PLOS ONE: Reproduce Stathmin1 Oncogénicos clases, y es un blanco de microARN-223 en gástrico Cancer

Extracto

Stathmin1 (STMN1) es un candidato oncoproteína y un marcador pronóstico en varios tipos de cánceres. Este estudio tuvo como objetivo analizar sus funciones biológicas y de expresión en el cáncer gástrico. La expresión de STMN1 se evaluó mediante qRT-PCR, Western blot e inmunohistoquímica. La función biológica de STMN1 se determinó mediante ensayos de MTT proliferación, la formación de colonias monocapa y ensayos de invasión celular utilizando pequeña técnica de ARN de interferencia en las líneas celulares de cáncer gástrico. También exploramos la regulación de la expresión STMN1 por microRNA-223. STMN1 se upregulated en líneas celulares de cáncer gástrico y adenocarcinomas gástricos primarios. STMN1 tumores positivos tenían más probabilidades de ser encontrado en el grupo de edad avanzada y se asocia con la expresión de p53 nuclear. En los adenocarcinomas de tipo gástrico difuso, la expresión STMN1 se correlacionó con la edad ( p = 0,043
), estadio T ( p
= 0,004) y la metástasis de los ganglios linfáticos ( p =
0,046). La expresión de STMN1 de tipo difuso adenocarcinoma gástrico se asocia a peor supervivencia específica de la enfermedad mediante el análisis univariante ( p
= 0,01). STMN1 caída en las líneas de células AGS y MKN7 proliferación suprimida ( p Hotel < 0,001), la reducción de la formación de colonias monocapa ( p Hotel < 0,001), la invasión de células inhibido y capacidad de migración ( p Hotel < 0,001) y la detención en la fase G1 inducida. siSTMN1 también podría inhibir el crecimiento de células in vivo gratis ( p
. < 0 01). Finalmente se confirmó que STMN1 será un objetivo putativo de miR-223 en el cáncer gástrico. Nuestros resultados apoyan un papel oncogénico de STMN1 en el cáncer gástrico. STMN1 podría servir como marcador pronóstico y una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico

Visto:. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, pulmón RWM, Chau SL, Wong CVL, et al. (2012) Stathmin1 Reproduce Oncogénicos clases, y es un blanco de microARN-223 en el cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10.1371 /journal.pone.0033919

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 17 de octubre de 2011; Aceptado: 19 Febrero 2012; Publicado: 28 Marzo 2012

Derechos de Autor © 2012 Kang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio con el apoyo de UGC Fondo de Investigación Colaboración (CUHK04 /CRF /08) y el sitio web del proveedor de fondos es http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es una de las enfermedades más comunes y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en todo el mundo. Cuenta con la incidencia más alta en China, Japón, Corea y Asia oriental. El pronóstico global es pobre, con una tasa de supervivencia a 5 años por debajo del 30% en la mayoría de los países [1]. Varios factores de riesgo potenciales incluyen dieta alta en sal, el tabaquismo, la baja ingesta de frutas y verduras, la gastritis crónica con glandularatrophy y metaplasia intestinal, y Helicobacter pylori (H. pylori)
infección. El resultado clínico de los H. pylori
la infección se ha demostrado ser influenciado por diversos factores genéticos, particularmente H. pylori
-virulence genes asociados tales como cag
A, vac
A, Hielo | A y bab
A [2]. H. pylori
infección también se sabe que inducen la expresión de la enzima ciclooxigenasa pro-inflamatoria (COX-2), que muestra la expresión regulada positivamente en el cáncer [3] gástrico. Estudios anteriores han documentado la importancia de las alteraciones genéticas y epigenéticas de oncogenes, genes supresores de tumores y genes de reparación de falta de coincidencia en el desarrollo de cáncer gástrico. Protocadherin 10 [4], la muerte asociada a la proteína quinasa [5], proteína relacionada con frizzled secretada [6] y el proliferador de peroxisomas gamma activado por receptor [7] se ha demostrado que han reducido la expresión y función de supresor de tumor en la carcinogénesis gástrica. Por otro lado, la proteína de matriz nuclear asociada a ácido reguladas retinoico [8] y sí asociada a la proteína 1 [9] eran ambos upregulated y ejercer la función oncogénica en el desarrollo de tumores.

Stathmin1 (STMN1), también conocida como oncoproteína 18, es una importante proteína de microtúbulos desestabilización citosólica, que desempeña un papel fundamental en el proceso de la mitosis a través de la regulación de la dinámica de los microtúbulos, y una variedad de otros procesos biológicos [10]. Alto nivel de expresión STMN1 se asocia con un mal pronóstico en diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer de mama [11], [12], el cáncer de próstata [13], el mesotelioma maligno [14], el cáncer de cuello de útero [15], y el carcinoma de células escamosas de esófago [16] . En 2010, Jeon et al. informó por primera vez que STMN1 sobre-expresión se correlacionó positivamente con metástasis en los ganglios linfáticos y puesta en escena avanzado y la invasión vascular, y negativamente con la supervivencia libre de recurrencia en el tipo difuso carcinoma gástrico [17]. El mismo grupo demostró el papel oncogénico de STMN1 en el cáncer gástrico por inhibición in vitro
de proliferación, migración y la invasión en las líneas celulares gástricas golpeando STMN1 abajo usando siRNA, y in vivo la inhibición de la
el crecimiento de tumores de xenoinjertos en ratones desnudos de siRNA transfección.

Regulación de la expresión STMN1 por miR-223 se ha demostrado en el carcinoma hepatocelular por nuestro estudio anterior [18]. Los micro-ARN son una clase de moléculas de ARN de una sola hebra de 21-23 pares de bases de longitud y regulan la expresión de genes diana mediante interacciones de apareamiento de bases específicas entre miARN y las regiones no traducidas de los ARNm específicos [19]. MiRNAs funcionarían como oncogenes o supresores tumorales en cánceres humanos y se utilizan potencialmente como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico, novedosos y dianas terapéuticas. En el cáncer gástrico, incluyendo varios miRNAs miR-143 y -145 [20], el miR-141 [21], el miR-31 [22] y miR-106a [23] están regulados a la baja, mientras que algunos miRNAs oncogenéticas como miR-21 y miR-27a [24] son ​​upregulated.

Este estudio tiene como objetivo investigar el papel funcional de STMN1 en el desarrollo del cáncer gástrico y mecanismos de regulación de STMN1 en el cáncer gástrico.

resultados

Sobre regulación de STMN1 en líneas celulares de cáncer gástrico y las muestras de cáncer gástrico primario

la expresión de mRNA STMN1 fue mayor en todas las 9 líneas celulares de cáncer gástrico que el tejido gástrica normal como se muestra en la Fig. 1A. análisis de transferencia Western confirmó la regulación de la proteína STMN1 en 11 líneas celulares de cáncer gástrico (Fig. 1B). Hasta reguladas expresión de la proteína STMN1 se observó en 4 de cada 5 adenocarcinomas gástricos primarios comparan con la mucosa gástrica no tumoral correspondiente (Fig. 1C). QRT-PCR se realizó para investigar el nivel de expresión de ARNm STMN1. En el adenocarcinoma gástrico primario, 28 de 50 casos (56%) mostraron más de 1,5 veces sobre regulación de la expresión de ARNm STMN1 en el tejido tumoral en comparación con la mucosa no tumoral correspondiente. El nivel medio de expresión de ARNm STMN1 fue significativamente mayor en las muestras tumorales que en las contrapartes no cancerosos ( p = 0,040
, Fig. 1D).

STMN1 expresión se correlaciona con mal pronóstico en tipo de cáncer gástrico difuso

la inmunohistoquímica se realizó para evaluar la expresión de la proteína STMN1 en 111 primarias muestras de adenocarcinoma gástrico. La expresión de la proteína STMN1 fue localizada principalmente en el citoplasma de las células tumorales (Fig. 2A). inmunorreactividad positiva se observó en 96 adenocarcinomas gástricos (86,5%). Entre esos tumores STMN1-positivo, 40 mostraron fuerte (3+), 37 mostraron intermedio (2 +) y 19 mostraron débil (1+) STMN1 tinción. estudio previo ha demostrado que la expresión STMN1 estaba regulada negativamente por el gen supresor de tumores TP53 [25]. Por lo tanto, se evaluó la expresión de la proteína p53 por inmunohistoquímica y exploramos su correlación con el nivel de expresión STMN1. la expresión de p53 nuclear aberrante se encontró en 51 (45,9%) de los adenocarcinomas gástricos y más frecuentemente en el tumor positivo STMN1 (50,0%) que tumor STMN1-negativas (20,0%) ( p
= 0,03). Las características clínico de 111 pacientes con adenocarcinoma gástrico y la asociación con la expresión STMN1 se muestran en la Tabla 1. Los tumores STMN1-positivos tenían más probabilidades de ser encontrado en el grupo de edad ( p
= 0,07) y se asocia con p53 expresión nuclear ( p
= 0,03), el análisis univariante indicó que la vejez ( p Hotel < 0,036), la histología con la componente difusa ( p = 0,012
), etapa ( p Hotel < 0,0001), el estadio T ( p = 0,012
), el estadio N ( p Hotel < 0,0001), M fase ( p
< 0,0001) y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos ( p Hotel < 0,0001) correlacionado con una baja supervivencia específica de la enfermedad. Por análisis de riesgos proporcionales de Cox de regresión multivariante, sólo la edad ( p Hotel < 0,0001) y la etapa ( p Hotel < 0,0001) se asociaron de forma independiente con la supervivencia específica de la enfermedad (Tabla 2). En el tipo de adenocarcinoma gástrico difuso, la expresión STMN1 se asoció con la edad avanzada ( p = 0,043
), estadio T ( p
= 0,004) y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos ( p
= 0,046). La expresión de STMN1 de tipo difuso adenocarcinoma gástrico se asoció con la supervivencia específica de la enfermedad más pobres mediante el análisis univariante ( p = 0,01
, Fig. 2B).

El silenciamiento de STMN1 inhibe el fenotipo agresivo in vitro

regulación al alza frecuente de STMN1 ARNm y proteínas en tumores gástricos sugirieron un potencial papel oncogénico de este gen. Desmontables de STMN1 por la interferencia de ARN pequeño (ARNip) bajó marcadamente ARNm y proteínas (Figura 3A.) Y la proliferación celular reducida significativamente en células AGS y MKN7 como se ha demostrado mediante ensayos de MTT ( p Hotel < 0,001, Fig. 3B). mediada por siRNA STMN1 efecto supresor de crecimiento se confirmó adicionalmente mediante el ensayo de formación de colonias monocapa dependiente de anclaje. Se observó una reducción significativa de los números de colonias en las células transfectadas con siRNA STMN1, en comparación con los controles revueltos en cultivo monocapa (redujo a 49,2% y 68,4% de los controles revueltos en AGS y MKN7 respectivamente; p
< 0,001, la Fig. 3C)

en los ensayos de la motilidad celular, una reducción significativa en el fenotipo invasivo a través de la cámara de Boyden recubierta con Matrigel ( p
<.. 0,001, figura 3D) se demostró en STMN1 células AGS y MKN7 siRNA-transfectadas (reducido a un 51,6% y el 46,8% de los controles de mucho revuelo en AGS y MKN7, respectivamente). En ensayos de migración celular usando Transwell soportes permeables, una disminución significativa en el número de células que migran a través de la membrana microporosa ( p
< 0,001, Figura S1) se encontró en STMN1 siRNA transfectadas las células AGS y MKN7 (reducido a 65,9% y el 42,7% de los controles de mucho revuelo en AGS y MKN7, respectivamente), lo que sugiere siSTMN1 podría inhibir la capacidad de migración de células de cáncer gástrico
.

Desde que se observó un efecto inhibidor del crecimiento en las células transfectadas siSTMN1, se analizaron las transfectantes para los parámetros del ciclo celular utilizando citometría de flujo. Veinticuatro horas después de la transfección, se observó acumulación de células G1 en transfectantes siSTMN1 en comparación con los controles scramble siRNA (Fig. 4A). Las células en la fase G1 se aumentaron de 47,5% a 53,7% en AGS, 38,0% a 43,4% en MKN7, y 30,1% a 40,1% en SGC7901 células. Y esto fue acompañado con una disminución de células en fase S. De acuerdo con la detención del ciclo celular que se encuentra en el análisis de citometría de flujo, se observó una reducción significativa de la fosfo-Rb (S807 /811), en transfectantes siSTMN1 (Fig. 4B). Por otra parte, siSTMN1 podría inducir la apoptosis tardía en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico probados, AGS, MKN1, BGC823 y SGC7901, que estuvo representado por un aumento de PARP escindida (Fig. 4B). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el nivel de p-AKT (S473) y p-Stat3 (T705) entre siSTMN1 y control negativo transfectadas.

siSTMN1 inhibe el crecimiento del tumor gástrico in vivo

para investigar más a fondo el efecto de STMN1 en el crecimiento in vivo Red de tumor gástrico, siSTMN1 y células de cáncer gástrico scramble transfectadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho e izquierdo dorsal de ratones desnudos , respectivamente. Dado que las células AGS y MKN7 no forman xenoinjertos en ratones desnudos, se utilizó SGC7901 células de in vivo
estudio. siSTMN1-transfectante formó tumores más pequeños en el flanco dorsal derecho que los controles revueltos en el flanco dorsal izquierdo 3 semanas después de la inyección ( p
. < 0,01, Fig 4C).

STMN1 es un aguas abajo objetivo de miR-223 en el cáncer gástrico

Como se predijo por TargetScan, el potencial de miR-223 sitio de unión se encuentra en el STMN1 3'UTR (posición 12-18 de STMN1 3'UTR). La expresión de miR-223 se downregulated en 9 líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con el tejido epitelio gástrico normal (Fig. 5A). La expresión de miR-223 se correlacionó negativamente con la expresión de la proteína STMN1 ( p
= 0,05). Se evaluó además la expresión de la proteína STMN1 por inmunohistoquímica y el nivel de miR-223 de QRT-PCR en 31 muestras primarias de cáncer gástrico. Los tumores con mayor STMN1 inmunoreactividad (puntuación de 2+ y 3+) mostraron una tendencia no significativa hacia una miR-223 menor nivel de expresión ( p = 0,137
, Fig. 5B).

Para demostrar el potencial efecto supresor de miR-223 en la expresión STMN1, transfectadas de miR-223 a líneas celulares de cáncer gástrico AGS y MKN7. MIR-223 suprime STMN1 ARNm y la expresión de proteínas en ambas líneas celulares ( p
< 0,001, Fig 5C.). Adición de miR-223 bloqueador rescató la expresión de la proteína en STMN1 MKN7 células, lo que sugiere el efecto supresor fue inducida específicamente por el miR-223 (Fig. 5D). Se llevaron a cabo ensayos de reportero de luciferasa duales para estudiar la interacción entre miR-223 y STMN1 3'UTR (Fig. 5E). Las construcciones de reportero que contiene predijeron o sitios de unión mutadas fueron co-transfectadas con el miR-223 imitan a MKN28 células, una línea celular de cáncer gástrico con la expresión relativamente baja STMN1 endógeno. MiR-223 ejerce fuerte efecto inhibidor sobre STMN1 3'UTR (49,7%, p Hotel < 0,001). El efecto inhibidor fue eliminado cuando la región de la semilla se eliminó (mutante 1), o aliviada cuando 4 nucleótidos en la región de la semilla se mutaron. (67,6%, p
< 0,001, Mutant 2)

Discusión

en este estudio, hemos demostrado la sobre regulación de la expresión STMN1 tanto en mRNA y los niveles de proteína en los adenocarcinomas gástricos en comparación con el epitelio gástrico normal. El resultado sugiere que STMN1 podría tener la función oncogénica en la tumorigénesis gástrico. STMN1 se ha informado de que un biomarcador de pronóstico en varios tipos de cáncer incluyendo el cáncer de colon [26], carcinoma de células escamosas de esófago [16], carcinoma hepatocelular [27], [28], [29], [30] y el carcinoma de células escamosas orales [31]. Hemos demostrado que la expresión STMN1 asociado con el grupo de edad de edad, estadio T avanzada, la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos, y un tiempo de supervivencia específica de la enfermedad más corto en el tipo difuso adenocarcinoma gástrico. En consonancia con este hallazgo, Jeon et al. informó de que STMN1 podía predecir mal pronóstico en el tipo difuso de cáncer gástrico y correlacionar con invasión vascular [17].

STMN1 regula la dinámica de microtúbulos mediante la promoción de la despolimerización de los microtúbulos y la prevención de la polimerización de heterodímeros de tubulina. La inhibición de la expresión STMN1 conduce a la acumulación de células en las fases G2 /M y se asocia con anormalidades severas huso mitótico y la dificultad en la salida de la mitosis [10]. STMN1 también media los efectos de p27 (Kip1) sobre la motilidad celular [32]. En las células del sarcoma [33] y el cáncer de pulmón de células no pequeñas [34], STMN1 estimula la motilidad celular en ya través de la matriz extracelular in vitro
y aumentó el potencial metastásico in vivo
. En líneas celulares de cáncer gástrico pobremente diferenciado SNU638 y SNU16, siRNA inducida por la represión STMN1 podría suprimir la proliferación de células in vitro
y in vivo
[17]. En este estudio, mostramos que siRNA desmontables de STMN1 inhibe la proliferación celular y la formación de colonias dependiente de anclaje, la invasión y deterioro de la capacidad de migración, la detención en G1 y la apoptosis inducida tarde en líneas celulares de cáncer gástrico. Además, demostró que inhibe siSTMN1 in vivo
el crecimiento del cáncer gástrico línea celular SGC7901. la inhibición funcional de STMN1 redujo fácilmente la proliferación celular y el fenotipo invasivo, lo que sugiere un papel protumorigénicos de STMN1 en el cáncer gástrico.

miR-223 es un miARN conservadas evolutivamente que se informó inicialmente en granulopoyesis y la diferenciación mieloide [35]. La expresión de miR-233 podría ser impulsada por los factores de transcripción mieloides, PU.1 y C /EBP [36]. Se podría regular varios genes diana tales como MEF2C [37], un factor que promueve la proliferación transcriptive progenitor mieloide. También juega un papel esencial durante la diferenciación de los osteoclastos [38], y podría servir como un biomarcador potencial para el cáncer recurrente de ovario [39] y la sepsis [40]. Hemos informado anteriormente de que STMN1 será un objetivo putativo de miR-223 en el carcinoma hepatocelular [18]. En este estudio, se observó una miR-223 bajo nivel de expresión en líneas celulares de cáncer gástrico y una relación inversa entre el miR-223 y expresión de proteínas STMN1. Por ensayos de reportero de luciferasa, que confirmó la interacción específica entre el miR-223 y STMN1 3'UTR en células de cáncer gástrico. El efecto de modulación negativa de miR-223 se fundamenta en un nivel de proteína STMN1 reducido significativamente en líneas celulares de cáncer gástrico después de miR-223 re-expresión. Los resultados apoyan que STMN1 es un objetivo putativo de miR-223 en células de cáncer gástrico. Curiosamente, la sobreexpresión de miR-223 no alteró la proliferación celular y la apoptosis (Figura S2A & 2B), pero la motilidad celular inducida significativamente en células de cáncer gástrico (Figura S2C). En consonancia con este hallazgo, un estudio reciente demostró que el miR-223 promueve la motilidad celular a través de regulación a la baja de post-transcripcional de EPB41L3 supresor tumoral en células de cáncer gástrico [41]. Mientras que una sola miARN puede apuntar múltiples genes, múltiples genes miARN puede regular un solo gen. La identificación mecánica molecular exacta de cómo un determinado miARN contribuye a los cambios fenotípicos sigue siendo difícil de alcanzar.

La inactivación del gen supresor de tumores TP53 es los eventos moleculares más comunes y estudiado con mayor frecuencia en el cáncer humano. Se ha informado de que p53 mediada la represión de la actividad del promotor STMN1, resultando en la regulación negativa de la expresión STMN1 y G2 /M detención en el ciclo celular [25], [42]. Se ha aceptado generalmente que salvaje proteína de tipo p53 no es detectable por inmunohistoquímica porque es inestable y tiene una relativamente corta vida media. proteína p53 mutante acumulado en el núcleo es relativamente estable y tiene una vida media más larga, lo que hace que sea detectable por inmunohistoquímica. Por lo tanto, una inmunorreactividad fuerte y difuso es generalmente indicativa de p53 mutante [43]. Se evaluó el estado de p53 en el adenocarcinoma gástrico mediante técnicas de inmunohistoquímica y se encontró que la inmunorreactividad de p53 aberrante asociado con una mayor expresión STMN1. Por tanto, es plausible que la sobreexpresión de STMN1 podría, en parte, debido a la inactivación del gen supresor tumoral p53 en el cáncer gástrico.

En conclusión, hemos demostrado la regulación de STMN1 en el adenocarcinoma gástrico y la expresión se correlaciona con mal la supervivencia específica de la enfermedad en el cáncer gástrico de tipo difuso. La propiedad oncogénico de STMN1 en la tumorigénesis gástrica fue confirmada por estudios funcionales. Además, demostró que la expresión de STMN1 estaba regulada negativamente por el miR-223 en células de cáncer gástrico. Nuestro hallazgo sugiere que STMN1 podría servir como marcador pronóstico y una posible diana terapéutica para el tipo adenocarcinoma gástrico difuso.

Materiales y Métodos

línea celular y cultivo celular

Once gástrica líneas celulares de cáncer, MKN28, KATO-III, MKN45, SNU16, snu1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, se obtuvieron ya sea de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD, EE.UU.), RIKEN Banco de células (Tsukuba, Japón) o como un regalo del Instituto de Enfermedades Digestivas (DDI) del hospital Príncipe de Gales. Estas líneas celulares se cultivan en RPMI 1640 (GIBCO) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, GIBCO UE), 100 U /ml de penicilina y estreptomicina 10 mg /ml en una atmósfera humidificada de 5% de CO _{2 a 37 ° C.}

clínicos muestras de adenocarcinoma gástrico

Un total de 111 muestras de adenocarcinoma gástrico fueron recuperados del banco de tejidos del anatómico y Patología celular, Prince of Wales hospital, Shatin, Hong Kong. Se recogieron otros 5 pares de tumores primarios y tejidos no tumorales adyacentes durante la cirugía de pacientes sin ninguna terapia neoadyuvante. Las muestras se congelaron inmediatamente en -80 ° C para el análisis molecular más. Las muestras de biopsia de 50 pares de cáncer gástrico y la mucosa no canceroso correspondiente fueron amablemente proporcionados por IDD del Hospital Príncipe de Gales. El estudio ha sido aprobado por la Universidad Conjunta China de Hong Kong-Nuevos territorios del este Cluster Clínica Comité de Ética de Investigación, Hong Kong (CREC Ref. Nº 2009.521) y todos los participantes por escrito el consentimiento informado para la recogida de muestras y su posterior análisis.

la extracción de RNA, QRT-PCR y microARN QRT-PCR

la extracción total de ARN se realizó utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se midió por NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). De alta capacidad de cDNA de transcripción inversa Kits (Applied Biosystems) se utilizaron para la síntesis de ADNc. Por RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR), PCR TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) se aplicó para STMN1 (Sentido: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; antisentido: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; sonda: Applied Biosystems, 185528556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). El nivel relativo de expresión se normalizó con deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) y se calcula utilizando el método 2∧ (-Delta Delta Ct). miARN ensayos TaqMan (Applied Biosystems) se utilizaron para cuantificar los niveles de expresión de miR-223 madura. El ARN total se transcribe invertida por MultiScribe (Applied Biosystems) en la mezcla de reacción que contiene tallo-bucle miR-específico cebador inverso transcriptive. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y los espacios en blanco de agua se incluyeron como controles negativos.

transferencia de Western e inmunohistoquímica

La proteína se extrajo a partir de líneas celulares de cáncer gástrico y tejidos primarios pareadas utilizando tampón de lisis RIPA con proteinasa inhibidor. La concentración de proteína se midió por el método de Bradford (Bod-Rad) y 20 g de proteína se mezcla con 2 x tampón de carga SDS se cargaron por carril, separados por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 12%. proteína STMN1 se detectó con un anticuerpo policlonal anti-STMN1 (Cell Signaling,ŏ2, 1:1000). Otros anticuerpos son de Señalización Celular comercialmente, PARP escindida (Asp214) (κ1, 1:1000), fosfo-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), fosfo-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) y fosfo-STAT3 (T705) (Β5, 1:2000).

La inmunohistoquímica se realizó en 4 secciones micras de espesor a partir de especímenes fijados en formalina y embebidos en parafina. Después de-la depilación con cera en xileno y etanol graduado, las secciones se incubaron en 3% H solución _{2O 2 durante 25 minutos para bloquear las actividades de peroxidasa endógena y, posteriormente, se sometió a microondas en tampón de citrato para la recuperación de antígeno. Los anticuerpos primarios (1:25 para STMN1 de la señalización celular y 1:100 para p53 de DAKO) se incubaron a 4 ° C durante la noche y el desarrollo cromógeno se ha realizado mediante el sistema EnVision (DAKO). La expresión citoplasmática de STMN1 se evaluó mediante la asignación de una puntuación proporción y una puntuación de intensidad. La puntuación proporción fue de acuerdo con la proporción de células tumorales con tinción positiva citoplásmica (0, ninguno; 1, < = 10%; 2, 10 a < = 25%; 3, > 25 a 50%; 4, > 50%). La puntuación de la intensidad fue asignado por la intensidad media de células positivas tumorales (0, ninguno; 1, débil; 2, intermedio; 3, fuerte). La puntuación citoplasmática de STMN1 fue el producto de las puntuaciones de proporción e intensidad, que varía de 0 a 12. La expresión citoplasmática se clasificó en negativa (puntuación 0), 1+ (puntuación de 1 a 3), 2+ (puntuación 4-6), y 3+ (puntuación de 7-12). la expresión de p53 nuclear en > 10% de las células tumorales se anotó como la sobreexpresión aberrante}

STMN1 ensayos funcionales

La transfección de STMN1 siRNA y control de mezcla aleatoria (QIAGEN) se realizó utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (. Invitrogen). La proliferación celular se evaluó utilizando CellTiter 96 de la célula no radiactivos Ensayo de proliferación (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de formación de colonias en cultivos monocapa, las células transfectadas con siRNA STMN1 o control de mezcla aleatoria se cultivaron durante 10 días. Las células fueron fijadas con 70% de etanol durante 15 minutos y se tiñeron con 2% de cristal violeta. se contaron las colonias con más de 50 células por colonia. Los experimentos se repitieron por triplicado.

La célula ensayos de invasión se realizaron utilizando BD Biocoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences). Las células transfectadas se sembraron en la cámara superior en un medio de cultivo que contiene 1% de FBS, con medio completo (que contiene 10% de FBS) que se añade a la cámara inferior. Después de 24 horas de incubación a 37 ° C, las células que invadieron a través de la membrana de Matrigel se fijaron con metanol al 100% durante 2 minutos y se tiñeron con azul de toluidina al 1% durante otros 2 minutos. Para el análisis de las estadísticas, las células en la parte inferior de la membrana se contaron a partir de 5 campos microscópicos aleatorios (aumento original x 400). Cada experimento se realizó por triplicado, y el valor medio se expresa a partir de 2 experimentos independientes.

La célula de ensayos de migración se realizaron usando Transwell Apoyos permeable (Corning, NY). Las células se recogieron a partir de placas de cultivo de 24 horas después de la transfección, se lavaron tres veces con medio de cultivo y se resuspendieron. A continuación, se añadió 300 ul de la suspensión de células (5 x 10 ^{4 células) en los cultivos polarizados, con 500 ul de medio de cultivo que contiene 10% de FBS en la cámara inferior. Después de 24 horas de incubación a 37 ° C, las células que podrían migrar a través de la membrana microporosa se fijaron con metanol al 100% durante 2 minutos y se tiñeron con azul de toluidina al 1% durante otros 2 minutos. Para el análisis de las estadísticas, se contó el número de células vinculada en 3 campos de vista de cada cámara al azar y tomamos el número de células promedio de cada campo.}

El análisis de citometría de flujo para la detención del ciclo celular

Para el ciclo celular análisis, AGS, MKN7 y SGC7901 células se recolectan en el momento de 24 horas después de la transfección en placas de 6 cm. Antes de la transfección, las células se sometieron a inanición durante 12 horas para la sincronización. Las células se recogieron usando PBS frío y se fijaron en etanol al 70% frío durante la noche en 4 ° C y se trataron con 1 ng /ml de RNasa A durante 10 minutos a 37 ° C. El ADN celular se tiñó con 15 ng /ml de yoduro de propidio (PI) durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad. Las células entonces fueron ordenados por FACS Calibur citómetro de flujo (Becton Dickinson, CA) y los perfiles del ciclo celular se determinaron utilizando el software ModFitLT (Becton Dickinson, San Diego, CA). Los experimentos se repitieron dos veces por separado.

En vivo
tumorigenicidad estudio

SGC7901 células (2 × 10 ^{6cells en suspensión en 0,1 ml de PBS) transfectadas transitoriamente con siScramble y siSTMN1 se inyectaron por vía subcutánea en el flanco dorsal de nueve 4 semanas de edad, macho Balb /c ratones desnudos (siSTMN1 en el lado derecho y las células de control negativo a la izquierda). Los xenoinjertos fueron sacados y el diámetro del tumor se midió y documentados al final de semana 3. El volumen del tumor (mm 3) se estimó midiendo el diámetro más largo y más corto del tumor y el cálculo de la siguiente manera: volumen = (diámetro más corto ) 2 × (diámetro más largo) x 0,5. El manejo de los animales y todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad China de Hong Kong.}

ensayos de reportero de la luciferasa y la transfección de miR-223

El miR-223 en el supuesto sitio de unión la región 3 'no traducida (3'UTR) del STMN1 se clonó en el vector de PMIR-INFORME (Ambion Inc). Dos constructos mutantes se generaron por cualquiera de eliminación o mutaciones de la secuencia de semillas complementaria a la región de unión de miR-223, como se describe anteriormente [18]. El constructo de luciferasa de luciérnaga fue co-transfectadas con el control de vectores de luciferasa de Renilla en MKN28 células en presencia de cualquiera de miR-223 moléculas sintéticas o scramble control de miARN. Duales ensayos de reportero de luciferasa (Promega) se llevaron a cabo 36 horas después de la transfección. Lipofectamine 2000 se utilizó para la transfección de miR-223 en células AGS y MKN7.

El análisis estadístico

Se utilizó la prueba t de Student para comparar la diferencia en el comportamiento biológico entre las células STMN1 desmontables y scramble siRNA células transfectadas, y entre el miR-223 transfectadas y scramble miARN células transfectadas. Correlación entre la expresión STMN1 y parámetros clínico se evaluaron mediante la prueba de rangos de Spearman Rho no paramétrico de. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar las tasas de supervivencia para cada variable. Las equivalencias de las curvas de supervivencia fueron probados por las estadísticas de log-rank. Para aquellas variables que son estadísticamente significativas se encuentran en el análisis univariante de supervivencia ( p Hotel < 0,05), se empleó el modelo de riesgos proporcionales de Cox con las estadísticas de coeficiente de riesgo para evaluar más a ellos para el análisis multivariado de la supervivencia. Todos los análisis estadístico se realizó con el software SPSS (versión 16.0; SPSS Inc). Una de dos colas p-valor
de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo y el p-valor
menos de 0,001 fue considerado altamente significativo.

Apoyo a la Información
Figura S1.
siSTMN1 inhibe la migración celular en el cáncer gástrico. imágenes representativas de células AGS y MKN7, que se transfectaron con siSTMN1 y siScramble luego migran a través de una membrana microporosa (**, p Hotel < 0,001)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919. s001 gratis (TIF)
figura S2. Francia El estudio funcional de miR-223 en líneas celulares de cáncer gástrico. (A) MTT ensayos de proliferación de AGS, MKN7 y SGC7901 después de miR-223 transfección (4 días después de la transfección). (B) Análisis de transferencia Western de PARP escindida en células AGS y MKN7 en 24 horas después de la transfección de miR-223. se muestran imágenes de invasión (C) Representante de Matrigel de AGS, MKN7 y SGC7901. miR-223 mejora la capacidad de invasión de células de células de cáncer gástrico (*, p
< 0,01; **, p
< 0,001). El número de células se contó en 3 campos de visión al azar y las barras de error representa las desviaciones estándar
doi:. 10.1371 /journal.pone.0033919.s002 gratis (TIF)

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