gezondheidszorg biomarker (PHB) strategie. Echter slechts weinig studies tot nu toe gericht dit probleem en er geen gestandaardiseerde strategie meten van de mate van tumor heterogeniteit. In deze studie hebben we een nieuwe benadering van het maken van elk individueel biopsie en berekenen van de heterogeniteit binnen elk geval. Onze resultaten toonden dat hoge heterogeniteit alleen gevonden in 0 ~ 11% van de positieve (of negatieve ATM) gevallen, terwijl de meeste positieve gevallen (56% ~ 78%) vertoonden lage heterogeniteit, wat wijst op een relatief lage heterogeniteit voor onze geselecteerde biomarkers in dit cohort van GC gevallen.

Daarnaast voerden we ook vals-negatieve beoordelingen voor elk biomarker om de valse negatieve tarieven in verband met het verzamelen van verschillende aantallen biopsieën te schatten. De resultaten toonden aan dat wanneer 3 of meer biopten werden verzameld, de valse negatieve risico's waren in de buurt van 5% voor alle geteste biomarkers (7,14%, 5,16%, 0,86% en 1,41% voor respectievelijk BMO IHC, BMO FISH, ATM IHC, en HER2 ). Dit aantal (3-4 biopsieën) is ongeveer gelijk aan het gemiddelde aantal biopsieën in de klinische praktijk verzameld voor dit cohort en als zodanig geeft de relatief lage vals negatieve risico voor die biomarkers in ons cohort. Een uitzondering dat FGFR2 FISH toonden een hoger vals negatieve rente (12.2% vals-negatieve tarief voor 3 biopsies), zou te wijten zijn aan de beperkte FGFR2-positieve steekproefgrootte (9 positieve monsters). Wanneer een totaal van 6 biopten werden verzameld uit een enkele patiënt, de valse negatieve risico's voor een BMO, ATM, FGFR2 en HER2 benaderde 0% in dit cohort. Deze resultaten geven een voorbeeld van hoe het verhogen van biopsie nummers kunnen worden gebruikt om de uitdaging van de biomarker heterogeniteit te pakken bij het inzetten van de klinische selectie van patiënten benaderingen.

Gezien het belang van een nauwkeurige selectie van patiënten in klinische studies, zijn wij ervan overtuigd dat adequaat aanpakken biomarker heterogeniteit is cruciaal voor succes. Bijvoorbeeld MetMab vertoonden een significante verbetering van progressievrije overleving (2,9 vs. 1,5 maanden) en algehele overleving (12,6 versus 3,8 maanden) [27] in een fase 2 trial (NCT01590719) maar deze verbetering is niet met succes overdragen om de fase 3-instelling (NCT01662869). Met name BMO eiwit overexpressie (IHC) werd geselecteerd als een patiënt selectiecriteria [28]. Hoewel nog steeds een punt van discussie, is het mogelijk dat de belofte van MetMab in fase 2 maar het falen in fase 3 is ten minste gedeeltelijk een gevolg van tumor heterogeniteit en een onvermogen van de patiënt selectiestrategie (IHC) om krachtig in op de uitdaging van de intra-tumorale heterogeniteit in GC.

tot slot hebben we ook ten opzichte van het percentage positieve (of negativiteit tarief voor ATM) van de gedetecteerde in dit cohort van biopsie monsters met de chirurgische monsters van onze eerdere studies biomarkers ( Tafel 1). Met uitzondering van ATM, zowel biopsie en chirurgische monsters werden verzameld uit dezelfde ziekenhuis. De resultaten toonden aan dat, hoewel positiviteit hoger zijn (voor ATM, negativiteit lager zijn) in biopsie monsters, de algemene resultaten in biopsie monsters waren vergelijkbaar met chirurgische monsters. Deze toename in percentage positieve (of afname in negativiteit tarief voor ATM) is waarschijnlijk te verklaren door het opsporen van de positieve gevallen het gebruik van meerdere biopten die werden gemist met behulp van vorige bemonsteringsstrategieën (bijv. Chirurgische resecties).

Bij elkaar genomen, dit studie is ingegaan op de uitdaging van de tumor heterogeniteit van een innovatieve hoek met behulp van biopten als de tumor steekproefbenadering en het geven van individuele biomarker scores aan elke biopsie. Onze resultaten tonen een relatief lage heterogeniteit tussen de biomarkers in dit cohort geanalyseerd. Niettemin kan de mate van heterogeniteit binnen andere patiënt cohorten verschillend zijn en moeten worden geanalyseerd op een case-by-case basis. Bovendien zijn onze resultaten toonden een daling van het aantal valse negatieve overeenstemmend met een toename van het biopsie nummer voor alle hierin geteste biomerkers, waaruit de voordelen van meervoudige biopsie bemonstering en dienen als voorbeeld van de aanpak intratumorale heterogeniteit behulp van statistische methodes.

Dankwoord

Wij danken AstraZeneca voor het sponsoren van deze studie.

• PLoS ONE: Hoge diversiteit van Vaca en cagA Helicobacter pylori genotypen bij patiënten met en zonder maagkanker
• PLoS ONE: In vitro karakterisering van de Rapid cytotoxiciteit van Antikanker Peptide HPRP-A2 tot Membraan Destruction en intracellulaire mechanisme tegen maagkanker cellijnen