Plos ONE: Stathmin1 Igra onkogeni Vloga in da je cilj MicroRNA-223 v želodca Cancer

Povzetek

Stathmin1 (STMN1) je kandidat onkoproteina in prognoze dvojno podajo na več vrst raka. Cilj raziskave je bil analizirati svoje izražanje in bioloških funkcij v rakom želodca. Izraz STMN1 je bila ocenjena s QRT-PCR, Western Blot in imunohistokemijo. Biološka funkcija STMN1 je bila določena s testi MTT orožja, oblikovanje eni plasti kolonije in celično invazijo testi, ki uporabljajo majhno vmešavanje RNA tehniko v želodcu raka celičnih linijah. Prav tako smo raziskali ureditev STMN1 izražanja microRNA-223. STMN1 je bila povečana pri želodčnih raka celičnih linij in primarnih želodčnega adenokarcinoma. STMN1 pozitivni tumorji so bili bolj verjetno, da je mogoče najti v starostne skupine in je povezano s p53 jedrsko izražanja. V difuzni tip želodčnega adenokarcinoma je STMN1 izraz povezana s starostjo ( p
= 0,043), stopnja T ( p
= 0,004) in bezgavko metastaze ( p
= 0,046). Izražanje STMN1 v difuzna tipa adenokarcinomom želodca je bila povezana s slabim bolezni specifično preživetje, ki ga univariantne analize ( p
= 0,01). STMN1 rasklapanje v AGS in MKN7 celičnih linij zatreti širjenje ( p
< 0,001), zmanjšana tvorba enoplastna kolonija ( p
< 0,001), zaviral celic invazija in migracije sposobnost ( p
< 0,001) in povzroča G1 faza zastoj. siSTMN1 lahko zavre tudi rast celic in vivo
( p
. < 0 01). Končno smo potrdili, da je STMN1 določena domnevna tarča navzdol miR-223 pri raku želodca. Naše ugotovitve podprl onkogenega vlogo STMN1 raka želodca. STMN1 lahko služi kot prognostični označevalec in potencialnega terapevtskega cilja za rakom želodca

Navedba. Kang W, Tong JHM, Chan AWH, Lung RWM, Chau SL, Wong QWL, et al. (2012) Stathmin1 Igra onkogeni Vloga in da je cilj MicroRNA-223 želodčnega raka. PLoS ONE 7 (3): e33919. doi: 10,1371 /journal.pone.0033919

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 17. oktober 2011; Sprejeto: 19. feb 2012; Objavljeno: 28. marec 2012

Copyright: © 2012 Kang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija podpira UGC raziskovalnega sklada sodeloval (CUHK04 /CRF /08) in na spletni strani financer je http://www.ugc.edu.hk/eng/rgc/fund/crf_202011_2012.htm. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden izmed najpogostejših malignih obolenj in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu. Ima najvišjo incidenco na Kitajskem, Japonskem, v Koreji in vzhodni Aziji. Splošni prognoza je slaba s hitrostjo 5-letno preživetje pod 30% v večini držav [1]. Več možnih dejavnikov tveganja vključujejo prehrano visoke soli, kajenje, nizek vnos sadja in zelenjave, kronični gastritis z glandularatrophy in intestinalno metaplazijo in Helicobacter pylori (H. pylori)
okužbo. Klinični izid H. pylori
okužba Dokazano je, da se pod vplivom različnih genetskih dejavnikov, predvsem H. pylori
-virulence povezanih genov, kot so OAS
A, vac
A, ice
A in bab
A [2]. H. pylori
okužba je tudi znano, da inducira ekspresijo pro-vnetne ciklooksigenaze encima (COX-2), ki kaže navzgor regulirana ekspresijo v raka želodca [3]. Prejšnje študije so dokazale pomembnost genetskih in epigenetskih sprememb v onkogeni, zaviralnih genov in neusklajenost popravila genov pri razvoju raka želodca. Protocadherin 10 [4], smrt povezan protein kinaza [5] izločajo povezanih frizzled protein [6] in peroksisomskim proliferatorjem aktiviran gama receptorja [7], so pokazale, da imajo zmanjšano ekspresijo in funkcijo zaviralnih v želodcu karcinogenezo. Po drugi strani, retinojska kislina regulirano jedrsko matrika povezan protein [8] in da povezano protein 1 [9] sta oba molekul in izvajajo onkogenega funkcije v razvoj tumorjev.

Stathmin1 (STMN1), prav tako znana kot onkoproteina 18, je pomemben citosolno-mikrotubulsko destabilizacije protein, ki igra ključno vlogo v procesu mitoze z regulacijo dinamike mikrotubulov, in številnih drugih bioloških procesov [10]. Visoka stopnja STMN1 izražanja je povezano s slabo prognozo na različnih rakavih bolezni, vključno raka dojke [11], [12], rak prostate [13], maligni mezoteliom [14], raka materničnega vratu [15] in ezofagealni karcinom skvamoznih celic [16] . V letu 2010, Jeon et al. najprej poročali, da STMN1 prekomerno ekspresijo bila v pozitivni korelaciji z bezgavkah metastaz in napredno načrtovanja in žilne invazije, in negativno s preživetjem ponovitve bolezni pri difuzni tip raka želodca [17]. Ista skupina je pokazala onkogenega vlogo STMN1 pri raku želodca s vitro
inhibicijo proliferacije, migracije in invazije v celičnih linijah v želodcu, ki ga trkat STMN1 dol z siRNA in in vivo
zaviranje ksenogenskega rast tumorja v golih miših, ki ga siRNA transfekciji.

Regulacija STMN1 izražanja miR-223 je bila dokazana v karcinomom jetrnih celic, ki jih prejšnji raziskavi [18]. Mikro RNA so razred posameznih RNA molekul 21-23 baznega para v dolžino in urejanje ciljnih genov izraz s posebnimi interakcij izhodiščnem združevanju med miRNA in neprevedenih regijah ciljnih mRNA [19]. MiRNAs bo deloval kot onkogeni ali tumorskih razbijal pri človeških rakih in se lahko uporabljajo kot novih diagnostičnih in prognostičnih biomarkerjev in terapevtskih ciljev. Pri raku želodca, več miRNAs vključno miR-143 in -145 [20], miR-141 [21], miR-31 [22] in miR-106a [23] so navzdol reguliranih, medtem ko nekatere oncogenetic miRNAs kot miR-21 in miR-27a [24] so molekul.

Ta študija je namenjen za preiskovanje funkcionalno vlogo STMN1 pri razvoju raka želodca in mehanizme regulacije STMN1 na raka želodca.

Rezultati

Up-regulacijo STMN1 v želodcu raka celičnih linij in primarnih želodčnih vzorcev rakom

izraz STMN1 mRNA je bila višja v vseh 9 želodčnih linij rakavih celic kot običajni želodčnega tkiva, kot je prikazano na sliki. 1A. Western blot analizo potrdili regulacijo navzgor STMN1 proteina v 11 želodčnega raka celičnih linijah (sl. 1B). Up-urejeno STMN1 beljakovin izražanja so opazili pri 4 od 5 primarnih želodčnih adenokarcinome primerjali z ustreznimi ne-tumorskega želodčne sluznice (sl. 1C). QRT-PCR smo izvedli, da ugotovi raven izražanja STMN1 mRNA. V osnovnem adenokarcinomom želodca, 28 50 primerov (56%) je pokazala več kot 1,5-krat regulacijo navzgor STMN1 mRNA izražanja v tumorskem tkivu v primerjavi z ustreznim ne-tumorskega sluznico. Srednja stopnja STMN1 mRNA izražanja je bila bistveno višja pri vzorcih tumorjev, kot da je v ne-rakavih kolegi ( p
= 0.040, sl. 1D).

STMN1 izraz ujema s slabo prognozo v difuzna vrsta raka želodca

Imunohistokemija je bila izvedena za oceno beljakovin izraz na STMN1 v 111 osnovnih želodčnih vzorcev adenokarcinom. Protein Izraz STMN1 je predvsem lokalizirana v citoplazmi tumorskih celic (sl. 2A). Pozitivna radioinkorporacijo so opazili pri 96 želodčnih adenokarcinomov (86,5%). Med temi STMN1 pozitivnih tumorjev, 40 je pokazala močna (3+), 37 je pokazala vmesna (2+) in 19 je pokazala šibko (1+) STMN1 madeže. Prejšnja študija je pokazala, da je bil izraz STMN1 negativno ureja zaviralnih genov TP53 [25]. Zato smo ocenili ekspresijo proteina p53, ki imunohistokemijo in raziskati njeno skladnost z ravni STMN1 izražanja. Abnormalnih jedrsko p53 je bilo v 51 (45,9%), želodčnih adenokarcinoma in pogosteje STMN1 pozitivnega tumorja (50,0%) kot STMN1-negativne tumorja (20,0%) ( p
= 0,03). V clinicopathologic značilnosti 111 bolnikih z adenokarcinomom želodca in povezavi z STMN1 izražanja so prikazani v tabeli so bile 1. STMN1 pozitivni tumorji bolj verjetno, da bo na voljo v starostno skupino ( p
= 0,07) in je povezano s p53 jedrska izraz ( p
= 0,03), Univariatna analiza je pokazala, da starost ( p
< 0,036), histologijo z difuzno komponento ( p
= 0,012), stopnja ( p
< 0,0001), stopnja T ( p
= 0,012), N faza ( p
< 0,0001), M faza ( p
< 0,0001) in prisotnost na bezgavkah metastaze ( p
< 0,0001), povezana s preživetjem slabo specifične bolezni. Z multivariatno Cox sorazmernih tveganj regresijsko analizo, le starost ( p
< 0,0001) in stopnja ( p
< 0,0001) so neodvisno povezana s preživetjem za posamezne bolezni (tabela 2). V difuzni tip adenokarcinomom želodca, je STMN1 izraz povezan s starostjo ( p
= 0,043), stopnja T ( p
= 0,004) in prisotnost na bezgavkah metastaz ( p
= 0,046). Izražanje STMN1 v difuzna tipa adenokarcinomom želodca je bila povezana s slabšim preživetjem za posamezne bolezni, ki ga univariantne analizo ( p
= 0,01, sl. 2B).

utišanje STMN1 zavira agresivni fenotip vitro

Pogosto Povecanje od STMN1 mRNA in beljakovin v želodčnih tumorjev predlagal morebitno onkogenega vlogo tega gena. Rasklapanje od STMN1 motnje malih RNA (siRNA) opazno znižala mRNA in raven beljakovin (slika 3A.) In bistveno zmanjša proliferacije celic v AGS in MKN7 celic, kot je razvidno iz MTT testi ( p
< 0,001, sl. 3B). STMN1 siRNA posredovano rast omejevalno učinek je nadalje potrdila pritrditve, odvisno enoplastna kolonije oblikovanja testa. Ugotovljeno je bilo pomembno zmanjšanje števila kolonij v celicah transfekciji s STMN1 siRNA, v primerjavi s kontrolno skupino žoga v eni plasti kulture (zniža na 49,2% in 68,4% kontrol žoga v letnem pregledu rasti in MKN7 zaporedju; p
< 0,001, . Slika 3C)

v celični gibljivosti testih, znatno zmanjšanje invazivnega fenotipa skozi Matrigel obložene Boyden komori ( p
<.. 0,001, slika 3D) so dokazali v STMN1 -siRNA transfekcije AGS in MKN7 celice (zmanjšanje za 51,6% in 46,8% kontrol žoga v letnem pregledu rasti in MKN7 zaporedju). V migracije celic testih uporabljajo Transwell prepustna podpira, znatno zmanjšanje števila celic, ki prehajajo skozi mikroporozno membrano ( p
< 0,001, slika S1) je bilo ugotovljeno v STMN1 siRNA transfektirali AGS in MKN7 celice (zmanjša 65,9% in 42,7% kontrol žoga se AGS in MKN7 oz), kar kaže, siSTMN1 lahko zavira migracije sposobnost želodca rakavih celic.

Ker je bila rast zaviralni učinek opazili pri siSTMN1 transfekciji celic, smo analizirali transfektanti za parametre celičnega ciklusa, ki uporabljajo citometrijo pretoka. Štiriindvajset ur po transfekciji smo opazili kopičenje G1 celic siSTMN1 transfektanti v primerjavi s kontrolno skupino z pehanje siRNA (sl. 4A). Celice v G1 fazi je bilo v letnem pregledu rasti v MKN7 v SGC7901 celic povečal iz 47,5% na 53,7%, 38,0% na 43,4% in 30,1% na 40,1%. In je to povezano z upadom S faze celic. V skladu z aretacijo v celičnega ciklusa, ugotovljene v analizi pretočno citometrijo smo opazili precejšnje zmanjšanje fosfo-Rb (S807 /811) v siSTMN1 transfektanti (sl. 4b). Poleg tega bi lahko siSTMN1 povzroči pozno apoptozo v štirih želodčnih raka celičnih linijah testiranih, AGS, MKN1, BGC823 in SGC7901, ki je bila zastopana s povečanjem cepi-PARP (sl. 4b). Vendar pa ni bilo bistvene razlike najdemo v ravni p-AKT (S473) in p-stat3 (T705) med siSTMN1 in negativno kontrolo transfektirane.

siSTMN1 zavira rast tumorja želodca in vivo

da bi še dodatno raziskati vpliv STMN1 na vivo
rasti tumorja želodca, siSTMN1 in bitki transfektirali želodca rakave celice so subkutano injiciranega v desno in levo hrbtnega bok golih miškah oz. Ker AGS in MKN7 celice ne tvorijo presadkov pri golih miših, smo uporabili SGC7901 celice za in vivo
študija. siSTMN1-transfektant oblikovali manjše tumorje na desni hrbtnega roba kazenskega prostora, kot nadzora žoga na levi hrbtne bok 3 tedne po injiciranju ( p
. < 0,01, slika 4C).

STMN1 je na nižji stopnji ciljna miR-223 želodčnega raka

Kot napovedujejo Targetscan, potencial miR-223 vezavno mesto je bilo v STMN1 3'UTR (položaj 12-18 od STMN1 3'UTR). Izraz miR-223 je navzdol reguliranih v 9 želodčnih raka celičnih linijah v primerjavi z običajnim želodčne epitelijskega tkiva (sl. 5A). Izražanje miR-223 je negativno povezana z izrazom STMN1 beljakovin ( p
= 0,05). Nadaljevali smo ocenili beljakovin izražanje STMN1 z imunohistokemijo in raven miR-223 s QRT-PCR v 31 osnovnih želodca vzorcev raka. Tumorji z višjo STMN1 radioinkorporacijo (točkovni 2+ in 3+) je pokazala ne-pomemben trend nižji miR-223 izražanja ravni ( p
= 0,137, sl. 5B).

Na dokazati potencialno omejevalno učinek miR-223 na STMN1 izražanja, smo transfektirali MIR-223 do želodca linije AGS rakavih celic in MKN7. MIR-223 zatreti STMN1 mRNA in izražanja proteinov v obeh celičnih linijah ( p
< 0,001, slika 5C.). Dodajanje miR-223 oken rešili beljakovin izraz na STMN1 v MKN7 celicah, kar kaže na to omejevalno učinek je bil posebej jih povzroča miR-223 (sl. 5D). Dvojna luciferazne reporter analize so bile izvedene za študij interakcije med miR-223 in STMN1 3'UTR (sl. 5E). Novinar konstrukti, ki vsebuje ali je napovedano mutirani veznih mest so sodelovali transfekciji s miR-223 posnemajo do MKN28 celic, ki raka celične linije želodca z relativno nizko endogenega STMN1 izražanja. MIR-223, ki deluje močno zavira STMN1 3'UTR (49,7%, p
< 0,001). Zaviralni učinek je bil izločen, ko je bila regija seme izbrisan (Mutant 1) ali ublažiti ko so mutiran 4 nukleotidov na območju semena. (67,6% p
< 0,001, Mutant 2)

Pogovor

V tej študiji smo dokazali up-ureditev STMN1 izražanja tako v mRNA in ravni beljakovin v želodcu adenokarcinome v primerjavi z običajnim želodčnega epitela. Posledica tega je predlagal, da bi morali STMN1 onkogenega funkcijo v želodcu tumorigeneze. STMN1 Poročali so, da je prognostični biomarker pri različnih vrst raka, vključno z rakom debelega črevesa [26], požiralnika ploščatocelični karcinom [16], hepatocelularni karcinom [27], [28], [29], [30] in ustni karcinom skvamoznih celic [31]. Dokazali smo, da STMN1 izraz, povezan z starostne skupine, v poznejši fazi T, prisotnost bezgavk metastaz, in krajši specifičnih bolezni času preživetja v difuzni tip adenokarcinomom želodca. V skladu s to ugotovitvijo, Jeon et al. poročali, da bi lahko STMN1 napovedujejo slabo prognozo pri difuzni tip raka želodca in v korelaciji z vaskularna invazija [17].

STMN1 ureja dinamiko mikrotubulov s spodbujanjem depolimerizacijo mikrotubulov in preprečevanje polimerizacije tubulina heterodimerov. Zaviranje STMN1 izražanja vodi do kopičenja celic v G2 /M fazi in je povezan s hudimi nepravilnostmi delitveno vreteno in težave pri izstopu iz mitoze [10]. STMN1 posreduje tudi učinke P27 (Kip1) na celično motiliteto [32]. V sarkoma celic [33] in nedrobnoceličnim pljučnim rakom [34], STMN1 spodbudila celic gibljivost po in preko ekstracelularnega matriksa in vitro
in povečala metastatskega potenciala in vivo
. V slabo diferenciranih želodčni rak celičnih linijah SNU638 in SNU16, bi-siRNA povzroča STMN1 represija zaviranje proliferacije celic in vitro
in in vivo
[17]. V tej študiji smo pokazali, da siRNA rasklapanje od STMN1 zaviral proliferacijo celic in tvorbo kolonij sidrišča odvisnega, motnje invazijo in migracije sposobnosti, povzročeno G1 aretacijo in pozno apoptozo v želodcu raka celičnih linijah. Nadaljevali smo dokazali, da siSTMN1 zaviral vivo
rast raka želodca celične linije SGC7901. Funkcionalna zaviranje STMN1 takoj zmanjšal proliferacijo in invazivno fenotip, kar kaže na protumorigenic vlogo STMN1 pri raku želodca.

MIR-223 je evolucijsko ohranjen miRNA, ki je bil sprva poročali granulopoeze in mieloične diferenciacije [35]. Izraz miR-233 se lahko poganja mieloični vrsti transkripcijskih faktorjev, PU.1 in C /EBP [36]. Lahko bi urediti več ciljnih genov kot Mef2c [37], ki je transcriptive dejavnik, ki spodbuja mieloične proliferacijo matičnih celic. Prav tako igra pomembno vlogo v osteoklastov diferenciacije [38], in bi lahko služila kot potencialni biomarker za ponavljajočimi rak jajčnikov [39] in sepse [40]. Smo poročali prej, da je STMN1 cilj domnevnega navzdol miR-223 v karcinomom jetrnih celic [18]. V tej študiji smo opazili majhno miR-223 raven izražanja v želodcu raka celičnih linijah in obratno sorazmerje med miR-223 in STMN1 beljakovin izražanja. Z luciferaza novinar testi smo potrdili specifično interakcijo med miR-223 in STMN1 3'UTR v želodcu rakavih celic. Negativni modulacije učinek, ki ga miR-223 je bila podprta z bistveno zmanjšani stopnji STMN1 beljakovin v želodcu linij rakavih celic po miR-223 ponovno izražanja. Rezultati podprta, da je STMN1 določena domnevna tarča miR-223 v želodčnih rakavih celic. Zanimivo, čezmernim miR-223 ni spremenila celično proliferacijo in apoptozo (Slika S2A & 2B), vendar bistveno povzroča celične gibljivosti v želodčnih rakavih celic (slika S2C). V skladu s to ugotovitvijo, je nedavna študija pokazala, da miR-223 spodbuja celično gibljivost s post-transkripcijski downregulation od zaviralnih EPB41L3 v želodcu rakavih celic [41]. Medtem ko lahko en sam miRNA ciljati na več genov, lahko več miRNA uredi sam gen. Natančen molekularna mehanistični identifikacija kako dati miRNA prispeva k fenotipskih sprememb, še vedno nedosegljiva.

Inaktivacija zaviralnih genov TP53 je najpogostejši in najbolj pogosto študiral molekularnih dogodki v raka pri ljudeh. Ugotovljeno je bilo, da je p53 posredovano zatiranje STMN1 promotorja dejavnosti, kar je povzročilo negativno regulacijo STMN1 izražanja in G2 /M aretaciji v celičnem ciklu [25], [42]. Je bilo splošno sprejeto, da je divji tip p53 proteina ni mogoče zaznati z imunohistokemijo ker je nestabilen in ima sorazmerno krajšo razpolovno dobo. Mutant protein p53 nabrali v jedru je relativno stabilna in ima daljšo razpolovno dobo, zaradi česar je mogoče zaznati z imunohistokemijo. Zato je močan in razpršeno radioinkorporacijo je na splošno kaže mutanta p53 [43]. Ocenili smo stanje p53 v adenokarcinomom želodca s imunohistokemijo in ugotovili, da zmotne p53 radioinkorporacijo povezano z višjo STMN1 izražanja. Zato je verjetno, da čezmernim STMN1 morda delno zaradi inaktivacije zaviralnih genov p53 v želodcu raka.

Na koncu smo dokazali up-ureditev STMN1 v adenokarcinomom želodca in izraz je bilo povezano s slabim preživetje specifičnih bolezni pri raku razpršeno tipa želodca. Onkogensko lastnost STMN1 želodčnega tumorigeneze je potrdil funkcionalnih študij. Nadaljevali smo dokazali, da je bil izraz STMN1 s pokoj-223 negativno urejena v želodčnih rakavih celic. Naše ugotovitve kažejo, da bi lahko STMN1 služi kot prognostični označevalec in potencialnega terapevtskega cilja za razpršeno tipa adenokarcinomom želodca.

Materiali in metode
celična kultura

Enajst želodca

Cell linijo in rakave celične linije, MKN28, KATO-III, MKN45, SNU16, SNU1, MKN7, MKN1, NCI-N87, AGS, BGC823, SGC7901, so bili pridobljeni iz bodisi American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japonska), ali kot darilo inštituta prebavne bolezni (IDD) princa Wales bolnišnice. Te celične linije gojimo v RPMI 1640 (GIBCO), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS, EU GIBCO), 100 E /ml penicilina in 10 ug /ml streptomicina v vlažni atmosferi s 5% CO _{2 na 37 ° C.}

Klinični vzorci adenokarcinomom želodca

skupaj 111 želodca vzorcev adenokarcinom so bili pridobljeni iz banke tkiv anatomskih in Cellular patologijo, Prince of Hospital Wales, Shatin, Hong Kong. Še 5 parov primarnih tumorjev in sosednjih non-tumorskih tkiv so med operacijo pri bolnikih brez kakršnega koli neadjuvantno terapijo zbirajo. Osebki so bili takoj zamrznili v -80 ° C za nadaljnjo molekularno analizo. Biopsije primerki iz 50 parov raka želodca in ustrezno ne-rakasto sluznice je prijazno, ki jih IDD princa Wales bolnišnice. Študija je odobril Skupni kitajski University of Hong Kong-Nova ozemlja East grozda Research Ethics odbora Klinična, Hong Kong (CREC Ref. Št 2009.521) in vsi udeleženci ob predložitvi pisnega obvestila, soglasje za zbiranje vzorcev in kasnejšo analizo.

ekstrakcijo RNA, QRT-PCR in microRNA QRT-PCR

Skupaj ekstrakcijo RNA smo izvedli z uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen), v skladu z navodili proizvajalca. koncentracija RNA je bila izmerjena s NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). High-Capacity cDNA Reverse Transcription kompleti (Applied Biosystems) smo uporabili za sintezo cDNA. Za kvantitativno RT-PCR (QRT-PCR), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) je bila uporabljena za STMN1 (Sense: GAGGTCACGTGCCTCTGTTTG; protismiselna: CTGACCACACTCTGAGCACCAA; Probe: Applied Biosystems, 185528556-1, FAM-CGCTTTTGTGCGCGC). Relativni nivo izražanja je normaliziran z gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) in se izračuna z uporabo metode 2∧ (-Delta Delta CT). TaqMan Mirna testi (Applied Biosystems), so bili uporabljeni za količinsko raven izražanja odraslih pokoj-223. Total RNA je reversed prepisal MultiScribe (Applied Biosystems) v reakcijski zmesi, ki vsebuje miR specifičnih matičnih zanke povratne transcriptive premaz. Vse reakcije smo izvedli v treh izvodih in vode surovi so bili vključeni kot negativne kontrole.

Western blot in imunohistokemija

Protein je bila vzeta iz želodca raka celičnih linij in seznanjenih primarnih tkiv uporabo Ripa lize pufru z proteinaze inhibitor. Koncentracija proteina smo merili z metodo Bradfordu (BOD-Rad) in 20 ig proteina pomešamo z 2 x SDS pufra smo nanesli na stezo, ločene z 12% SDS-poliakrilamidnem gelu elektroforezo. STMN1 beljakovin je bila odkrita s poliklonalnimi anti-STMN1 protitelesa (celična signalizacija,ŏ2, 1:1000). Drugi protitelesa so od Cell Signalizacija komercialno, razklani PARP (Asp214) (κ1, 1:1000), fosfo-Rb (Ser807 /811) (΢8, 1:1000), fosfo-AKT (S473) (Ο1, 1 :1000) in fosfo-stat3 (T705) (Β5, 1:2000).

Imunohistokemija je bila izvedena v 4 mikrometrov debelih oddelkov iz-formalin fiksnih in parafinskih vgrajeni osebkov. Po de-voskanje v ksilena in razvrstijo etanola, so oddelki inkubirali pri 3% H _{2 rešitev 2O 25 minut, da blokira endogene peroksidazo dejavnosti in posledično doživel microwaving v citratnega pufra za pridobivanje antigena. Primarna protitelesa (1:25 za STMN1 od signalizacijo med celicami in 1:100 za p53 od Dako) inkubiramo pri 4 ° C čez noč in razvoj chromagen je bila izvedena s pomočjo sistema predvidevamo (Dako). Citoplazemski izraz STMN1 je bila ocenjena z vpisom rezultat delež in z oceno intenzivnosti. Rezultat je ta delež glede na delež tumorskih celic s pozitivnim citoplazemskega barvanjem (0, none, 1, < = 10%, 2, 10 < = 25%, 3, > 25 do 50%, 4, > 50%). Rezultat je intenzivnost je bila dodeljena za povprečno intenzivnost pozitivnih tumorskih celic (0, nič, 1, šibka, 2, srednja, 3, močna). Citoplazemski rezultat STMN1 je izdelek v nesorazmerju in intenzivnosti rezultati, v razponu od 0 do 12. citoplazme izraz je razdelimo v negativno (rezultat 0), 1+ (zadetek 1 do 3), 2+ (ocena 4-6), in 3+ (ocena 7-12). Jedrska izražanje p53 v > 10% tumorskih celic je dosegel kot odklonska prekomerno}

STMN1 funkcijski testi

Transfekcija STMN1 siRNA in nadzora žoga (QIAGEN) smo izvedli s pomočjo Lipofectamine 2000 transfekciji Reagent (. Invitrogen). Cell orožja je bila ocenjena s pomočjo CellTiter 96 Non-Radioaktivni celično proliferacijo testom (Promega) v skladu z navodili proizvajalca. Za tvorbo kolonije teste v enoplastnih kultur, celic, transfektiranih s STMN1 siRNA ali nadzorom žoga kultiviramo 10 dni. Celice so bile določene z 70% etanola 15 minut in obarvamo z 2% kristal vijolično. Kolonije z več kot 50 celic na kolonije so bili prešteti. Poskuse smo ponovili v treh izvodih.

Celica invasion teste smo izvedli s pomočjo BD Biocoat vdora v Matrigel Chambers (BD bioznanosti). Transficirane celice smo posejali v zgornji komori, v gojišče, ki vsebuje 1% FBS, pri kompletnem mediju (ki vsebuje 10% FBS) dodamo k spodnji komori. Po 24 urah inkubacije pri 37 ° C, so bile celice, ki napadel skozi Matrigel membrano določen s 100% metanola 2 minuti in obarvamo z 1% toluidin modrega še 2 minuti. Za analizo statistike, smo celice na spodnji strani membrane šteto od 5 naključnih mikroskopskih polj (prvotna povečava x 400). Vsak poskus smo izvedli v trojniku in srednja vrednost je bila izražena z 2 neodvisnih eksperimentov.

celične migracije teste smo izvedli s pomočjo Transwell prepustna podpira (Corning, NY). Celice smo zbrali iz kulture jedi 24 ur po transfekciji, izperemo trikrat z gojišča in ponovno suspendirali. Potem smo 300 ul celičnega suspenzije (5 x 10 ^{4 celice) dodamo v transwells s 500 ul gojitvenem mediju, ki vsebuje 10% FBS v spodnji komori. Po 24 urah inkubacije pri 37 ° C, smo celice, ki lahko prehajajo skozi mikroporozno membrano določen s 100% metanola 2 minuti in obarvamo z 1% toluidin modrega še 2 minuti. Za analizo statistike, smo šteli priloženi število celic v 3 pogled področjih vsake komore naključno in je povprečno število celic vsakega polja.}

pretočno citometrijo analiz za celičnega cikla aretacijo

Za celični cikel analiza, AGS, MKN7 in SGC7901 celice zbirajo v času 24 ur po transfekciji v 6 cm ploščah. Pred transfekciji celice doživel stradanje 12 ur za sinhronizacijo. Celice smo zbrali s pomočjo hladnega PBS in fiksna v 70% hladnim etanolom preko noči pri 4 ° C in obdelamo z 1 ng /ml RNaze A 10 minut pri 37 ° C. Celični DNA smo obarvali z 15 ng /ml propidijevim jodidom (PI) 30 minut pri 37 ° C v temi. Celice nato pa so razvrščeni po FACS Calibur pretočnim citometrom (Becton Dickinson, CA) in profilov celičnega cikla so bile določene s pomočjo ModFitLT programske opreme (Becton Dickinson, San Diego, CA). Poskuse smo ponovili dveh različnih časih.

V vivo
tumorogenosti študija

SGC7901 celice (2 x 10 ^{6cells suspendiramo v 0,1 ml PBS) prehodno transfekciji s siScramble in siSTMN1 so subkutano injicirali v hrbtnem bok devetih 4 tednov star moški Balb /c golih miših (siSTMN1 na desni strani in negativne kontrole celicah na levi strani). Je ksenotransplantati so bili ven in premer tumorja smo izmerili in dokumentira konec tedna 3. volumen tumorja (mm 3) je bila ocenjena z merjenjem najdaljšo in najkrajšo premer tumorja in izračunamo, kot sledi: Volumen = (najkrajšo premer ) 2 × (najdaljši premer) x 0,5. Ravnanje živali in vse eksperimentalne postopke je odobril odbor za živali etiko kitajske univerze v Hongkongu.}

luciferaza novinar testi in miR-223 transfekciji

Domnevna miR-223 vezavno mesto na 3 'neprevedeno področje (3'UTR) od STMN1 smo klonirali v pMIR-POROČILO vektorja (Ambion Inc.). Dva mutirana konstrukti so nastali bodisi izbris ali mutacijami komplementarno zaporedje semen na miR-223 zavezujočo regiji, kot je bilo prej [18] opisano. Kresniček luciferaze konstrukt je co-transfektirana z Renilla kontrolo luciferaza vektorja v MKN28 celic v prisotnosti bodisi sintetičnih miR-223 molekul ali žoga miRNA kontrolo. Dual luciferazne reporter testi (Promega) so bile izvedene 36 ur po transfekciji. Lipofectamine 2000 je bil uporabljen za transfekcijo miR-223 v letnem pregledu rasti in MKN7 celic.

Statistična analiza

Test Student T smo uporabili za primerjavo razlike v biološki vedenja med STMN1 rasklapanje celice in žoga -siRNA transfekcije celice, in med miR-223-transfekcije in pehanje miRNA transfekcije celice. Korelacija med STMN1 izražanja in clinicopathologic parametrov so bile ocenjene s testom rho ranga neparametrični Spearman je. Metoda Kaplan-Meier je bila uporabljena za oceno stopnje preživetja za vsako spremenljivko. Enakovrednosti krivulj preživetja smo testirali s statistiko log-ranga. Za te spremenljivke statistično značilne ugotovljeno v analizi univariantne preživetja ( p
< 0,05), je bil zaposlen Cox sorazmernih tveganj model s statistiko razmerje verjetnosti, da bi jih dodatno oceni za multivariatno analizo preživetja. Vse statistične analize smo izvedli s SPSS programske opreme (različica 16.0; SPSS Inc.). Dve zimsko p
-vrednost manjša od 0,05 smo upoštevali kot statistično značilna in p
-vrednost manj kot 0.001 je zdelo zelo pomembno.

Podpora Informacije
Slika S1.
siSTMN1 zavira migracijo celic pri raku želodca. Reprezentativni slike AGS in MKN7 celic, ki so transfekciji z siSTMN1 in siScramble nato selili skozi mikroporozno membrano (**, p
< 0,001)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033919. S001
(IOD)
Slika S2.
funkcionalno študijo miR-223 v želodcu raka celičnih linijah. (A) MTT proliferativni teste AGS, MKN7 in SGC7901 po miR-223 transfekciji (4 dni po transfekciji). (B) Western blot analiza cepi-PARP v AGS in MKN7 celic v 24 urah po miR-223 transfekciji. (C) predstavnik vdora v Matrigel slike AGS, MKN7 in SGC7901 so prikazani. miR-223 izboljšano celično invazijo sposobnost, da želodčnih rakavih celic (*, p
< 0,01; **, p
< 0,001). Število celic je bilo preštetih v 3 naključnih prikaza polj in bari napak zastopa standardnih odklonov
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033919.s002
(TIF)

• Plos ONE: Glyoxalase-I je nova Prognoza faktorjev, povezanih z Rak želodca napredovanje
• Plos ONE: The prognostični pomen apoptoze povezani biološke označevalce v kitajskih Rak želodca bolnikov