PLoS ONE: Superior-Antitumoraktivität von Nanoparticle albumingebundene Paclitaxel in Experimental Gastric Cancer

Abstrakt

Magenkrebs ist die zweite häufige Ursache von Krebs im Zusammenhang mit dem Tod weltweit und hat keine hochwirksame Behandlung für fortgeschrittenen Erkrankung. Nab-Paclitaxel ist ein neuartiges Mikrotubuli-hemmenden zytotoxischen Mittel, die bei Magenkrebs getestet wurde, als der noch nicht untersucht. In dieser Studie wurden die menschliche Magenkrebszelllinien AGS, NCI-N87 und SNU16 sucht. Nab-Paclitaxel inhibiert die Zellproliferation mit einem IC50 von 5 nM in SNU16, 23 nM in AGS und 49 nM in NCI-N87-Zellen nach 72-stündiger Behandlung, was weniger war als von Oxaliplatin (1,05 &mgr; M bis 1,51 &mgr; M) und Epirubicin ( 0,12 &mgr; M bis 0,25 &mgr; M). Nab-Paclitaxel-Behandlung erhöhte Expression des mitotischen Spindel zugeordnet phospho-Stathmin unabhängig von der Basislinie insgesamt oder phosphoryliert Stathmin Ebene und mitotischen Zelltod induziert, wie durch die erhöhte Expression von gespalten-PARP und Caspase-3 bestätigt. Nach einer zweiwöchigen nab-Paclitaxel, Oxaliplatin oder Epirubicin Behandlung, die durchschnittliche in-vivo-Rate der lokalen Tumorwachstumshemmung betrug 77, 17,2 und 21,4 Prozent (p = 0,002). Auswirkungen der Therapie auf tumorale proliferative und apoptotische Indizes korrespondierte mit Tumorwachstumsinhibierung Daten, während die Expression von Phospho-Stathmin auch in Geweben erhöht. Es war nach nab-Paclitaxel-Behandlung ein Anstieg der medianen Überleben der Tiere (93 Tage) im Vergleich zu den Kontrollen (31 Tage, p = 0,0007), Oxaliplatin (40 Tage, p = 0,0007) oder Docetaxel-Therapie (81 Tage, p = 0,0416) . Die starke Antitumor-Aktivität von nab-Paclitaxel in der experimentellen Magenkrebs unterstützt solche Mikrotubuli-hemmende Strategie für die klinische Anwendung. Nab-Paclitaxel Vorteile wurden unabhängig beobachtet von phosphoryliert Stathmin Ausdruck zu Beginn der Studie, in Frage zu stellen, die Berücksichtigung der nab-Paclitaxel Verwendung bei Magenkrebs auf Basis dieser vermeintlichen Biomarker

Citation:. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Superior Antitumoraktivität von Nanoparticle albumingebundene Paclitaxel in Experimental Magenkrebs. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10.1371 /journal.pone.0058037

Editor: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Großbritannien

Empfangen: 20. November 2012; Akzeptiert: 29. Januar 2013 beginnen; Veröffentlicht: 27. Februar 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen
der vierte ist am häufigsten

Einführung

Magenkrebs (GC). Krebs und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt [1] - [3]. Die meisten Patienten haben fortgeschrittenen oder metastasierenden Erkrankung zum Zeitpunkt der Diagnosestellung [4], [5]. Die Kombination von Oxaliplatin und 5-Fluorouracil, mit und ohne Epirubicin, hat die am weitesten verbreitete Therapie in erster Linie Chemotherapie bei fortgeschrittenem Magenkrebs [6] werden [7]. Allerdings hat diese Kombinationsbehandlung das Potenzial für erhebliche Nebenwirkungen und trägt immer noch begrenzte Wirksamkeit, während Patienten Prognose mit einer durchschnittlichen Überlebenszeit von rund 10 Monate trostlos bleibt [8] - [11]. In dem Bemühen, das Überleben zu verbessern und die Toxizität zu verringern, molekular gezielte Therapie für die Behandlung von Magenkrebs wird aktiv untersucht [12].

Mikrotubuli sind seit langem ein Ziel von Interesse für einige Krebsmedikamente in Betracht gezogen worden, weil ihre universelle Rolle in proliferierenden Zellen und ihre wesentliche Rolle bei der Mitose [13] - [15]. Paclitaxel und Docetaxel sind klassische Mikrotubuli-Inhibitoren, die ihre Aktivität ausüben, indem sie die Förderung der Tubulinpolymerisation und Stabilisierung von Mikrotubuli ergeb in G2-M-Phase und mitotischen Arrest Zelltod [15]. Mitotischen Zelltod ist ein Modus des Zelltods spezifisch induziert während des mitotischen Stadien auftretenden durch DNA-schädigende Mittel und Spindelgifte /mitotischen Inhibitoren [16], [17]; es ist in erster Linie Caspase abhängig, aber in seltenen Fällen kann auch unabhängig [18] Caspase werden. Paclitaxel wurde für fortgeschrittene und rezidivierenden Magen-Krebs mit einer Rücklaufquote von 43% in Kombination mit 5-Fluorouracil und Folinsäure [9], [19] getestet. Im Vergleich zu der Reaktionsrate von 38~45% ergab durch eine Kombination von Oxaliplatin mit 5-Fluorouracil und Folinsäure, Paclitaxel nicht in superior Überleben führte aber verursacht mehr Nebenwirkungen, insbesondere bei älteren Patienten, [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paclitaxel erforderlich Emulgierung mit Lösungsmitteln intravenöse Verabreichung zu ermöglichen, die in Überempfindlichkeitsreaktionen und möglicherweise dramatische Nebenwirkungen bei Patienten geführt hat [23], [24]. Nanoparticle Albumin-gebundene (nab) Paclitaxel ist ein neuartiges Albumin-stabilisiert, Cremophor frei und wasserlöslichen Nanopartikel-Formulierung von Paclitaxel. Es ist gut, ohne Überempfindlichkeitsreaktionen nach intravenöser Infusion [25] toleriert. Klinische und experimentelle Studien haben gezeigt, dass im Vergleich zu lösungsmittelbasierten Paclitaxel, nab-Paclitaxel höhere Tumorretention hatte, geringere Toxizität [23], [26] und potenter Antitumor-Wirkung auf Brustkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC), Bauchspeicheldrüsen Krebs, Melanom, und Kopf- und Halskrebs [27] - [31]. Jedoch ist die mögliche Rolle von Paclitaxel in nab-Magenkrebszellen nicht als der noch getestet

Stathmin, ein Mikrotubuli-destabilisierenden Phosphoprotein, ist ein wichtiger Regulator der Mikrotubulus-Polymerisation und Dynamik [32] - [34]. und wurde auf Taxan Widerstand bezogen werden bei einigen Tumorarten durch Veränderung Medikament Bindung und Verzögerung G2-M-Phasenübergang [33], [35] gefunden. Stathmin Hemmung hatte eine synergistische antiangiogene und antitumorale Aktivität mit Taxol [36]. Stathmin Expression wurde in einer Vielzahl von menschlichen Krebserkrankungen, einschließlich Magenkrebs anwesend sein gefunden, und daher ein attraktives Ziel für die Krebstherapie darstellen [34], [37], [38]. Jeon et al. festgestellt, dass Stathmin als prognostischer Marker dienen kann und ein mögliches therapeutisches Ziel für Magenkrebs [37]. Die Phosphorylierung von Stathmin reduziert seine Mikrotubuli destabilisierenden Effekte, ein Phänomen, das auch auf Taxan-Aktivität zugeschrieben wurde [34].

Diese Studie, die die Anti-Tumor-Aktivitäten der nab-Paclitaxel in menschlichen Magenkrebszellen in vitro und in vivo untersucht. Wir verglichen die Anti-Tumor-Wirksamkeit von nab-Paclitaxel zu anderen Zytostatika auf lokale Tumorwachstum und das Überleben der Tiere. Wir maßen auch die Expression von insgesamt Stathmin und Phospho-Stathmin in vitro und vivo ihre Rolle als prädiktive Marker in der nab-Paclitaxel Anti-Tumor-Antwort zu beurteilen.

Materialien und Methoden

Zellkultur und Reagenzien

die menschliche Magenkrebszelllinien AGS, NCI-N87 und SNU16 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) und kultiviert in RPMI-1640-Medium (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO _{2 -Atmosphäre ergänzt. Nab-Paclitaxel wurde von Abraxis BioScience (Los Angeles, CA) erworben. Oxaliplatin wurde von Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ) erworben. Docetaxel, Epirubicin und 5-Fluorouracil wurden von einer örtlichen Apotheke erhalten. Die Zellproliferation Reagenz WST-1 wurde von Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN) erworben.}

Zelllebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die kolorimetrischen WST-1-Test bewertet. Die Messung wird auf der Fähigkeit von lebensfähigen Zellen auf Basis des sulfonierten Tetrazoliumsalz WST-1 (4- [3- (4-Iodphenyl) -2- (4-nitrophenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, abzuspalten 3- benzoldisulfonat) durch mitochondriale Dehydrogenasen [39]. Magenkrebszellen (5000 Zellen pro Vertiefung) wurden in einer 96-Well-Platte in regelmäßigen Wachstumsmedium plattiert und wurden mit nab-Paclitaxel behandelt, 5-Fluorouracil, Oxaliplatin und Epirubicin nach 16 Stunden Inkubation. Der Bereich der verwendeten Konzentrationen (1 nM bis 10 &mgr; M) war vergleichbar mit ihren klinisch erreichbaren Konzentrationen. Nach weiteren Inkubation von 72 Stunden 10 &mgr; l WST-1-Reagens wurde für 2 Stunden in jeder Vertiefung, gefolgt von der Inkubation zugegeben. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen.

Zellzyklusanalyse

Zellzyklus-Analyse mittels Durchflusszytometrie mit fluoreszierenden Propidiumiodid (PI) Färbung durchgeführt wurde. Die Zellen wurden kultiviert und behandelt mit nab-Paclitaxel, Oxaliplatin, Epirubicin und Docetaxel für 8 bis 24 Stunden. Die Zellen wurden dann in 75% Ethanol-PBS über Nacht bei -20 ° C aufgefangen und fixiert. Die Zellen wurden für 5 min bei 2000 × g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100 und 1 mg /ml RNAse A in PBS für 45 min bei Raumtemperatur resuspendiert und inkubiert. Die Suspension wurde dann auf einem Becton Dickinson FACScan analysiert. Das Verhältnis von Zellen in der Sub-G1, G1, S und G2-M-Phasen des Zellzyklus wurde durch die DNA-Gehalt bestimmt.

immunzytochemische Analyse

Magenkrebszellen (1 × 10 ^{5 Zellen pro Kammer) wurden in einem 4-Kammer-Folie in regelmäßigen Wachstumsmedium plattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit nab-Paclitaxel für 16 Stunden behandelt und dann in 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen wurden mit CAS Blocking-Puffer durch 1-stündige Inkubation mit phospho-Stathmin Antikörper (1:100) und 40 Minuten Inkubation mit Cy3 (1:200 Verdünnung) sekundären Antikörper inkubiert, gefolgt. Die Objektträger wurden montiert mit Befestigungslösung, die 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Die Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, Fluoreszenzsignale des IX81 Olympus-Mikroskop mit einer Hamamatsu Orca Digitalkamera (Hamamatsu Corporation Bridgewater, NJ) zu erkennen, ausgestattet mit.}

Western-Blot-Analyse

Subkonfluente Monoschichten von Zellen wurden mit nab-Paclitaxel, Oxaliplatin und Epirubicin behandelt. Zelllysate und Tumor Lysate wurden erhalten, wie zuvor [40] beschrieben. Überstände wurden bei 13000 rpm durch Zentrifugation gewonnen, Proteinkonzentrationen wurden gemessen und gleiche Mengen an Gesamtprotein wurden durch SDS-PAGE getrennt. Proteine ​​wurden auf PVDF-Membranen überführt (Bio-Rad, Hercules, CA), und die Membranen wurden 1 Stunde lang in TBS-T blockiert. Gesamt Stathmin, phospho-Stathmin (ser38) gespalten poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) gespalten Caspase-3 (alle von Cell Signaling Technology: Die Membranen wurden über Nacht bei 4 ° C mit den folgenden Antikörpern inkubiert , Beverly, MA), α-Tubulin und β-Aktin (beide von Sigma, St. Louis, MO). Die Membranen wurden dann mit den entsprechenden HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) für eine Stunde inkubiert. Spezifische Banden wurden unter Verwendung des erweiterten chemoilluminescence Reagenz (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) auf Autoradiographiebild Film erkannt.

Subkutan Tumorwachstum Studie

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung durchgeführt mit die Richtlinien und genehmigten Protokollen von der University of Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional Animal Care und Use Committee (Zulassungsnummer 2012-0081). Die Tiere wurden täglich während des gesamten Versuchs nach einem Zeichen der Not überwacht. Weibliche SCID-Mäuse (6 bis 8 Wochen) wurden für Vergleichs Modellierung von subkutanen Tumorwachstums verwendet. Magenkrebszellen (10 × 10 ^{6 NCI-N87 oder 20 × 10 6 SNU16 Zellen) wurden subkutan in jede Maus injiziert. Die Mäuse wurden zweimal wöchentlich gewogen. Vierzehn Tage nach der Tumorzellinjektion, alle Mäuse hatten messbarer Tumor (mit einer durchschnittlichen Tumorgröße von 100 bis 150 mm 3). Die Mäuse wurden dann zufällig gruppiert (n = 6~8 pro Gruppe) und intraperitoneal mit PBS (Kontrolle) behandelt, nab-Paclitaxel (10 mg /kg in 100 &mgr; l PBS, 2 mal pro Woche), Oxaliplatin (5 mg /kg in 100 &mgr; l PBS, 2 mal pro Woche) und Epirubicin (1 mg /kg in 100 &mgr; l PBS, 2 mal pro Woche) für 14 Tage. Die Tumorgröße wurde mittels caliper zweimal wöchentlich gemessen und das Tumorvolumen (V) wurde unter Verwendung der Formel V = ½ [L × (W) 2], L = Länge und W = Breite berechnet. Relative Tumorvolumen (RTV) wurde bestimmt nach der Formel RTV = V _{n /V 0, wobei V 0 und V 1 repräsentieren Tumorvolumen am Tag 0 und den nachfolgenden Messtag, beziehungsweise. Die Tumorwachstumshemmungsrate wurde unter Verwendung der Formel (1-RTVt /RTVC) × 100% berechnet, wobei T und C-Behandlung und der Kontrollgruppe darstellen. Nach Abschluss der Behandlung wurden alle Mäuse mit CO 2 eingeschläfert wurden Tumoren entnommen, gewogen, seziert und zur histologischen, immunhistochemischen und Western-Blot-Analyse verarbeitet.}}

Immunhistochemische Analyse

Tumorgewebeproben in fixiert wurden 4% Paraformaldehyd und in Paraffin eingebettet. Intratumorale Proliferation wurde durch Ki67 nuclear antigen-Färbung gemessen gemäß Herstellerprotokoll (Abcam, Cambridge, MA). Paraffin eingebettete Gewebeschnitte wurden geschnitten (5 &mgr; m), entparaffiniert, rehydriert und Antigen abgerufen. Die Gewebeschnitte wurden mit CAS Blocking-Puffer durch 1-stündige Inkubation mit 1:200 Verdünnung von primären Ki67 oder Phospho-Stathmin Antikörper (1:200) und 40 Minuten Inkubation mit Cy3 (1:200 Verdünnung) sekundären Antikörper inkubiert, gefolgt. Die Objektträger wurden montiert mit Befestigungslösung, die 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen). Intratumorale proliferative Index und Stathmin Aktivität wurde durch Berechnung der positiven Zellen aus fünf verschiedenen High-Power-Felder (HPF) in verblindet ausgewertet. Intratumorale apoptotische Aktivität wurde durch Anfärben Gewebeschnitten mit "Apoptag Apoptosis Detection Kit" bewertet nach den Angaben des Herstellers (Millipore) Anweisungen. Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, Fluoreszenzsignale, die IX81 Olympus-Mikroskop mit einer Hamamatsu Orca Digitalkamera (Hamamatsu Corporation Bridgewater, NJ) und eine DSU Spinn konfokale Einheit zur Erkennung ausgestattet ist mit Hilfe Slidebook Software (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).

Das Überleben der Tiere Analyse

Tierüberlebensstudien wurden unter Verwendung von 6- bis 8-Wochen alten weiblichen SCID-Mäusen durchgeführt [41]. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit SNU16 (40 × 10 ^{6) Zellen und Körpergewicht injiziert wurde zweimal pro Woche gemessen. Drei Wochen nach der Tumorzellinjektion wurden die Mäuse zufällig gruppiert (n = 6 bis 8 pro Gruppe).}

In der ersten Überlebensstudie wurden die Mäuse intraperitoneal mit PBS behandelt (Kontrolle), nab-Paclitaxel (10 mg /kg in 100 ul PBS, 2 mal pro Woche) und Oxaliplatin (5 mg /kg in 100 &mgr; l PBS, 2 mal pro Woche) für 2 Wochen. In der zweiten Überlebensstudie wurden die Mäuse intraperitoneal mit PBS behandelt wurden (Kontrolle), nab-Paclitaxel (10 mg /kg in 100 ul PBS, 2 mal pro Woche), Docetaxel (3 mg /kg in 100 ul PBS, 2 mal pro Woche ) oder Oxaliplatin (5 mg /kg in 100 &mgr; l PBS, 2 mal pro Woche) für 2 Wochen. Das Leiden von Tieren wurde durch euthanizing reduziert, wenn mit schnellen Gewichtsverlust oder -gewinn nach vorgegebenen Kriterien moribund Drehen (> 15%), Versagen zu essen oder zu trinken, Lethargie, Unfähigkeit, aufrecht und Kraftlosigkeit zu bleiben. Das Überleben der Tiere wurde vom ersten Tag der Behandlung bis zum Tod ausgewertet.

Die statistische Analyse

Überlebensanalyse wurde mit GraphPad Prism 5 Software (GraphPad Software, San Diego, CA) ausgewertet. In-vitro-Zellproliferationsdaten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mittels ANOVA für mehrere Gruppenvergleich und Student-t-Test für die einzelnen Gruppenvergleich durchgeführt. Survival-Gruppenvergleich wurde über Log-Rank-Test innerhalb einer Kaplan-Meier-Typ-Analyse durchgeführt. Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikante Gruppenunterschiede darzustellen

Ergebnisse |

Stathmin Expression in Magenkrebszellen

Die Analyse der menschlichen AGS Magenkrebszellen, NCI-. N87 und SNU16 zeigten, dass alle drei Zeilen Stathmin ausgedrückt. Kein Unterschied der Gesamt Stathmin Expression wurde unter diesen drei Zelllinien gefunden. Die Expression von phospho-Stathmin zwischen Zelllinien variiert, in der folgenden Reihenfolge: SNU16 > AGS > NCI-N87-Zellen (1A).

Nab-Paclitaxel hemmt die Proliferation Magenkrebszellen

Nab-Paclitaxel in einer Dosis-abhängigen Weise Magenkrebszellproliferation gehemmt, und die Hemmung der Zellproliferation erschienen in der gleichen Reihenfolge wie die Expression von phospho-Stathmin (1B) zu folgen. Bei 100 nM Konzentration Hemmung der Zellproliferation betrug 94,5, 66,7 und 41,8 Prozent in SNU16, AGS und NCI-N87-Zellen sind. Nab-Paclitaxel zeigte die höchste antiproliferative Potenz mit einer niedrigsten wirksamen Dosierung in allen drei Zelllinien getestet im Vergleich zu 5-Fluorouracil, Oxaliplatin und Epirubicin. Der IC _{50 von nab-Paclitaxel betrug 5 nM in SNU16, 23 nM in AGS und 49 nM in NCI-N87-Zellen, die weniger als 5-Fluorouracil (6,46 uM in SNU16, > 10 &mgr; M in AGS und 10.2 uM in NCI-N87-Zellen), Oxaliplatin (1,51 uM in SNU16, 1,64 uM in AGS und 1,05 uM in NCI-N87-Zellen) oder Epirubicin (0,12 &mgr; M in SNU16, 0,16 uM in AGS und 0,25 uM in NCI-N87-Zellen) ( 1C).}

Nab-Paclitaxel induziert G2-Arrest und mitotischen Zelltod in vitro

Zur Auswertung wurde die zugrunde liegende Mechanismus der Wachstumshemmung durch nab-Paclitaxel, die Zellzyklus-Profil analysiert. Wie in 2A gezeigt, nab-Paclitaxel (100 nM) führte in G2-M Arrest des Zellzyklus in Zellen SNU16. Der Prozentsatz der Propidiumiodid-positiven Zellen in G2-M-Phase erhöhte sich von 35,6 bis 71,6 nach 100 nM nab-Paclitaxel-Behandlung für 12 Stunden. Ähnliche Veränderungen traten bei AGS und NCI-N87-Zellen mit nab-Paclitaxel und Docetaxel-Behandlung, aber nicht mit Oxaliplatin und Epirubicin-Behandlung (Abbildungen S1 und S2).

Wirkung von nab-Paclitaxel auf mitotischen Zelltod, die Expression von phospho -stathmin und Apoptose-verwandte Proteine ​​wurde durch immunocystochemistry und Western-Blot gemessen. Nab-Paclitaxel-Behandlung verursacht Mikrotubuli Unterbrechung und mitotischen Verhaftungen in Magenkrebszellen beobachtet, wie durch Kernfragmentierung und Karyopyknose (2B). Expression von Phospho-Stathmin wurde nach nab-Paclitaxel-Behandlung erhöht und eine höhere Expression von phospho-Stathmin wurde mit einem höheren Grad an mitotischen Verhaftungs, Nucleus Fragmentierung oder Karyopyknose und Zelltod (2B und 2C) verbunden. Kernfragmentierung und Karyopyknose traten bei 16,7% der Zellen mit geringer Expression von phospho-Stathmin aber in 95,7% der Zellen mit hoher Expression von phospho-Stathmin (r = 0,672, p < 0,001). Es gab auch Hinweise auf zeitabhängige erhöhte Expression von phospho-Stathmin von nab-Paclitaxel-Behandlung (2D).

Wir untersuchten, ob die mitotischen Zelltod induziert durch nab-Paclitaxel könnte teilweise mit der Induktion von Apoptose in Beziehung gesetzt werden . Bewertung der PARP-1-Spaltung und Caspase-3-Spaltung als Marker der Induktion der Apoptose ergeben, dass im Magenkrebszellen nab-Paclitaxel, Oxaliplatin und Epirubicin-Behandlung eine Zunahme der Expression sowohl gespalten PARP-1 und Caspase-3 verursacht. Dieser Ausdruck der Apoptose-verwandten Proteinen erschien höher nach nab-Paclitaxel-Behandlung im Vergleich mit Oxaliplatin oder Epirubicin Behandlungen (Abbildung 2E).

Nab-Paclitaxel, das Wachstum von Magenkrebs Xenotransplantate hemmt

In-vivo-Antitumor Auswirkungen der nab-Paclitaxel wurden in einem Maus-Xenograft-Modell mit SNU16 Zellen ausgewertet. Nab-Paclitaxel-Therapie mit 10 mg /kg zweimal pro Woche für zwei Wochen war auch ohne offensichtliche Anzeichen von Toxizität toleriert, wie Maus Gewicht und tägliche Bewertung beurteilt. Nach einer zweiwöchigen Behandlung nab-Paclitaxel-Therapie in statistisch signifikanten Hemmung des Tumorwachstums führte (p = 0,0004), die größer ist als die von Oxaliplatin (p = 0,0361) war und Epirubicin (p = 0,032) im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung bzw. (Abbildung 3A). Die Hemmung des Tumorwachstums Rate nach einer 2-wöchigen Behandlung mit nab-Paclitaxel, Oxaliplatin und war Epirubicin 77, 17,2 und 21,4 Prozent (p = 0,002), respectively. Nur nab-Paclitaxel Behandlung erstellt eine Verringerung der Größe subkutanen Läsionen im Vergleich zu ihren vorgegebenen Tumorgröße. Mittlere Tumorgewicht wurde signifikant durch nab-Paclitaxel-Behandlung (0,154 ± 0,075 g vs. 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), aber nicht von Oxaliplatin (0,408 ± 0,12 g) oder Epirubicin (0,46 ± 0,172 g) Behandlung im Vergleich zu Fahrzeug vermindert Steuerung, bzw. (3A). Wir untersuchten auch die Anti-Tumor-Wirkung von nab-Paclitaxel auf NCI-N87 Xenotransplantat Maus lokalen Tumoren. Nach zwei Wochen Behandlung ergaben nab-Paclitaxel-Therapie in signifikante Tumorvolumenhemmung (p = 0,0023) (3B) und die Tumorwachstumshemmung betrug 72,8 Prozent. Mittlere Tumorgewicht in der nab-Paclitaxel-Behandlungsgruppe war signifikant niedriger als der in der Fahrzeuggruppe (0,093 ± 0,026 g vs. 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (3B). Keine signifikante Veränderung der Gewichts Maus Körper wurde in einem der nab-Paclitaxel, Oxaliplatin oder Epirubicin Therapiegruppen beobachtet.

Nab-Paclitaxel Tod mitotischen Zelle induziert in vivo

Mechanismen von in-vivo-Antitumor-Aktivität von nab-Paclitaxel wurden weiter in Tumorgewebe untersucht, die aus SNU16 und NCI-N87 Xenotransplantate. Eine signifikante Zunahme in der Expression von phospho-Stathmin wurde in SNU16 (4A) und NCI-N87 (4B) Xenotransplantat-Tumoren mit der Behandlung von nab-Paclitaxel sowohl durch immunhistologische und Western-Blot-Analysen beobachtet.

Tumor Gewebe aus nab-Paclitaxel behandelten Mäuse zeigten eine Zellproliferation verringert Tumorrate. Ein ki67 Ausdruck basierte intratumorale proliferative Index verringerte sich um 90,7% (p = 0,001) im Vergleich zu den Kontrollen in der nab-Paclitaxel-Gruppe behandelt, als auf 72,6% gegenüber (p = 0,004) in der Oxaliplatin behandelten Gruppe und 67,7% (p = 0,003 ) in der Epirubicin behandelten Gruppe (5A). Nab-Paclitaxel verursacht eine stärkere Hemmwirkung auf die Tumorzellproliferation als Oxaliplatin und Epirubicin.

Untersuchung von Apoptose in Tumorgeweben zeigte, daß die Induktion in apoptotischen Index war 7,9-fach in der nab-Paclitaxel-Gruppe (p = 0,013 ), 5,7-fach in Oxaliplatin behandelten Tieren (p = 0,024) und 5,2-fach in der Gruppe Epirubicin behandelt wurden (p = 0,042) über der Basislinie in der Kontrollgruppe (5B).

Nab-Paclitaxel erhöht das Überleben der Tiere

in der ersten Überleben Studie betrug die mediane Überlebenszeit von SCID-NOD-Mäusen 24 Tage in der Kontrollgruppe. Diese erhöhte bis 86 Tage nach der nab-Paclitaxel-Behandlung (p = 0,0004 im Vergleich zur Kontrollgruppe, p = 0,0005 vs. Oxaliplatin-Gruppe) und auf 37,5 Tage nach Behandlung mit Oxaliplatin (p = 0,0004 im Vergleich zur Kontrollgruppe). Das Überleben der Gruppe Bereich war auch überlegen nach nab-Paclitaxel-Behandlung (Bereich: 75 bis 95 Tage) im Vergleich zu Oxaliplatin-Behandlung. (Bereich: 34 bis 41 Tage) (6A)

In der zweiten Studie das Überleben, Median Überleben von SCID-NOD-Mäusen betrug 31 Tagen in der Kontrollgruppe. Dies erhöht bis 93 Tage nach der nab-Paclitaxel-Behandlung (p = 0,0007 vs. Kontrolle und Oxaliplatin-Gruppe und p = 0,0416 vs. Docetaxel-Gruppe), bis 81 Tage nach der Behandlung mit Docetaxel (p = 0,0007 vs. Kontrollen) und zu 40 Tage nach Oxaliplatin-Behandlung (p = 0,038 vs. Kontrollgruppe). Das Überleben der Gruppe Bereich war 75 bis 96 Tage nach der nab-Paclitaxel-Behandlung im Vergleich zu Docetaxel-Behandlung (Bereich: 74 bis 93 Tage) und Oxaliplatin-Behandlung (Bereich: 35 bis 45 Tage). (6B)

Diskussion

fortgeschrittenem Magenkrebs ist lebensbedrohlich und stellt eine gewaltige Herausforderung Behandlung. Traditionelle doppelte oder dreifache zytotoxische Chemotherapien Effekte begrenzt und kann Nebenwirkungen und Chemoresistenz verursachen [42] - [44]. Die vorliegende Studie zeigt deutlich, dass nab-Paclitaxel hat signifikant stärkere antitumorale Wirkungen auf die Magenkrebszelllinien als derzeit verwendete cytotoxische Mittel Oxaliplatin und Epirubicin in vitro und in vivo, gemessen durch antiproliferative Effekte, Apoptose, mitotischen Zelltod, lokalisierte Antitumor-Antwort und das Überleben verwandten zu Tumorlast.

in-vitro-Studie zeigte, dass nab-Paclitaxel hochpotente ist die Zellproliferation für den menschlichen Magen-Zelllinien als Oxaliplatin und Epirubicin bei der Hemmung. SNU16 Zellen sind empfindlicher gegenüber nab-Paclitaxel als NCI-N87-Zellen. Einige Studien fanden heraus, dass Stathmin mit Taxan Widerstand und Stathmin Knockdown korreliert Empfindlichkeit gegenüber Taxanen zu erhöhen [33], [36]. Wir testeten die Expression von Stathmin und fand keinen Unterschied zwischen diesen drei Zelllinien. Interessant ist, wenn wir die Expression von phospho-Stathmin geprüft fanden wir, dass die Fähigkeit der nab-Paclitaxel in vitro Zellproliferation in der gleichen Rangordnung als Ausdruck von Phospho-Stathmin in diesen drei Magenkrebszellen war zu hemmen: SNU16 > AGS > NCI-N87. Es zeigte sich also zunächst, dass Phospho-Stathmin Expression wurde mit nab-Paclitaxel Wirksamkeit korreliert sind, eine gewisse Unterstützung zu einer Hypothese verleihen, dass Phospho-Stathmin als potenzieller Biomarker dienen können nab-Paclitaxel Anti-Tumor-Reaktion bei Magenkrebs Behandlung vorherzusagen.

Wir haben eine NCI-N87 Xenotransplantat Studie die Antitumor-Wirkung von nab-Paclitaxel zu bewerten. Eher unerwartet, nab-Paclitaxel signifikant gehemmt NCI-N87 Xenograft Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrollgruppe. Diese etwas abweichende Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die in vivo Anti-Tumor-Wirkung von nab-Paclitaxel bei Magenkrebs kann von der Basislinie Expression von phospho-Stathmin oder insgesamt Stathmin unabhängig sein. Da nur drei Zelllinien getestet wurden, können wir keine eindeutige Aussage über die Beziehung zwischen Stathmin oder Phospho-Stathmin und nab-Paclitaxel Wirksamkeit bei Magenkrebs zu machen. Weitere Untersuchungen mit Stathmin geklopft-outs sollte nützlich sein, diese Frage zu beantworten und die Rolle der Stathmin als Biomarker für nab-Paclitaxel Wirksamkeit zu untersuchen.

In dieser Studie haben wir dann im Vergleich Anti-Tumor-Wirkung von nab Paclitaxel mit Oxaliplatin und Epirubicin auf SNU16 Xenotransplantat lokalen Tumoren. Nab-Paclitaxel zeigten stärkere Anti-Tumor-Wirksamkeit als Oxaliplatin und Epirubicin, die mit in-vitro-Zellproliferation Ergebnisse und Tumorgewebezellproliferation und Apoptose Daten konsistent war. Obwohl 5-Fluorouracil die meisten etablierten Single-Agent-Medikament in chemotherapeutischen Magenkrebsbehandlung ist, wird der Tumor-Reaktion von 5-Fluorouracil berichtet bis zu dem Punkt in SCID-Maus-Modellen nur unzureichend vorhergesagt werden, in denen noch keine Anti-Tumor-Effekte beobachtet wurden [45]. Cisplatin und Oxaliplatin, leistungsfähigeren Induktoren der Apoptose und auch häufig verwendet in der Behandlung von Magenkrebs Chemo wurden häufiger als Mittel zum Vergleich mit den neuen Mitteln ausgewählt, die getestet [22] sind, werden [45]. Lösemittelbasierte Paclitaxel hat mehr Nebenwirkungen und nicht hinzu Überleben Vorteile im Vergleich zu Oxaliplatin in der klinischen Behandlung von Magenkrebs [22]. In unseren Studien unterscheiden sich Oxaliplatin nicht statistisch von Epirubicin. Wir wählen daher Oxaliplatin als Grundlage Mittel in der das Überleben der Tiere Studie und fand, dass nab-Paclitaxel von etwa 40 Tage über Oxaliplatin mediane Überleben der Mäuse erhöht, eine mehr als doppelte Wirkung als die von Oxaliplatin erreicht. Docetaxel erscheint die aktivere Taxan, mit einer schnelleren Zellaufnahme und längere intrazelluläre Retention im Vergleich zu lösungsmittelbasierten Paclitaxel [46] zu sein. Wir führten ein weiteres Überleben Studie Anti-Tumor-Wirkung von nab-Paclitaxel mit Docetaxel zu vergleichen und festgestellt, dass die mediane Überlebenszeit leicht nach nab-Paclitaxel Behandlung verlängert wurde (93 Tage gegenüber 81 Tage, p = 0,0416). Unsere Ergebnisse waren konsistent mit den Ergebnissen einer aktuellen Phase-II-Brustkrebs-Studie, die zeigte, dass 100 mg /m ^{2 nab-Paclitaxel verlängerte das mediane Gesamtüberlebenszeit (Hazard Ratio 0,575, p = 0,008) hatten im Vergleich zu Docetaxel [47]. Basierend auf unseren Ergebnissen, zeigte nab-Paclitaxel Wirksamkeit stärkere Anti-Tumor in der experimentellen Magenkrebs und scheint eine ziemlich starke neue chemotherapeutische Mittel für die klinische Behandlung von Magenkrebs zu repräsentieren.}

Stathmin ist ein wichtiger Mikrotubuli Mikrotubuli-destabilisierenden Phosphoprotein. Wenn Stathmin phosphoryliert wird, seine Mikrotubuli-destabilisierenden Aktivität vermindert [32], [34] und diese Empfindlichkeit gegenüber Taxanen verbessern. Stathmin phosphoryliert ist hauptsächlich auf die Cyclin-abhängigen Proteinkinasen (CDKs) Bindungsstelle Ser38 in Mitose [32], so haben wir unsere Ausdruck auf der ser38 Rückstand analysiert. Wir fanden, dass nab-Paclitaxel-Behandlung erhöht Phospho-Stathmin Expression in vitro und in vivo und wurde mit mitotischen Verhaftungen, Kernfragmentierung, Karyopyknose und mitotischen Zelltod korreliert. Mitotischen Zelltod trat in diesen Zellen mit hoher Expression von phospho-Stathmin. Zhou et al. [33] festgestellt, dass nach unten reguliert Stathmin Expression nach STMN1 Knock-Down in Zelle Leberkarzinom 7,7-fache Empfindlichkeit hinzugefügt nab-Paclitaxel und 2,7-fache Empfindlichkeit gegenüber lösungsmittelbasierten Paclitaxel aber keine Empfindlichkeit gegenüber Doxorubicin. Die molekulare Natur, die den Zelltod bei längerer mitotischen Arrest löst bleibt schlecht definiert [17], [32]. Spindelbaugruppe Checkpoints haben lange gedacht worden, eine entscheidende Rolle bei diesem Prozess spielen [48]. In dieser Studie nab-Paclitaxel induzierte Phosphorylierung von Stathmin bei Magenkrebs-Zellen, die die Mikrotubuli-Vorrichtung zur Stabilisierung zu erwarten ist, die wiederum mitotischen Verhaftungen und Trigger Zelltod führen kann. Obwohl diese frühe und vorläufigen Daten, eine gewisse Unterstützung für Phospho-Stathmin Regulierung nab-Paclitaxel Antitumor-Aktivität beobachtet wurde, und verdient weiter ausgewertet werden.

Abschließend zeigt die vorliegende Studie, dass Single-Agent-nab-Paclitaxel in der experimentellen Magenkrebs hatte Antitumor-Aktivität stärker als die derzeitige Standardchemotherapeutika Oxaliplatin und Epirubicin, und erschien die überlegene Taxan im Vergleich zu Docetaxel zu sein. Diese starke Anti-Tumor-Aktivität unterstützt die Begründung für die klinische Bewertung von nab-Paclitaxel als Mikrotubuli-hemmendes Mittel bei Magenkrebs vielversprechend.

Hintergrundinformationen
Abbildung S1.
Nab-Paclitaxel führt zu G2-M Phase Verhaftung in Magenkrebszellen. (A) Histogramme zeigen Zellzyklus-Profile von AGS und NCI-N87-Zellen zu verschiedenen Zeiten nach nab-Paclitaxel-Behandlung. Magenkrebs-Zellen wurden für 24 Stunden und dann mit 100 nM nab-Paclitaxel für 12 Stunden oder 24 Stunden behandelt. Zellzyklusanalyse wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt wird. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. (B) Zellzyklus-Verteilung für Magenkrebszellen behandelt mit 100 nM nab-Paclitaxel. . Symbol * kennzeichnet Bedingungen, unter denen die Zellen zerfallen
doi: 10.1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF)
Abbildung S2.
Zellzyklusprogression von Magenkrebs behandelten Zellen von Oxaliplatin, Epirubicin und Docetaxel. (A) Histogramme zeigen Zellzyklus-Profile von SNU16 und AGS-Zellen nach Oxaliplatin, Epirubicin und Docetaxel-Behandlung. Magenkrebs-Zellen wurden für 24 Stunden und dann mit 10 &mgr; M nab-Paclitaxel, Oxaliplatin, Epirubicin und Docetaxel 8 Stunden lang behandelt. Zellzyklus wurde durch Durchflußcytometrie durchgeführt. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.

• PLoS ONE: Wiederherstellung von miR-1228 * Expression Unterdrückt Epithelial-mesenchymale Transition in Magenkrebs
• PLoS ONE: MDM2 SNP309 rs2279744 Polymorphismus und Magenkrebsrisiko: Eine Meta-Analyse