PLOS ONE: let-7 MicroARN familia es selectivamente secreta en el medio extracelular a través de exosomas en una célula de cáncer gástrico metastásico Line

Extracto

Antecedentes

Los exosomas juegan un papel importante en la célula a la comunicación células beta, las células para transferir moléculas exosomal incluyendo las proteínas diana, ARNm, y microARN (miARN) por una vía endocitosis similar. miRNAs son pequeñas moléculas de ARN no codificante en promedio 22 nucleótidos de longitud que regulan numerosos procesos biológicos, incluyendo la patogénesis del cáncer y median gen regulación a la baja por la orientación ARNm para inducir la degradación del ARN y /o interferir con la traducción. Informes recientes implican que miRNAs se pueden detectar de forma estable en el plasma y el suero circulante desde miRNAs son empaquetados por exosomas a ser protegidos de la degradación del ARN. Por lo tanto, perfiles de miRNAs exosomal están en necesidad de aclarar la señalización intercelular y descubrir un nuevo marcador de enfermedad también.

Metodología /Principales conclusiones

Los exosomas se aislaron a partir de líneas celulares de cáncer en cultivo y se validó su calidad por análisis de microscopía electrónica de transmisión y el Western Blot. Una de las líneas celulares de la prueba, una línea celular de cáncer gástrico metastásico, AZ-P7a, mostraron el mayor rendimiento de ARN en los exosomas liberados y forma distintiva en la morfología. Además, los ARN fueron aisladas de células y medios de cultivo, y los perfiles de estas tres fracciones miARN fueron obtenidos mediante el análisis de microarrays. Mediante la comparación de las intensidades de señal de datos de microarrays y la siguiente validación mediante análisis de RT-PCR, se encontró que la familia let-7 miARN era abundante tanto en el intracelular y fracciones extracelulares a partir de células AZ-P7A, mientras que la baja metastásico AZ-521, la célula parental línea de AZ-P7a, así como otras líneas celulares de cáncer no mostró tal tendencia.

Conclusiones /Importancia

el enriquecimiento de la familia let-7 miARN en las fracciones extracelulares, en particular, en el exosomas de células AZ-p7A pueden reflejar sus características oncogénicos incluyendo la tumorigénesis y metástasis. Desde let-7 miRNAs generalmente juegan un papel supresor tumoral como la orientación oncogenes como RAS
y HMGA2
, nuestros resultados sugieren que las células liberan AZ-P7A let-7 miRNAs a través de los exosomas en el medio extracelular para mantener su oncogénesis

Visto:. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara a, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) Let-7 MicroARN familia se segrega de forma selectiva en el medio extracelular a través de exosomas en una línea celular de cáncer gástrico metastásico. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10.1371 /journal.pone.0013247

Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Alemania |

Recibido: 14 de abril de 2010; Aceptado 10 de septiembre de 2010; Publicado: 8 Octubre 2010

Derechos de Autor © 2010 Oshima et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. El trabajo fue apoyado por una beca en cooperación con tecnología innovadora y la Investigación avanzada en Evolutional Area (área de la ciudad) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Las células secretan diferentes tipos de pequeñas vesículas de membrana. Los exosomas son una de las vesículas con 30 a 100 nm de diámetro y fisicoquímicamente distinta de otras vesículas secretadas [1]. Dentro de los exosomas, productos de los genes celulares que incluyen proteínas, ARNm, y microRNAs (miRNAs) son empaquetados y estas moléculas pueden ser transferidos a las células receptoras para entregar su señalización molecular, tal como la oncogénesis [2] - [4] y la respuesta inmune [1], [ ,,,0],5]. Los exosomas son liberados por muchos tipos de células [6], que incluyen células tumorales, células epiteliales, y células hematopoyéticas, tales como reticulocitos, linfocitos T citotóxicos, células B transformadas por el virus Epstein-Barr, mastocitos, células dendríticas, y las plaquetas. exosomas secretadas se han aislado y caracterizado in vitro
partir de líneas celulares cultivadas [7] junto con in vivo
en los fluidos corporales [7], incluyendo la sangre [8], la orina [9], la saliva [10], líquido amniótico [11], y los derrames pleurales malignos [12]. Dado que se observa en muchos tipos de células en proliferación, es concebible para exacerbar las células tumorales, como lo demuestra el aumento de su presencia en el plasma y derrames pleurales de pacientes con cáncer [8], [12]. Esta mayor presencia en los fluidos corporales no invasivos de pacientes con cáncer se ha acelerado al perfil componentes moleculares en los exosomas para el descubrimiento de marcadores tumorales clínicamente útiles y biomarcadores [3], [7], [13].

miRNAs son una clase de pequeños ARN no codificantes que están involucrados en la regulación post-traduccional de la expresión génica mediante la inhibición de la estabilidad y la traducción de los ARNm [14]. La evidencia reciente ha demostrado que las mutaciones de los genes miARN o misexpression se correlacionan con varios cánceres humanos e indican que algunos miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores tumorales [15], [16]. Para el análisis de ARN, siempre es considerar su estabilidad frente a la degradación por la RNasa. Hallazgos recientes indican que miRNAs plasma endógenas en muestras de sangre son de forma estable detectable en una forma que es resistente a la actividad de RNasa [17], evidenciado por la identificación de miRNAs en los fluidos corporales tales como la sangre [17] - [24], la orina [25], y saliva [10], [26].

células de cáncer cultivadas se han utilizado para buscar marcadores tumorales. En particular, la identificación de proteínas y péptidos secretados al medio de cultivo se ha desarrollado por la proteómica basadas-enfoque [27], [28]. En cuanto a la firma molecular en los exosomas, proteómica, así como los análisis transcriptómica se han realizado para revelar la tumorigénesis e identificar candidatos de marcadores tumorales [2] - [4], [7], [29]. Aquí, para identificar los genes miARN relacionado con la tumorigénesis y la metástasis, se realizó análisis extenso miARN en tres fracciones celulares, incluyendo células, exosomas, y el medio de células cultivadas. Clasificación de datos de estos miRNAs intracelulares y extracelulares obtenidos por el análisis de microarrays, encontramos que la familia let-7 miARN es rica en todas las fracciones de las células AZ-P7A, una línea metastásico gástrico de células de cáncer, que produce la morfología homogénea y condensada, y alta recuperación tasa de miRNAs exosomal. Estos resultados eran distintos de otras líneas celulares, incluyendo líneas celulares de cáncer de pulmón (SBC-3, NCI-H69, y DMS53), líneas celulares de cáncer colorrectal (SW480 y SW620), y AZ-521, la línea celular parental de AZ-P7a. Teniendo en cuenta que las funciones de la familia de genes miARN let-7 principalmente como genes supresores de tumores [30] para apuntar oncogenes como RAS Opiniones y alta movilidad grupo A2 ( HMGA2
) [31], proponemos que AZ -P7a selectivamente células secretan let-7 miRNAs en el medio extracelular a través de los exosomas para mantener sus propensiones tumorigénicas y metastásicas.

resultados

el aislamiento de exosomas de líneas celulares de cáncer de varios

los exosomas son producidos a partir de células interiores para el medio ambiente extracelular a través de una vía de exocitosis-como [1]. Además de los fluidos corporales tales como suero y plasma de la sangre periférica [7], [8], exosomas se encuentran en el medio de las células cultivadas [7], lo que facilita la identificación de moléculas exosomal incluyendo proteínas, mRNAs, y miRNAs para el objetivo para su uso clínico. Perfiles de tales moléculas exosomal producidas en células cancerosas cultivadas han llevado a descubrir un nuevo marcador candidato y el antígeno para el diagnóstico de cáncer y la inmunoterapia [7]. En este estudio, con el fin de perfilar miRNAs exosomal, aislamos primera exosomas de medios de cultivo de líneas de células 46 de cáncer con diferentes tipos de tejidos, que incluyen 8 para el estómago, 16 de pulmón, 5 de colon, 9 de páncreas, 3 de próstata y 5 para mama. Después las células fueron cultivadas durante 48 h, se recogieron los exosomas con una combinación de centrifugación sucesivos y el peso molecular membranas de corte como se describe en Materiales y Métodos. Su pureza de las fracciones exosomal se evaluó por análisis de microscopía electrónica de transmisión y el Western Blot. Microscopía electrónica de transmisión mostró las estructuras de membrana vesicular en forma de ida y aproximadamente dentro del tamaño de 100 nm de diámetro. Entre tres líneas celulares, SBC-3, AZ-521, y AZ-P7a, es de interés que la morfología de las células AZ-P7A fue más homogénea y condensado que otras células (Figura 1A). Inmunoelectrónica microscopía mostró que las partículas extracelulares aislados del medio de cultivo de las células AZ-P7A tenían inmunorreactividad con un anticuerpo contra CD63, una de las proteínas de la membrana exosomal, en las membranas capsulares (Figura 1B). La presencia de proteínas exosomal conocidos que incluyen CD29 /β1-integrina, AIP1 /Alix y gen de susceptibilidad tumor 101 (Tsg101) se confirmó mediante análisis de transferencia Western, mientras que una proteína localizada en el retículo endoplásmico, Bip /GRP78, fue indetectable (Figura 1C). Este resultado indica que la contaminación de material derivado de otros compartimentos celulares en las fracciones exosomal fue mínima. El rendimiento de las proteínas a partir de células exosomal AZ-P7A era 10 veces más alta que la de las células AZ-521; ~ 2,5 mg de proteínas se obtuvieron a partir de 1 × 10 ^{8 células AZ-P7A.}

El enriquecimiento de los ARN exosomal derivadas de células AZ-P7A

Tras el aislamiento, los ARN totales se aislaron de exosomal 46 líneas de células cultivadas. Curiosamente, los rendimientos de ARN a partir de células AZ-P7A eran mucho mayores que las de otras células (Figura 2A). La distribución de longitud mostró la presencia de grandes cantidades de pequeños RNAs en exosomas (panel central, la Figura 2B). Cabe señalar que existe una diferencia significativa en exosomas totales y los niveles de miARN exosomal entre los pacientes con adenocarcinoma de pulmón y los controles [8]. línea celular AZ-P7a se estableció mediante la inoculación repetida de las células parentales AZ-521 en ratones, dio como resultado un alto potencial metastásico peritoneal [32], [33]. Por lo tanto, los altos rendimientos de ARN y de proteínas, junto con las características morfológicas de las células AZ-P7A pueden atribuirse a sus altas propensiones tumorigénicas y metastásicas. Desde miRNAs se han detectado en los fluidos corporales libres de células [17] - [20], también se realizó el aislamiento directo de los ARN totales de medio de cultivo sin procedimiento para aislar los exosomas. Las cantidades de ARN totales a partir de medios de cultivo fueron generalmente mayores que las de los exosomas (Figura 2A). distribución de ARN de longitud mostró que se detectaron fracciones miARN en el rango de 10 a 40 nucleótidos de longitud en los ARN preparadas a partir de medio de cultivo (panel derecho), así como los exosomas (panel central) de las células AZ-P7A (Figura 2B). De acuerdo con el protocolo del fabricante para Bioanalyzer, picos con más de 40 nucleótidos de longitud contienen otros ARN pequeños incluyendo tRNAs en 70~90, 5S ARN ribosomal en 100, y 5.8S ARN ribosomal en 150, como se observa en la fracción intracelular (panel izquierdo) . Estos resultados sugieren que pueden existir miRNAs en el medio de cultivo fuera de la fracción exosomal aunque se cree que los ARN a ser protegidos de RNasas como ser empaquetado en exosomas. En particular, en comparación con las células adherentes, el incremento de los rendimientos de ARN era notablemente mayor en las células (NCI-H69 y Lu-135) o células flotante con poblaciones de mezcla de flotante y las células adherentes (Colo205), que puede ser reflejada por la contaminación de los ARN arrojan a partir de células lisadas que se han dejado de forma continua en los medios de cultivo.

miARN perfiles de análisis de microarrays

perfiles de miARN en las fracciones intracelular y extracelular se determinaron mediante el análisis de microarrays de siete líneas celulares de cáncer, incluyendo AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, SW620 y. Las muestras de medios de cultivo, así como exosomas proporcionadas señales de hibridación (Figura 3), lo que indica la existencia de miRNAs en estas muestras. Hasta el presente, el análisis de datos de microarrays de genes miARN entre las muestras, no se han realizado métodos claros para la normalización de la intensidad de la señal, ya que es difícil encontrar un material estándar interno adecuado [34]. Por lo tanto, los datos de microarrays miARN han sido analizados en general sin normalización, suponiendo que las cantidades totales de los ARN de entrada son constantes entre las muestras [34], [35]. En este estudio, después de promediar los datos de microarrays miARN entre dos repeticiones, que clasificó miRNAs según sus intensidades de señal. Se encontró que la familia let-7 miARN como let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7F, let-7 g, y dejar-7i se detectaron con relativamente altas señales a lo largo de la mayor parte de las fracciones intracelulares de las líneas celulares de siete (Tabla 1, Figura 3). Sin embargo, no se detectaron o pequeñas intensidades de señal para los miRNAs let-7 en las fracciones extracelulares excepto ambas fracciones extracelulares a partir de células AZ-P7A y la fracción de medio de cultivo de las células NCI-H69 (Tabla 1, Figura 3). En particular, tanto en las fracciones extracelulares de las células AZ-P7A, todos los ocho let-7 miRNAs se detectaron aunque el rango de let-7 g fue menor que otros siete let-7 miRNAs. Sobre la base de los distintos patrones de let-7 niveles de miARN entre las tres fracciones celulares, se dividió a los siete líneas celulares en tres grupos (Figura 3) de la siguiente manera; (1) AZ-P7a, las células que let-7 miRNAs se encontraron en todas las tres fracciones, (2) AZ-521, junto con SBC-3, DMS53, SW480 y SW620, las células que let-7 miRNAs se encuentran generalmente en sólo fracciones intracelulares, (3) NCI-H69, las células que let-7 miRNAs se encontraron en las fracciones intracelulares, así como en el medio de cultivo en cierta medida.

análisis RT-PCR de intracelular y extracelular let- 7 miARN familia

a continuación, realizó RT-PCR cuantitativa para los ocho let-7 miARN familia para validar los datos de microarrays. let-7 miRNAs se detectaron fácilmente en las fracciones intracelular y extracelular de las células AZ-P7A (Figura 4A) y células AZ-521 (Figura 4B). Los niveles de let-7 miRNAs por los ARN de entrada fueron en general superiores en las fracciones extracelulares de las células AZ-P7A que a partir de células AZ-521. Para la normalización de los niveles de miRNAs diana obtenidos por RT-PCR, U6 snRNA se ha usado generalmente como un control interno. Hemos observado la presencia de U6 snRNA en todas las tres fracciones de células AZ-P7A y células AZ-521 (Figura 4C) y luego se compararon los niveles de let-7 miRNAs entre las fracciones correspondientes de estas dos líneas celulares. Después de la normalización, los niveles de let-7 miRNAs incluyendo let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, y dejar-7i tanto en las fracciones de los exosomas y medios de cultivo de células AZ-521 eran rebajado en comparación con los de las células AZ-p7A. Por el contrario, no hubo gran diferencia en los niveles de la intracelular let-7 miRNAs. A continuación comparó el nivel de exosomal let-7a a partir de células AZ-P7A con los de otras líneas celulares de cáncer, incluyendo el SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 y SW620, y se encontró que sólo el nivel let-7a a partir de células SW620 era relativamente cerca (0,7 veces) al nivel de las células AZ-p7A (Figura 4E). Debe tenerse en cuenta que el nivel intracelular de let-7a a partir de células SW620 fue de aproximadamente 3,5 veces más abundante que la de células AZ-P7A. Sobre la base de estos resultados, se asumió localización de let-7a en las fracciones de las células y los exosomas (Figura 5), ​​y se realizó un análisis adicional. Normalizado por los niveles U6, se calcularon los niveles relativos de let-7a envasados ​​en exosomas por los niveles de celular let-7a (figura 4F). Como resultado, la cantidad de exosomal let-7a fue mucho mayor en las células AZ-P7A que otros seis células, lo que sugiere que las células AZ-P7A fueron selectivamente y activamente secretados let-7 de la familia de los genes miARN en el medio extracelular a través de los exosomas.

Discusión

En el presente estudio, que reveló que la familia let-7 miARN se secreta en el medio extracelular a través de transporte exosomal, que era específica para una línea celular de cáncer gástrico metastásico, AZ-P7a. let-7 miARN familia de humano se compone de 10 secuencias de 13 precursores [30]. En general, let-7 miRNAs actúan como un supresor de tumores dirigidos por oncogenes tales como RAS
y HMGA2 Restaurant and let-7 miRNAs están regulados a la baja en muchos cánceres de órganos sólidos [31]. células AZ-P7A poseen una capacidad metastásica con diseminación peritoneal en ratones nude [32], [33]. Por lo tanto, proponemos que la liberación exosomal de let-7 miRNAs en los resultados de entorno extracelular en disminución del efecto anti-tumorigénico dentro de las células, que conducen a mantener su oncogénesis y la invasividad. Por otro lado, let-7 miRNAs menos frecuentemente desempeñan una función oncogénica, debido al aumento de la expresión por hipometilación en el locus let-7 [36] o la orientación de la caspasa-3 ARNm [37]. En este caso, la liberación exosomal de let-7 miARN puede causar la transformación en las células diana mediante la transferencia de sus propiedades oncogénicas.

En los pacientes con cáncer de pulmón, los niveles totales de exosomas y sus miRNAs aumento en comparación con los controles [8 ]. Se ha demostrado que los exosomas tumorales inducen mecanismo de escape inmune en los cánceres por espontánea apoptosis de células T [38] - [40]. En este estudio, hemos demostrado la morfología homogénea y enriquecimiento de RNAs en exosomas de células AZ-P7A metastásicos. Esto puede ser reflejada por su tumorigenicidad.

miRNAs son muy estables en el plasma sanguíneo y suero ya protegida contra RNasas [17]. Por lo tanto, hace que los niveles de miRNA probados para el diagnóstico clínico como marcadores tumorales y biomarcadores. ¿Cómo sucede? Chin et al. han sugerido dos hipótesis para el origen de miRNAs en muestras de sangre circulante; puede ser debido a un resultado de la muerte celular del tumor y la lisis o la liberación por las células tumorales en el microambiente extracelular de los vasos sanguíneos [19]. Por el contrario a las células adherentes, se observó que las cantidades de los ARN totales en los medios de cultivo fueron relativamente más alto que en exosomas de células con flotante propiedad, tales como NCI-H69, Lu-135, y Colo205. Este incremento probablemente dio lugar a la contaminación de ARN a partir de células muertas en los medios de cultivo.

En el descubrimiento de nuevos marcadores tumorales en la sangre y biomarcadores, ómicas enfoques, incluyendo la proteómica y transcriptómica se llevan a cabo ya sea por análisis directo de muestras de sangre o de aplicaciones de los perfiles en muestras de tejido. Existen informes contradictorios si si los perfiles de los miARN y mRNAs en el torrente sanguíneo son paralelas con el perfil de tumor. La firma de miRNAs exosomal refleja la de las células tumorales procedentes de pacientes con adenocarcinoma de pulmón [8] y el cáncer de mama [41]. Por otro lado, Skog et al. han demostrado que el análisis de microarrays de mRNA derivados de las células de glioblastoma y los exosomas correspondientes mRNAs detectados exclusivamente en microvesículas reveladas, especulando que los ARNm se localizan en una región específica del citoplasma [3]. Además, Tanaka et al. han demostrado que el nivel de miR-92a disminuyó en el plasma sanguíneo de pacientes con leucemia aguda, mientras que su expresión fuerte se encontró en las muestras de tejido [24]. Nuestros resultados sobre enriquecimiento selectivo de let-7 miARN familia de AZ-P7A exosomas en forma con este último caso las células derivan. A menos moléculas diana son miRNAs derivados de células tumorales circulantes, sugiere una cuidadosa investigación son necesarios para utilizar perfiles de miARN en muestras de tejido para la detección en muestras de suero o plasma.

Desde exosomas se producen en las células hematopoyéticas, así como células epiteliales , la sangre circulante contiene exosomas derivados de ambos tipos de células. En general, para investigar los perfiles exosomal de proteínas, mRNAs, y miRNAs en suero y plasma, exosomas derivados de tumores con características epiteliales se separan de los de las células hematopoyéticas [8], [13]. Esto se realiza usando purificación por afinidad con anticuerpos contra moléculas tales como EpCAM que expresan en la superficie de las células epiteliales. Nuestros resultados que no fueron los mismos niveles de let-7 miARN familia entre los exosomas y medios de cultivo de células AZ-P7A sugieren que estos niveles de miRNA se pueden medir sin aislar exosomas a partir de muestras clínicas tales como suero y plasma.

conclusión, este estudio demostró que let-7 miARN familia es rica en exosomas de una línea celular de cáncer gástrico metastásico, las células AZ-p7A. Desde let-7 miRNAs están involucrados en el proceso de proliferación [31], su secreción exosomal pueden desempeñar un papel importante en la tumorigénesis y metástasis.

Materiales y Métodos

Cultivo de células

líneas celulares de cáncer de estómago humano (AZ-521, MKN45, KATOIII, y NUGC-3) células de cáncer de páncreas humano, líneas celulares de cáncer de pulmón humano (SBC-3, Lu-65, Lu-135, y KNS-62), y ( traje-2) fueron adquiridos de la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación. células del estómago humano con cáncer (SNU-1), líneas celulares de cáncer de pulmón humano (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, y HCC827), las células humanas mesotelioma (MSTO-H211), líneas celulares de cáncer colorrectal humano (SW480, SW620, Colo205, LoVo, y HCT116, líneas celulares de cáncer de páncreas humano (BxPC-3, ASPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, y Capan-2), las líneas de próstata humano de células de cáncer (PC-3, SU145, y LNCaP), y líneas celulares de cáncer de mama humano (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, y MDA-MB-231) se adquirieron de la American Type Culture Collection. MKN28 (células de cáncer de estómago humano) y PSN-1 (células de cáncer de páncreas humano) se adquirieron de los Laboratorios Immuno-Biological y Colección Europea de Cultivo celular, respectivamente . líneas celulares de cáncer de estómago humano, AZ-p7a [32], [33] y MKN45P [42] fueron regalo de los Dres. Yutaka Yonemura y Yoshio Endo. En las células AZ-521 y AZ-p7A, no se observaron productos de RT-PCR durante 14 retrovirus incluyendo HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, VIH1, VIH2, y ADV tipo 1 (datos no mostrados), con exclusión de la infección por estos retrovirus tanto en las líneas celulares . Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina, y 0,1 mg /ml de estreptomicina.

Producción y aislamiento de exosomas

Las células adherentes se sembraron a 150 mm-platos en el número apropiado de células que van desde 3 × 10 ^{6 a 1 × 10 7 células por placa, mientras que las células flotantes se inocularon en 75 cm 2-matraz a 2~2.5 × 10 7 células por matraz. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 completo de 25 ml y 50 ml para los platos y matraces, respectivamente, durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO _{2, se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se incubaron 48 h en fenol medio RPMI-1640 sin rojo (Sigma-Aldrich) que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor que se agote previamente contaminar microvesículas por centrifugación durante la noche a 100.000 x g. Los exosomas se aislaron de las células totales que van de 6 × 10 7 a 3 × 10 8 células como se describe anteriormente [29]. Brevemente, se recogió medio de cultivo y se centrifugó a 800 xg durante 5 min y adicional 2.000 × g durante 10 min para eliminar las células levantadas. El sobrenadante se sometió a filtración sobre un filtro de membrana de polietersulfona 0,1 micras de poro (Corning) para eliminar los restos celulares y grandes vesículas, seguido de concentración por un 100.000 Mw de corte de membrana (Centriplus-70, Millipore). El volumen de sobrenadante se redujo de aproximadamente 250 a 500 ml a aproximadamente 30 ml. El sobrenadante se ultracentrifugó a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C utilizando rotor 70Ti (Beckman Coulter). Los sedimentos resultantes se resuspendieron en 6 ml de PBS y ultracentrifugar a 100.000 xg durante 1 hora a 4 ° C utilizando rotor 100Ti (Beckman Coulter).}}

Transmisión microscopía electrónica

Los exosomas sedimentadas se mezclaron con cantidades iguales de recién preparada glutaraldehído 2% en PBS, se incubaron durante la noche a 4 ° C, después se fijaron con 1% de tetróxido de osmio en PBS a 4 ° C durante 2 h, y se deshidrataron en una serie graduada de etanol. Después de la deshidratación, las muestras se transfirieron a óxido de propileno y se embebieron en resina epoxi Quetol 812 (Nisshin EM). Ultrathin secciones se cortaron con Ultracut UCT (LEICA), teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se observaron con el JEM-1230 Microscopio Electrónico (JEOL). Inmunoelectrónica análisis microscópico se realizó de acuerdo con el método descrito por Xiao et al. [43] con modificaciones menores. En breve, los exosomas se mezclaron y se incubaron con anticuerpo CD63 monoclonal de ratón anti-humano (catálogo no. Sc-51662, Santa Cruz) durante 1 h a temperatura ambiente. La muestra se dejó caer sobre la superficie de membrana de una malla de cobre (colodión /carbono recubierto 400 de malla, Nisshin EM) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, inmunoelectrónica conjugado de cabra anti-IgG de ratón (nº de catálogo. EM.GMHL15, BBInternational) diluido a las 1:20 se dejó caer sobre la membrana. La malla de cobre se flotó en las gotitas con su superficie de la membrana boca abajo a temperatura ambiente durante 30 min. Después del lavado con PBS, las gotas de acetato de uranilo se puso sobre la superficie de malla de cobre y se tiñeron a temperatura ambiente durante 30 s. Los exosomas con negro partículas de oro coloidal en las membranas capsulares se marcaron como positivos en el microscopio electrónico de transmisión.

análisis de transferencia de Western

Las células y fracciones exosomal se lavaron, se resuspendieron en un tampón de lisis [7,5 M urea (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiourea (Sigma-Aldrich), 12,5% de glicerol (Wako), Tris 50 mM, 2,5% n-octil-beta-D-glucósido (Sigma-Aldrich), Tris 6,25 mM (2- carboxietil) fosfina clorhidrato (Sigma-Aldrich), 1,25 mM de inhibidor de proteasa (catálogo no. P2714, Sigma-Aldrich)], y se incubó durante 1 h a 4 ° C usando el rotador RT-50 (TAITEC). Después de centrifugación a 14.000 xg durante 60 min a 4 ° C, se recogió el sobrenadante y la concentración de proteína se determinó por el ensayo de proteínas Bradford Kit (Bio-Rad). Una parte de las proteínas (10 mg) se desnaturalizaron por ebullición en tampón de muestra de Laemmli, se ejecutan en 10% de geles de SDS-poliacrilamida, y se transfirió a membranas de PVDF Immobilon-P (0,45 micras de tamaño de poro, Millipore). Las transferencias se bloquearon durante 1 h con leche en polvo no grasa 5% en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,01% de Tween 20). Después de bloquear las membranas se incubaron con cada anticuerpo primario o antisuero incluyendo suero de conejo anti-Tsg101 (catálogo no. T5951, Sigma-Aldrich), suero anti-AIP1 /Alix cabra (catálogo no. Sc-49268, Santa Cruz), monoclonal de ratón anti-CD29 /β1-integrina (catálogo no. sc-610468, BD Biosciences), y anticuerpo monoclonal de ratón anti-Bip /GRP78 (catálogo no. 610979, BD Biosciences) a una dilución de 1:200 durante 1 h a temperatura ambiente. Las transferencias se incubaron a continuación con el correspondiente anticuerpo secundario anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Laboratories) a una dilución de 1:2,000 durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas específicas se visualizaron usando el sistema ECL (GE Healthcare) y la FUJIFILM luminiscentes analizador de imágenes LAS3000 (Fuji Film). El peso molecular de proteínas se dedujo utilizando la proteína Precision Plus Standards (Bio-Rad Laboratories).

Aislamiento de ARN

Para el aislamiento de ARN a partir de medio de cultivo, se sembraron las células como se describió anteriormente. 48 h después de crecer, se recogió y se centrifugó a 800 xg durante 5 min medio de cultivo y adicional 2.000 × g durante 10 min. El sobrenadante se sometió a filtración sobre un filtro de membrana de polietersulfona 0,22 micras de poro (Corning), seguido de concentración con un 5,000 Mw corte de membrana (Centricon Plus-70, Millipore). El volumen final de sobrenadante fue de aproximadamente 10-20 ml de volumen original de 250-500 ml. El sobrenadante se mezcló con un volumen igual de reactivo de lisis QIAzol (Qiagen) y siguió el procedimiento para el aislamiento de ARN se describe a continuación. ARN total fue aislado de las células, los exosomas, o medios de cultivo utilizando el Kit miRNeasy Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Para eliminar el ADN genómico, 40 g de ARN celular total se incubaron con 40 unidades de DNasa RQ1 RNasa libre (Promega) a 37 ° C durante 30 min en presencia de 40 unidades de RNasin Plus RNasa inhibidor (Promega). Para ARN total de exosomas y medios de cultivo, todas las cantidades de productos en bruto se trataron en el mismo procedimiento, excepto el uso de 5 U de DNasa. El ARN se purificó usando el Kit de Limpieza de RNeasy MinElute (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) y se evaluaron utilizando el Agilent Small RNA Kit y los Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Análisis de microarrays

Para miARN perfiles, 100 ng y 20 ng de ARN totales celulares y extracelulares, respectivamente, fueron marcado con fluorescencia usando el reactivo de marcado completa miARN y Kit Hyb (Agilent Technologies) según el protocolo del fabricante (Agilent miARN microarrays versión 2.2). El análisis exhaustivo de los genes miARN se realizó utilizando el kit de microarrays miARN Humano (8 × 15 K) versión 3.0 (Agilent). Las señales de hibridación se detectaron con el escáner de microarrays de ADN (Agilent Technologies). Las imágenes escaneadas fueron analizados utilizando el software de extracción de características y análisis de datos de Agilent se realizó utilizando el software GeneSpring GX (Agilent Technologies). Los datos analizados en este manuscrito se han depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

transcripción reversa (RT) y RT-PCR cuantitativa para el análisis de miARN

niveles cuantitativos miARN se determinaron utilizando en tiempo real de RT-PCR con el Applied Biosystems 7900 Sequence Detection System HT (Applied Biosystems), TaqMan Expresión génica de ensayo (Applied Biosystems) para el consumo humano let-7a (ID ensayo 000377), let-7b (ID ensayo de 002.619), let-7c (ID ensayo de 000.379), let-7d (ID ensayo 002283 ), let-7e (ID ensayo de 002.406), let-7F (ID ensayo 000382), let-7 g (ID ensayo de 002.282), let-7i (ID ensayo de 002.221), y U6 snRNA (ID ensayo 001973) como control endógeno . Diez ng de ARN total se sometieron a transcripción inversa con TaqMan® PCR Universal Master Mix No AmpErase (Applied Biosystems) y los respectivos reactivos TaqMan® para genes diana. RT-PCR se realizó en un volumen total de 20 l mezcla de reacción de acuerdo con el protocolo del fabricante. La amplificación se llevó a cabo como sigue: 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 60 s. Las muestras se analizaron por triplicado como biológica replicar o cuadruplicado como técnica de reproducir. Los niveles de miARN se definieron a partir del ciclo umbral (Ct), el método comparativo Ct, y la normalización por el nivel de U6 snRNA en cada muestra. Doblar aumentos o disminuciones en cada nivel de miRNA de las líneas celulares analizadas fueron determinados por referencia al nivel de la línea celular AZ-P7a.

Reconocimientos

Agradecemos a los miembros del Centro de Investigación del Cáncer del Instituto de Shizuoka por sus valiosas sugerencias. También se agradece a los Dres. Yutaka Yonemura y Yoshio Endo para el regalo de líneas celulares AZ-P7A y MKN45P.

• PLOS ONE: una expresión genética de quimiorresistencia adquirida al cisplatino y fluorouracilo quimioterapia de combinación en pacientes con cáncer gástrico
• PLOS ONE: factor inducible por hipoxia 1α Determina el cáncer gástrico Quimiosensibilidad través de la modulación de p53 y NF-kB