PLoS ONE: Superior antituumorivaikutuksen Nanoparticle albumiiniin sidottu Paklitakseli kokeellisen Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

Mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti ja siitä puuttuu erittäin tehokas hoito edenneen taudin. Napata-paklitakseli on uusi mikrotubulia inhiboiva sytotoksista ainetta, jota ei ole testattu mahasyövän kuin vielä. Tässä tutkimuksessa ihmisen mahasyöpä solulinjoissa AGS, NCI-N87 ja SNU16 tutkittiin. Napata-paklitakseli inhiboi solujen lisääntymistä, jonka IC50 on 5 nM SNU16, 23 nM AGS ja 49 nM NCI-N87 solujen jälkeen 72 tunnin hoito, joka oli alhaisempi kuin oksaliplatiinin (1,05 uM 1,51 uM) ja epirubisiinin ( 0,12 uM 0,25 uM). Napata-paklitakselihoidolla lisäsi ilmentyminen mitoosi-kara liittyvän fosfo-stathmin riippumatta lähtötilanteen kokonais- tai fosforyloitu stathmin tasolla, ja indusoi mitoosi solukuolemaa vahvistanut lisäämällä ilmentymistä pilkkoa-PARP ja kaspaasi-3. Jälkeen kahden viikon Nab-paklitakseli, oksaliplatiini tai epirubisiini hoidon keskimääräinen in vivo paikallinen kasvaimen kasvun estäminen oli 77, 17,2 ja 21,4 prosenttia vastaavasti (p = 0,002). Vaikutukset terapiassa kasvaimen proliferatiivisia ja apoptoottista indeksit vastasi kasvaimen kasvun estäminen tietoja, kun taas ilmaus fosfo-stathmin lisääntyi kudoksissa. Lisääntyi mediaanin eläinten eloonjäämisen jälkeen Nab-paklitakselihoidolla (93 päivää) verrattuna kontrolleihin (31 päivää, p = 0,0007), oksaliplatiinia (40 päivää, p = 0,0007) tai doketakselihoidon (81 päivää, p = 0,0416) . Vahva antituumorivaikutuksen Nab-paklitakselin kokeellisissa mahasyövässä tukee tällaisia ​​mikrotubulia estävä strategia kliinisissä sovelluksissa. Napata-paklitakselin hyöty havaittiin riippumaton fosforyloitua stathmin ilmaisun lähtötilanteessa, asettaneet kyseenalaiseksi huomioon Nab-paklitakselin käyttöön mahasyövän perustuu tähän otaksuttu biomarkkereiden.

Citation: Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior antituumorivaikutuksen Nanoparticle albumiiniin sidottu Paklitakseli kokeellisen syöpään. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10,1371 /journal.pone.0058037

Editor: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Iso-Britannia

vastaanotettu: 20 marraskuu 2012; Hyväksytty: 29 tammikuu 2013; Julkaistu: 27 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien kaikkialla maailmassa [1] - [3]. Useimmat potilaat ovat kehittyneet tai etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi [4], [5]. Oksaliplatiinia ja 5-fluorourasiilin kanssa ja ilman epirubisiinia, on tullut laajimmin käytetty hoito ensilinjan kemoterapiaa edennyt mahasyöpä [6], [7]. Tämä yhdistelmähoito on potentiaalia merkittäviä sivuvaikutuksia ja vielä kantaa rajoitettu tehoa, kun taas potilaiden ennusteeseen on edelleen synkkä kanssa mediaanielossaolosta noin 10 kuukautta [8] - [11]. Kun pyritään parantamaan selviytymisen ja vähentää myrkyllisyyttä, molekyylirakennetta täsmähoitoihin on aktiivisesti tutkitaan hoitoon mahasyövän [12].

Mikrotubulukset on pitkään pidetty tavoitteeksi käyttöä joissakin syöpälääkkeiden takia niiden yleinen merkitys jakautuvat solut ja niiden keskeinen rooli mitoosin [13] - [15]. Paklitakseli ja doketakseli ovat klassisia mikrotubulusten estäjiä jotka kohdistavat toimintansa edistämällä tubuliinin polymerisaatiota ja vakauttamiseen mikrotubulusten johtaa G2-M-faasin pysähtymisen ja mitoosi solukuolemaa [15]. Mitoosi solukuolema on tila solukuoleman esiintyvien aikana spesifisesti mitoosi vaiheiden aiheuttama DNA: ta vaurioittavat aineet ja sukkulamyrkyt /mitoosi-inhibiittorit [16], [17]; se on lähinnä kaspaasi riippuvainen, mutta alle harvinaisissa tilanteissa voi myös kaspaasi riippumattomia [18]. Paklitakseli on testattu kehittynyttä ja toistuvia mahasyövistä joiden vastausprosentti oli 43% yhdessä 5-fluorourasiilin ja foliinihapon [9], [19]. Verrattuna vastausprosentti oli 38~45% tuotti jonka oksaliplatiinia yhdistelmänä 5-fluorourasiilin ja foliinihapon, paklitakseli ei aiheuttanut ylivoimainen selviytymisen mutta aiheutti enemmän haittavaikutuksia, erityisesti iäkkäillä potilailla [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paklitakseli vaaditaan emulgoituminen liuottimilla, jotta suonensisäisesti mikä on johtanut yliherkkyysreaktioita ja mahdollisesti rajua sivuvaikutuksia potilailla [23], [24]. Nanohiukkasten albumiiniin sidottu (napata) paklitakseli on uusi albumiini-stabiloitu, cremophor-vapaa ja vesiliukoiset nanohiukkasten paklitakselista. Se on hyvin siedetty eikä yliherkkyysreaktioita laskimoinfuusion jälkeen [25]. Kliiniset ja kokeelliset tutkimukset osoittivat, että verrattuna liuotinpohjaiset paklitakseli, Nab-paklitakselilla oli korkeampi kasvain säilyttäminen, alempi myrkyllisyys [23], [26] ja voimakkaampi antituumorivaikutukset rintasyövästä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), haiman syöpä, melanooma, ja pään ja kaulan alueen syöpä [27] - [31]. Kuitenkin mahdollista roolia Nab-paklitakselin mahasyövän soluissa ei testattu vielä.

Stathmin, mikroputkeen-epävakautta fosfoproteiini, on tärkeä säätelijä mikrotubulusten polymeroitumisen ja dynamiikka [32] - [34] , ja todettiin liittyvän taksaania vastus joissakin kasvaintyypeissä kautta muuttamalla lääkkeen sitoutumisen ja viivästyttää G2-M faasimuutos [33], [35]. Stathmin esto oli synergistinen antiangiogeeninen ja antituumorivaikutus taksolin [36]. Stathmin ilmentyminen on havaittu olevan läsnä useissa erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien mahasyöpä, ja voi näin ollen edustaa houkutteleva kohde syövän hoidossa [34], [37], [38]. Jeon et ai. havaitsivat, että stathmin voisi toimia ennustetyövälineenä merkki ja potentiaalinen terapeuttinen kohde mahasyövän [37]. Fosforylaatiota stathmin alentaa mikrotubulus epävakautta, ilmiö, joka on myös katsoneet taksaania toimintaa [34].

Tässä tutkimuksessa arvioitiin antituumoriaktiivisuuksia Nab-paklitakselin ihmisen mahasyövän solujen kasvua in vitro ja in vivo. Vertasimme antituumorivaikutuksen tehoa Nab-paklitakselin muihin sytotoksisia paikallisista kasvaimen kasvua ja eläinten eloonjäämisen. Olemme myös mitattu ilmaus koko stathmin ja fosfo-stathmin in vitro ja in vivo arvioida niiden asema ennakoivaa merkkiaineiden NAB-paklitakselin tuumorin vastaista vastetta.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen mahalaukun syövän solulinjat AGS, NCI-N87 ja SNU16 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO _{2-ilmakehässä. Nab-paklitakselin hankittiin Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oksaliplatiini ostettiin Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Dosetakseli, epirubisiini ja 5-fluorourasiilin saatiin apteekista. Soluproliferaatioon reagenssi WST-1 hankittiin Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kolorimetrisellä WST-1-määritystä. Mittaus perustuu kykyyn elävien solujen pilkkomiseksi sulfonoitu tetratsoliumsuolan WST-1 (4- [3- (4-jodifenyyli) -2- (4-nitrofenyyli) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- bentseenidisulfonaatti) mitokondrion dehydrogenaasit [39]. Mahalaukun syöpäsolut (5000 solua per kuoppa) maljattiin 96-kuoppaisen levyn säännöllisesti kasvualustassa ja käsiteltiin Nab-paklitakselia, 5-fluorourasiili, oksaliplatiini ja epirubisiinia 16 tunnin inkuboinnin jälkeen. Pitoisuusalueen käyttää (1 nM 10 uM) oli verrattavissa niiden kliinisesti saavutettavissa pitoisuuksia. Kun on kulunut vielä inkuboitu 72 tuntia, 10 ui WST-1-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, jota seuraa inkubointi 2 tunnin ajan. Absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen.

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä suoritettiin virtaussytometrialla fluoresoivalla propidiumjodidilla (PI) -värjäyksellä. Soluja viljeltiin ja käsiteltiin Nab-paklitakseli, oksaliplatiini, epirubisiini ja dosetakselin 8-24 tuntia. Sitten solut kerätään ja kiinnitetään 75% etanolilla-PBS: ssa yön yli -20 ° C: ssa. Soluja sentrifugoitiin 5 min nopeudella 2000 x g. Solupelletti suspendoitiin uudelleen ja inkuboitiin 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100, ja 1 mg /ml RNaasi A: PBS: ssä 45 min ajan huoneenlämpötilassa. Sitten suspensio analysoitiin Becton Dickinson FACScan. Suhde solujen osa-G1, G1, S ja G2-M-vaiheisiin solusyklin määritettiin niiden DNA-sisällöstä.

immunosytokemiallinen analyysi

Mahalaukun syöpäsolujen (1 x 10 ^{5 solua kohti kammion) maljattiin 4-kammio slide säännöllisesti kasvualustaan. Sen jälkeen, kun 24-tunnin jälkeen solut käsiteltiin Nab-paklitakselin 16 tuntia ja sitten kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Soluja inkuboitiin CAS estopuskurilla seurasi 1 tunnin inkubointi fosfo-stathmin-vasta-aine (1:100) ja 40 minuutin inkuboinnin Cy3 (1:200 laimennos) sekundaarisella vasta-aineella. Objektilasit kiinnitettiin käyttäen kiinnitys, joka sisälsi 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fluoresenssimikroskopialla käytettiin havaitsemaan fluoresoivat signaalit käyttäen IX81 Olympus mikroskooppi on varustettu Hamamatsu Orca digitaalikamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

Western blot-analyysi

Sub-konfluentteja monokerrokset solujen hoidettiin Nab-paklitakselin, oksaliplatiini ja epirubisiinia. Solulysaateista ja kasvaimen lysaatit saatiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [40]. Supernatantit otettiin talteen sentrifugoimalla 13000 rpm, proteiini mitattiin ja yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA), ja membraanit blokattiin 1 tunnin ajan TBS-T: llä. Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla: yhteensä stathmin, fosfo-stathmin (ser38), lohkaistaan ​​poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1), pilkottiin kaspaasi-3 (kaikki Cell Signaling Technology , Beverly, MA), α-tubuliinin ja β-aktiini (molemmat valmistajalta Sigma, St. Louis, MO). Membraanit inkuboitiin sitten vastaavan HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) yhden tunnin ajan. Erityisiä vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua chemoilluminescence reagenssilla (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) on autoradiografisten elokuva.

ihonalainen kasvaimen kasvua tutkimus

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti suuntaviivat ja hyväksyttyjen käytäntöjen yliopiston Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional Animal Care ja Käytä komitea (Luvan numero 2012-0081). Eläimiä seurattiin päivittäin koko kokeen mitään merkkejä hätä. SCID-naarashiiriin (6-8 viikkoa) käytettiin vertailevan mallintamiseen ihonalaisen kasvaimen kasvua. Mahalaukun syöpäsolut (10 x 10 ^{6 NCI-N87 tai 20 x 10 6 SNU16 solua) ihon alle ruiskutettiin kuhunkin hiiri. Hiiret punnittiin kahdesti viikossa. Neljäntoista vuorokauden kuluttua kasvainsolujen injektion, kaikki hiiret oli mitattavissa kasvain (keskimääräinen kasvaimen koko 100-150 mm 3). Sitten hiiret satunnaisesti ryhmitelty (n = 6~8 per ryhmä) ja käsiteltiin vatsaontelonsisäisesti PBS: llä (kontrolli), napata-paklitakselin (10 mg /kg 100 ui PBS: ää, 2 kertaa viikossa), oksaliplatiinia (5 mg /kg 100 ul PBS, 2 kertaa viikossa), ja epirubisiini (1 mg /kg 100 ui PBS: ää, 2 kertaa viikossa) ja 14 päivää. Kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa kautta paksuus, ja kasvaimen tilavuus (V) laskettiin käyttäen kaavaa V = ½ [L x (W) 2], L = pituus ja W = leveys. Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) määritettiin kaavalla RTV = V _{n /V 0 missä V 0 ja V 1 edustavat kasvaimen tilavuuden päivän 0 ja sitä seuraavan mittauksen päivä, vastaavasti. Tuumorin kasvun esto laskettiin kaavalla (1-RTVt /RTVc) x 100%, jossa t ja c esittävät hoito ja kontrolliryhmään. Hoidon päätyttyä kaikki hiiret lopetettiin kanssa CO2, kasvaimet poistettiin, punnittiin, leikellään ja käsitellään histologista immunohistokemiallinen ja Western blot-analyysi.}}

immunohistokemiallinen analyysi

Kasvaimen kudosnäytteet kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja upotettiin parafiiniin. Kasvaimensisäistä lisääntymistä mitattiin Ki67 tuma-antigeeni värjäystä kohti valmistajan protokollaa (Abcam, Cambridge, MA). Parafinoidut kudos leikattiin (5 um), parafiini poistettiin, vedettömät ja antigeenin noudetaan. Kudoksen leikkeitä inkuboitiin CAS estopuskurilla seurasi 1 tunnin inkubointi 1:200 laimentamalla primaari Ki67 tai fosfo-stathmin-vasta-aine (1:200) ja 40 minuutin inkuboinnin Cy3 (1:200 laimennos) sekundaarisella vasta-aineella. Objektilasit kiinnitettiin käyttämällä asennusratkaisu sisälsi 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Invitrogen). Kasvaimensisäistä proliferatiivinen indeksi ja stathmin aktiivisuus arvioitiin laskemalla positiiviset solut viidestä eri suuritehoisia kentät (HPF) pidennetyn tavalla. Kasvaimensisäistä apoptoottista aktiivisuutta arvioitiin värjäämällä kudosleikkeiden kanssa "Apoptag Apoptosis Detection Kit" mukaan valmistajan (Millipore) ohjeet. Fluoresenssimikroskopia käytettiin havaitsemaan fluoresoivat signaalit käyttämällä IX81 Olympus mikroskooppi varustettu Hamamatsu Orca digitaalikamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) ja DSU spinning konfokaali kö Slidebook ohjelmistoa (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).

eläinten eloonjääminen analyysi

eläinten eloonjääminen suoritettiin käyttäen 6- 8-viikkoisen naaras-SCID [41]. Hiiriin intraperitoneaalisesti SNU16 (40 x 10 ^{6) solujen ja kehon paino mitattiin kahdesti viikossa. Kolme viikkoa sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion hiiret jaettiin satunnaisesti ryhmitelty (n = 6-8 ryhmää kohden).}

Ensimmäisessä selviytymisen tutkimuksessa, hiiriä käsiteltiin intraperitoneaalisesti PBS: llä (kontrolli), napata-paklitakselin (10 mg /kg 100 ul: ssa PBS: ää, 2 kertaa viikossa), ja oksaliplatiinia (5 mg /kg 100 ui PBS: ää, 2 kertaa viikossa) varten 2 viikkoa. Toisessa selviytymisen tutkimuksessa, hiiriä käsiteltiin intraperitoneaalisesti PBS: llä (kontrolli), napata-paklitakselin (10 mg /kg 100 ui PBS: ää, 2 kertaa viikossa), doketakseli (3 mg /kg 100 ui PBS: ää, 2 kertaa viikossa ) tai oksaliplatiinia (5 mg /kg 100 ui PBS: ää, 2 kertaa viikossa) varten 2 viikkoa. Eläinten kärsimyksiä väheni euthanizing käännyttäessä kuolemaisillaan ennalta määrättyjen kriteerien mukaan lukien nopea painon lasku tai nousu (> 15%), vika syömään tai juomaan, uupumus, kyvyttömyys pysyä pystyssä ja voiman puute. Eläinten eloonjääminen arvioitiin ensimmäisestä päivästä hoidon kuolemaan asti.

Tilastollinen

Survival analyysi arvioitiin GraphPad Prism 5 Software (GraphPad Software, San Diego, CA). In vitro solujen lisääntymisen tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Tilastollinen analyysi suoritettiin ANOVA useita vertailuihin ja Studentin t-testiä varten yksittäisten vertailuihin. Survival ryhmä Vertailu suoritettiin kautta log-rank-testi sisällä Kaplan-Meier analyysi:. Arvot p < 0,05 katsottiin edustavan tilastollisesti merkitsevä ryhmäeroja.

Tulokset

Stathmin ilmentymistä mahasyövässä soluissa

analyysi ihmisen mahalaukun syöpäsoluja AGS, NCI- N87 ja SNU16 paljasti, että kaikki kolme riviä ilmaisivat stathmin. Ei ole eroa koko stathmin ekspressio havaittiin näiden kolmen solulinjat. Expression fosfo-stathmin vaihteli solulinjojen, seuraavassa järjestyksessä: SNU16 > AGS > NCI-N87-solujen (kuvio 1A).

Nab-paklitakselin estää mahalaukun syövän solujen proliferaatiota

Nab-paklitakselin inhiboi mahasyövän solujen proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla, ja inhibitio soluproliferaatiota ilmestyi noudattaa samaa järjestystä kuin ilmentyminen fosfo-stathmin (kuvio 1 B). 100 nM pitoisuus eston soluproliferaatioon oli 94,5, 66,7 ja 41,8 prosenttia SNU16, AGS ja NCI-N87-soluissa. Nab-paklitakselia olivat suurimmat antiproliferatiivinen teho, jossa on pienin tehokas annos löytyy kaikista 3 testatuissa solulinjoissa verrattuna 5-fluouracil, oksaliplatiini ja epirubisiinia. IC _{50 Nab-paklitakselin oli 5 nM SNU16, 23 nM AGS ja 49 nM NCI-N87 soluja, mikä oli alle 5-fluouracil (6,46 uM SNU16, > 10 uM AGS ja 10.2 uM NCI-N87-solut), oksaliplatiinia (1,51 uM SNU16, 1,64 uM AGS ja 1,05 uM NCI-N87-solut) tai epirubisiini (0,12 uM SNU16, 0,16 uM AGS ja 0,25 uM NCI-N87-solut) ( Kuva 1C).}

Nab-paklitakseli aiheuttaa G2 pidätyksen ja mitoottista solukuolemaa in vitro

arvioimiseksi oleva mekanismi kasvun inhibition napata-paklitakseli, solusyklin profiilin analysoitiin. Kuten kuviossa 2A on esitetty, Nab-paklitakselin (100 nM) aiheutti G2-M-solukierron pysähtymisen SNU16 soluissa. Prosenttiosuus propidiumjodidia positiivisten solujen G2-M-faasin nousi 35,6-71,6 jälkeen 100 nM Nab-paklitakselihoidolla 12 tuntia. Samanlaisia ​​muutoksia tapahtunut AGS ja NCI-N87 solujen Nab-paklitakselin ja doketakselihoidon mutta ei oksaliplatiinin ja epirubisiinia hoito (kuviot S1 ja S2).

Effect Nab-paklitakselin mitoosi solukuolemaa, ilmaus fosfo -stathmin ja apoptoosiin liittyvien proteiinien mitattiin immunocystochemistry ja Western blot. Nab-paklitakselihoidolla aiheutti mikrotubulusten häiriöitä ja mitoottista pidätyksistä mahasyövän soluissa havaittuna tuma pirstoutuminen ja karyopyknosis (kuvio 2B). Expression fosfo-stathmin nostettiin jälkeen Nab-paklitakselihoidolla, ja suurempi ekspressio fosfo-stathmin liittyi suurempaan mitoosi pidätyksiä, nucleus pirstoutumista tai karyopyknosis, ja solukuolemaa (kuvio 2B ja 2C). Nuclear pirstoutuminen ja karyopyknosis esiintyi 16,7% solujen heikkoa ilmentymistä fosfo-stathmin mutta 95,7% solujen korkea ilmentyminen fosfo-stathmin (r = 0,672, p < 0,001). Myös todisteita aikariippuvainen lisääntyneen ekspression fosfo-stathmin by nab-paklitakselihoidolla (kuvio 2D).

tutkia, mikäli mitoosi solukuoleman aiheuttama napata-paklitakseli voitaisiin osittain korreloi apoptoosin induktio . Arviointi PARP-1 lohkominen ja kaspaasi-3 pilkkominen merkkiaineina induktion apoptoosin paljasti, että mahalaukun syövän soluissa Nab-paklitakseli, oksaliplatiini ja epirubisiinia hoito aiheutti ekspression lisääntymisen sekä pilkkoa PARP-1 ja kaspaasi-3. Tämä ilmaus apoptoosin-sukuiset proteiinit esiintyi useammin jälkeen Nab-paklitakselihoidolla verrattuna oksaliplatiinin tai epirubisiinia hoidot (kuvio 2E).

Nab-paklitakselin estää niiden kasvun mahasyövän ksenograftien

In vivo antitumor vaikutukset Nab-paklitakselin arvioitiin hiiren ksenograftimallia käyttäen SNU16 soluja. Napata-paklitakselihoidon 10 mg /kg kahdesti viikossa kahden viikon ajan oli hyvin siedetty ilman selviä merkkejä myrkyllisyydestä arvioituna hiiren painon ja päivittäin arviointi. Jälkeen kahden viikon hoitojakson, napata-paklitakselia johti tilastollisesti merkitsevä tuumorin kasvun inhibitio (p = 0,0004), joka oli suurempi kuin oksaliplatiinin (p = 0,0361) ja epirubisiini (p = 0,032) verrattuna vehikkelikontrolliin, vastaavasti (kuvio 3A). Tuumorin kasvun esto jälkeen 2 viikon hoidon Nab-paklitakselin, oksaliplatiini ja epirubisiini oli 77, 17,2 ja 21,4 prosenttia (p = 0,002), tässä järjestyksessä. Vain Nab-paklitakselihoidolla loi pienentäminen ihonalaisen vaurioiden verrattuna niiden ennalta määrättyjen kasvaimen kokoa. Kasvaimen keskipaino oli merkittävästi vähentynyt napata-paklitakselihoidolla (0,154 ± 0,075 g vs. 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), mutta ei oksaliplatiinin (0,408 ± 0,12 g) tai epirubisiini (0,46 ± 0,172 g) käsittely verrattuna ajoneuvoon ohjaus, vastaavasti (kuvio 3A). Olemme myös arvioineet antituumorivaikutukset Nab-paklitakselin NCI-N87 ksenografti hiiri paikallisia kasvaimia. Kahden viikon kuluttua hoidon, Nab-paklitakselia johti merkittävään kasvaimen tilavuuden inhibitio (p = 0,0023) (kuvio 3B), ja kasvaimen kasvun estäminen oli 72,8 prosenttia. Kasvaimen keskipaino on Nab-paklitakselihoidolla ryhmässä oli merkittävästi pienempi kuin vehikkeliryhmässä (0,093 ± 0,026 g vs. 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (kuvio 3B). Mitään merkittävää muutosta hiiren ruumiinpainon havaittiin tahansa Nab-paklitakseli, oksaliplatiini tai epirubisiini terapiaryhmät.

Nab-paklitakseli aiheuttaa mitoottista solukuolemaa in vivo

mekanismit in vivo antituumorivaikutus Nab-paklitakselin tutkittiin edelleen kasvainkudoksissa saatu SNU16 ja NCI-N87 ksenografteissa. Merkittävä kasvu ilmaus fosfo-stathmin havaittiin SNU16 (kuvio 4A) ja NCI-N87 (kuva 4B) ksenograftikasvaimissa kanssa hoidettaessa Nab-paklitakselin sekä immunohistologisilla ja Western blot -analyysit.

Kasvain kudos napata-paklitakselia käsitellyillä hiirillä näkyy vähentynyt kasvainsoluproliferaation nopeudella. Ki67 ilmaisu perustuva kasvaimensisäisenä proliferatiivisia indeksi laski 90,7% (p = 0,001) verrattuna kontrolleihin NAB-paklitakseli hoidetussa ryhmässä, kun taas 72,6% (p = 0,004) oksaliplatiini hoidetussa ryhmässä ja 67,7% (p = 0,003 ) kun epirubisiinin hoidetussa ryhmässä (kuvio 5A). Napata-paklitakseli aiheuttivat voimakkaamman eston vaikutus kasvainsoluproliferaation kuin oksaliplatiinin ja epirubisiini.

Examination apoptoosin tuumorikudoksissa paljasti, että induktion apoptoottisen indeksi oli 7,9-kertaisesti NAB-paklitakselin (p = 0,013 ), 5,7-kertaisesti oksaliplatiinia hoidetuista eläimistä (p = 0,024), ja 5,2-kertaiseksi epirubisiiniannosta hoidetussa ryhmässä (p = 0,042) päälle lähtötasolle kontrolliryhmän (kuvio 5B).

Nab-paklitakseli kasvattaa eläinten eloonjääminen

ensimmäisessä selviytymisen tutkimuksessa mediaanielossaolosta SCID-NOD hiiriin oli 24 päivää kontrolliryhmässä. Tämä lisääntynyt 86 päivää sen jälkeen, Nab-paklitakselihoidolla (p = 0,0004 versus kontrolliryhmään, p = 0,0005 vs. oksaliplatiinin ryhmä) ja 37,5 päivää oksaliplatiinihoito (p = 0,0004 versus kontrolliryhmä). Ryhmän selviytyminen alue oli myös ylivoimainen jälkeen Nab-paklitakselihoidolla (vaihteluväli: 75-95 päivää) verrattuna oksaliplatiinihoito (vaihteluväli: 34-41 päivää) (kuvio 6A).

Toisessa selviytymisen tutkimus, mediaani selviytyminen SCID-NOD hiiriin oli 31 päivää kontrolliryhmässä. Tämä lisääntynyt 93 päivää sen jälkeen, Nab-paklitakselihoidolla (p = 0,0007 vs. kontrolli ja oksaliplatiinin ryhmä, ja p = 0,0416 vs. doketakseliryhmässä), 81 päivän kuluttua dosetakselihoidon (p = 0,0007 vs. kontrollit) ja 40 päivää oksaliplatiinihoito (p = 0,038 verrattuna kontrolliryhmään). Ryhmän selviytyminen vaihteluväli oli 75-96 päivää sen jälkeen, Nab-paklitakselihoidolla verrattuna dosetakselihoidon (vaihteluväli: 74-93 päivää) ja oksaliplatiinihoito (vaihteluväli: 35-45 päivää) (kuvio 6B).

Keskustelu

Advanced mahasyöpä on hengenvaarallinen ja se edustaa valtava hoito haaste. Perinteinen kahden tai kolmen solunsalpaajahoidosta hoito ovat rajallisia vaikutuksia ja voivat aiheuttaa haittavaikutuksia ja chemoresistance [42] - [44]. Tämä tutkimus osoittaa selvästi, että Nab-paklitakseli on merkittävästi vahvempi antituumorivaikutukset mahalaukun syövän solulinjoissa kuin nykyisin käytössä sytostaattien Oksaliplatiini ja epirubisiinin in vitro ja in vivo, mitattuna antiproliferatiivisia vaikutuksia, apoptoosin, mitoosi solukuolemaa, paikallinen antitumor vaste ja selviytymisen liittyvä kasvaimen taakka.

in vitro -tutkimus osoitti, että napata-paklitakseli on erittäin voimakas estossa solujen lisääntymisen ihmisen mahan solulinjojen kuin oksaliplatiinin ja epirubisiinia. SNU16 solut ovat herkempiä napata-paklitakseli kuin NCI-N87-soluissa. Joissakin tutkimuksissa havaittiin, että stathmin korreloi taksaania vastus ja stathmin knockdown voi lisätä herkkyyttä taksaania [33], [36]. Testasimme ilmentyminen stathmin ja todettu mitään eroa näiden kolmen solulinjat. Mielenkiintoista, kun tutkimme ilmaus fosfo-stathmin huomasimme, että kyky Nab-paklitakselin estävän in vitro solujen lisääntymisen oli samaa paremmuusjärjestyksessä kuin ilmaus fosfo-stathmin näissä kolmessa mahalaukun syöpäsolut: SNU16 > AGS > NCI-N87. Olisi siis aluksi, että fosfo-stathmin ekspressio korreloi Nab-paklitakselin tehokkuutta, lainaus jonkin verran tukea hypoteesin, että fosfo-stathmin voi toimia mahdollisena biomarkkerina ennustaa Nab-paklitakselin tuumorinvastaista vastetta mahalaukun syövän hoidossa.

Teimme NCI-N87 vierassiirrettä tutkimus, jossa arvioidaan antituumorivaikutusta Nab-paklitakseli. Pikemminkin yllättäen, Nab-paklitakselin esti merkittävästi NCI-N87 vierassiirrettä kasvaimen kasvua verrattuna kontrolliryhmään. Nämä hieman poikkeavia tulokset näyttävät viittaavan siihen, että in vivo antituumorivaikutusta Nab-paklitakselin mahasyövässä voi olla riippumaton perustason ilmentymistä fosfo-stathmin tai koko stathmin. Koska vain kolme solulinjat testattiin, emme voi tehdä lopullista päätelmää suhteesta stathmin tai fosfo-stathmin ja napata-paklitakselin tehoa mahasyövässä. Lisätutkimuksia kanssa stathmin tippuu-out olisi hyödyllistä käsitellä tätä kysymystä ja roolin tutkimiseksi stathmin kuin biomarkkerina Nab-paklitakselin tehoa.

Tässä tutkimuksessa olemme verrataan antituumorivaikutukset Nab Paklitakselin oksaliplatiinin ja epirubisiinia on SNU16 ksenografti- paikallista kasvaimia. Nab-paklitakseli osoittivat vahvempaa tuumorin vastaista tehokkuutta kuin oksaliplatiinin ja epirubisiinia, joka oli yhdenmukainen in vitro solujen lisääntymisen tuloksia ja kasvainkudoksen solujen lisääntymistä ja apoptoosia tiedot. Vaikka 5-fluouracil on vakiintunein single-aine huume kemoterapeuttisten mahasyövän hoitoon, kasvaimen vaste 5-fluorourasiili on raportoitu riittämättömästi ennustaa SCID hiiren malleissa siihen pisteeseen, jossa ei ollenkaan antituumorivaikutuksen vaikutuksia on havaittu [45]. Sisplatiini ja oksaliplatiini, tehokkaampi indusoijia apoptoosin ja käytetään myös usein mahalaukun syövän kemoterapian, on valittu useammin aineina vertailua varten uusia aineita, jotka on testattava [22], [45]. Liuotinpohjainen paklitakseli on enemmän sivuvaikutuksia eikä lisätä selviytymisen etuja verrattuna oksaliplatiinille kliinisen hoidon mahasyövän [22]. Meidän tutkimuksissa oksaliplatiinia eivät eronneet tilastollisesti alkaen epirubisiini. Siksi valita oksaliplatiinia perusviivana aineena eläinten eloonjäämisen tutkimuksen ja totesi, että napata-paklitakseli kasvoi mediaani hiiri selviytymisen noin 40 päivää yli oksaliplatiinia, joka on yli kaksinkertainen vaikutus kuin joka saavutettiin oksaliplatiinia. Doketakseli näyttää olevan aktiivisempi taksaani, jossa nopeampi soluunottokokeissa ja pidempi solunsisäinen säilyttäminen verrattuna liuotinpohjaisiin paklitakseli [46]. Suoritimme toisen selviytymisen tutkimus vertailla antituumorivaikutukset Nab-paklitakselin dosetakseliannoksella ja totesi, että keskimääräinen eloonjäämisaika oli laajennettu hieman jälkeen Nab-paklitakselihoidolla (93 päivää vs. 81 päivää, p = 0,0416). Tuloksemme olivat yhdenmukaisia ​​tuloksia äskettäin vaiheen II rintasyövässä tutkimus, joka osoitti, että 100 mg /m ^{2 Nab-paklitakselilla oli pidentynyt Keskimääräinen eloonjäämisaika (riskisuhde 0,575, p = 0,008) verrattuna dosetakselin [47]. Tutkimustulosten perusteella, Nab-paklitakseli osoittivat vahvempaa antituumorivaikutuksen tehosta kokeellisissa mahasyövän ja näyttää edustavan kohtuullisen voimakas uuden kemoterapeuttisen aineen kliiniseen mahalaukun syövän hoitoon.}

Stathmin on tärkeä mikrotubulia mikrotubulia epätasapainoon fosfoproteiini. Kun stathmin fosforyloituu, sen mikrotubulia epävakautta aktiivisuus väheni [32], [34] ja tämä saattaa parantaa herkkyyttä taksaania. Stathmin fosforyloituu pääasiassa sykliini-riippuvaisen proteiinikinaasin (CDK: t) sitoutumiskohtaan Ser38 mitoosissa [32], joten keskittäneet ilmaisu analyysejä ser38 jäännös. Huomasimme, että Nab-paklitakselihoidolla kasvoi fosfo-stathmin ilmentymistä in vitro ja in vivo ja korreloi mitoosi pidätykset, ydin- pirstoutuminen, karyopyknosis ja mitoottisten solukuolemaa. Mitoosissa kuolema tapahtui näissä soluissa on korkea ilmentymisen fosfo-stathmin. Zhou et al. [33] mukaan alassäädetty stathmin ilmentymisen jälkeen STMN1 geenin Knockdown maksan karsinoomasolulinjassa lisätään 7,7-kertainen herkkyyden napata-paklitakselia ja 2,7-kertainen herkkyyden liuotinpohjaisiin paklitakselin mutta ei herkkyys doksorubisiinille. Molekulaarinen luonne, joka laukaisee solukuoleman aikana pitkittynyt mitoosi pidätyksen edelleen määritelty huonosti [17], [32]. Kehräkokoonpanon tarkistuspisteitä on pitkään ajateltu olevan keskeinen rooli tämän prosessin aikana [48]. Tässä tutkimuksessa napata-paklitakselin aiheuttama fosforylaatiota stathmin mahalaukun syöpäsoluissa, jonka odotetaan vakauttaa mikrotubulusten laitetta, mikä puolestaan ​​voi aiheuttaa mitoosi pidätykset ja laukaista solukuoleman. Vaikka nämä ovat varhain ja ennakkotietojen jonkin verran tukea fosfo-stathmin säätelevä Nab-paklitakseli antituumorivaikutus on havaittu ja ansaitsee arvioitava edelleen.

Yhteenvetona esillä tutkimus osoittaa, että yhden aineen napata-paklitakseli oli voimakkaampi antituumorivaikutus kokeellisissa mahasyövän kuin nykyinen standardi kemoterapia-aineiden oksaliplatiinia ja epirubisiinin ja näytti olevan ylivoimainen taksaani verrattuna doketakselia. Tämä voimakas antituumorivaikutus tukee perusteluissa kliinistä arviointia Nab-paklitakselin lupaava mikrotubulia estävä aine mahasyövän.

tukeminen Information
Kuva S1.
Nab-paklitakselin johtaa G2-M-faasin pysähtymisen mahalaukun syöpäsoluja. (A) Histogrammit osoittavat solusyklin profiilit AGS ja NCI-N87-soluissa eri aikoina sen jälkeen, kun Nab-paklitakselihoidolla. Mahasyöpä soluja viljeltiin 24 tuntia ja sitten käsiteltiin 100 nM Nab-paklitakselin 12 tuntia tai 24 tuntia. Solusyklin analyysi suoritettiin virtaussytometrialla. Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta. (B) Cell cycle jakelu mahasyövän soluja käsiteltiin 100 nM Nab-paklitakseli. Symboli * tavaramerkit olosuhteet, joissa soluja oli hajonnut.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF) B Kuva S2.
solusyklin etenemisen mahalaukun syöpäsolujen käsitelty oksaliplatiini, epirubisiini ja doketakseli. (A) histogrammit esittävät solukierron profiilit SNU16 ja AGS solujen jälkeen oksaliplatiini, epirubisiini ja dosetakselihoidon. Mahasyöpä soluja viljeltiin 24 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten 10 uM Nab-paklitakseli, oksaliplatiini, epirubisiini ja dosetakseli 8 tuntia. Solusyklin suoritettiin virtaussytometrialla. Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

• PLoS ONE: palauttaminen miR-1228 * Expression vaimentaa epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon mahasyövän
• PLoS ONE: MDM2 SNP309 rs2279744 polymorfismi ja mahalaukun syöpäriski: Meta-analyysi