PLOS ONE: Superior antitumöraktivitet av Nanopartiklar Albumin-Bound Paclitaxel i Experimental Gastric Cancer

Abstrakt

Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen och saknar mycket effektiv behandling för avancerad sjukdom. NAB-paklitaxel är en ny mikrotubuli-hämmande cytotoxiska medel som inte har testats i magcancer i nuläget. I denna studie var humana magcancer-cellinjer AGS, NCI-N87 och SNU16 studeras. NAB-paklitaxel hämmade celltillväxt med en IC50 av 5 nM i SNU16, 23 nM i AGS och 49 nM i NCI-N87-celler efter 72 timmars behandling, vilket var lägre än den för oxaliplatin (1,05 M till 1,51 M) och epirubicin ( 0,12 pM till 0,25 pM). NAB-paklitaxel behandling ökat uttryck av den mitotiska spindlar tillhörande fosfor-stathmin oavsett baslinjen total eller fosforylerad stathmin nivå och inducerade mitotiska celldöd som bekräftats genom ökat uttryck av klyvs-PARP och kaspas-3. Efter en två veckors nab-paklitaxel, oxaliplatin eller epirubicin behandling var den genomsnittliga in vivo lokal tumörtillväxthämning Hastigheten var 77, 17,2 och 21,4 procent, respektive (p = 0,002). Effekter av terapi på tumör proliferativa och apoptotiska index motsvarade med tumörtillväxthämning data, medan uttryck av fosfor-stathmin ökade också i vävnader. Det fanns en ökning av mediandjuröverlevnad efter NAB-paklitaxel behandling (93 dagar) jämfört med kontroller (31 dagar, p = 0,0007), oxaliplatin (40 dagar, p = 0,0007) eller till docetaxel (81 dagar, p = 0,0416) . Den starka antitumöraktivitet av NAB-paklitaxel i experimentell ventrikelcancer stödjer sådan mikrotubuli-hämmande strategi för klinisk tillämpning. NAB-paklitaxel fördelar observerades oberoende av fosforylerad stathmin uttryck vid baslinjen, att ifrågasätta behandlingen av NAB-paklitaxel användning i magcancer baserat på denna förmodade biomarkörer

Citation. Zhang C, Awasthi N, Schwarz MA, Hinz S, Schwarz RE (2013) Överlägsen antitumöraktivitet av Nanopartiklar Albumin-Bound Paclitaxel i experimentell magcancer. PLoS ONE 8 (2): e58037. doi: 10.1371 /journal.pone.0058037

Redaktör: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Storbritannien

Mottagna: 20 november 2012, Accepteras: 29 januari 2013, Publicerad: 27 februari 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Författarna har inget stöd eller finansiering för att rapportera

konkurrerande intressen. författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är den fjärde vanligaste. cancer och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall över hela världen [1] - [3]. De flesta patienter har avancerad eller metastaserande sjukdom vid tidpunkten för diagnos [4], [5]. Kombinationen av oxaliplatin och 5-fluorouracil, med och utan epirubicin, har blivit den mest använda regim i första linjens behandling för avancerad magsäckscancer [6], [7]. Detta har dock kombinationsbehandling potentialen för betydande biverkningar och fortfarande bär begränsad effekt, medan patienternas prognos förblir dyster med en medianöverlevnad på cirka 10 månader [8] - [11]. I ett försök att förbättra överlevnaden och minska toxiciteten, är molekylärt målsökande terapi av aktivt undersökas för behandling av magsäckscancer [12].

Mikrotubuli har länge ansetts vara ett mål av intresse för vissa läkemedel mot cancer på grund av deras universella roll i celler som förökar och deras viktiga roll i mitos [13] - [15]. Paklitaxel och docetaxel är klassiska mikrotubuli-inhibitorer som utövar sin verksamhet genom att främja tubulinpolymerisering och stabilisering av mikrotubuli vilket resulterar i G2-M-fasen gripande och mitotiska celldöd [15]. Mitotisk celldöd är en form av celldöd som inträffar särskilt under mitotiska stadier induceras av DNA-skadande medel och spindel gifter /mitotiska hämmare [16], [17]; Det är främst kaspas beroende, men under ovanliga omständigheter kan också kaspas oberoende [18]. Paclitaxel har testats för avancerade och återkommande mag cancer med en svarsfrekvens på 43% i kombination med 5-fluorouracil och folinsyra [9], [19]. Jämfört med en svarsfrekvens på 38~45% gav genom en kombination av oxaliplatin och 5-fluorouracil och folinsyra, paklitaxel resulterade inte i överlägsen överlevnad men orsakade fler biverkningar, särskilt hos äldre patienter [9], [20] - [ ,,,0],22]. Paklitaxel krävs emulgering med lösningsmedel för att möjliggöra intravenös administrering vilket har resulterat i överkänslighetsreaktioner och potentiellt dramatiska biverkningar hos patienter [23], [24]. Nanopartikel albumin-bundet (nab) paklitaxel är en ny albumin-stabiliserad, kremofor fria och vattenlösliga nanopartikelformulering av paklitaxel. Det är tolererades väl utan några överkänslighetsreaktioner efter intravenös infusion [25]. Kliniska och experimentella studier har visat att jämfört med lösningsmedelsbaserade paklitaxel, NAB-paklitaxel hade högre lagring tumör, lägre toxicitet [23], [26] och mer potenta antitumöreffekter på bröstcancer, icke-småcellig lungcancer (NSCLC), pankreas cancer, melanom och huvud- och halscancer [27] - [31]. Emellertid är den potentiella rollen av NAB-paklitaxel i gastriska cancerceller inte testat i nuläget

Stathmin, en mikrotubuli-destabiliserande fosfoprotein, är en viktig reglerare av mikrotubuli polymerisering och dynamik [32] - [34]. och befanns vara relaterat till taxan motstånd i vissa tumörtyper genom att ändra läkemedelsbindning och fördröja G2-M fasövergång [33], [35]. Stathmin inhibition hade en synergistisk antiangiogen och antitumöraktivitet med taxol [36]. Stathmin expression har visat sig vara närvarande i en mängd olika humana cancerformer inklusive magcancer, och kan därför representera ett attraktivt mål för cancerterapi [34], [37], [38]. Jeon et al. funnit att stathmin kan tjäna som en prognostisk markör och ett potentiellt terapeutiskt mål för magcancer [37]. Fosforylering av stathmin minskar dess mikrotubuli destabiliserande effekter, ett fenomen som också har tillskrivits taxan aktivitet [34].

Denna studie utvärderade antitumöraktiviteter av NAB-paclitaxel i humana gastriska cancerceller in vitro och in vivo. Vi jämförde antitumör effekten av NAB-paclitaxel med andra cytostatika på lokal tumörtillväxt och djuröverlevnad. Vi mätte också ett uttryck för total stathmin och fosfor-stathmin in vitro och in vivo för att bedöma deras roll som prediktiva markörer i NAB-paklitaxel antitumörsvar.

Material och metoder

Cellodling och reagenser

de humana gastriska cancercellinjer AGS, NCI-N87 och SNU16 erhölls från American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) och odlades i RPMI 1640-medium (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO ) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i en fuktad 5% CO _{2 atmosfär. Nab-paklitaxel köptes från Abraxis BioScience (Los Angeles, CA). Oxaliplatin köptes från Sanofi Aventis (Bridgewater, NJ). Docetaxel, epirubicin och 5-fluorouracil erhölls från ett lokalt apotek. Cellproliferationen reagenset WST-1 köptes från Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).}

Cellviabilitet assay

Cellviabilitet utvärderades genom den kolorimetriska WST-1 assay. Mätningen är baserad på förmågan hos viabla celler att klyva det sulfonerade tetrazoliumsaltet WST-1 (4- [3- (4-jodfenyl) -2- (4-nitrofenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3- bensen disulfonat) genom mitokondriella dehydrogenaser [39]. Gastric cancerceller (5000 celler per brunn) ströks ut i en 96-brunnsplatta under ordinarie tillväxtmedium och behandlades med nab-paklitaxel, 5-fluorouracil, oxaliplatin och epirubicin efter 16 timmars inkubation. Utbudet av koncentrationer som används (1 nM till 10 | iM) var jämförbar med de kliniskt uppnåbara koncentrationer. Efter ytterligare inkubation av 72 timmar tillsattes 10 | il WST-1-reagens tillsattes i varje brunn följt av inkubering under 2 timmar. Absorbansen vid 450 nm mättes med användning av en mikroplattläsare.

Cellcykelanalys

Cellcykelanalys utfördes genom flödescytometri med fluorescerande propidiumjodid (PI) färgning. Celler odlades och behandlades med nab-paklitaxel, oxaliplatin, epirubicin och docetaxel för 8 till 24 timmar. Celler uppsamlades därefter och fixerades i 75% etanol-PBS över natt vid -20 ° C. Cellerna centrifugerades under 5 min vid 2000 x g. Cellpelleten återsuspenderades och inkuberades i 0,05 mg /ml PI, 0,1% Triton X-100, och 1 mg /ml RNAs A i PBS under 45 min vid rumstemperatur. Suspensionen analyserades sedan på en Becton Dickinson FACScan. Förhållandet av celler i sub-G1, G1, S och G2-M-faserna av cellcykeln bestämdes genom deras DNA-innehåll.

Immunocytokemisk analys

Gastric cancerceller (1 x 10 ^{5 celler per kammare) ströks ut i en fyra-kammar glida under ordinarie odlingsmedium. Efter 24 timmar behandlades cellerna med NAB-paklitaxel under 16 timmar och sedan fixeras i 4% paraformaldehyd. Celler inkuberades med CAS blockeringsbuffert följt av en timmes inkubering med fosfo-stathmin antikropp (1:100) och 40 minuter inkubation med Cy3 (1:200 utspädning) sekundär antikropp. Glasen monteras med monteringslösning innehållande 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fluorescensmikroskopi användes för att detektera fluorescerande signaler med hjälp av IX81 Olympus mikroskop utrustat med en Hamamatsu Orca digitalkamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ).}

Western blot-analys

Sub-sammanflytande monoskikt av celler behandlades med NAB-paklitaxel, oxaliplatin och epirubicin. Cellysat och tumör lysat erhölls såsom tidigare beskrivits [40]. Supernatanter återvanns genom centrifugering vid 13000 rpm, proteinkoncentrationer mättes och lika mängder av totalt protein separerades med SDS-PAGE. Proteiner överfördes till PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA) och membranen blockerades under en timme i TBS-T. Membranen inkuberades över natten vid 4 ° C med följande antikroppar: total stathmin, fosfo-stathmin (ser38), klyvs poly (ADP-ribos) polymeras-1 (PARP-1), klyvs kaspas-3 (alla från Cell Signa Technology , Beverly, MA), α-tubulin och β-aktin (båda från Sigma, St. Louis, MO). Membranen inkuberades sedan med de motsvarande HRP-konjugerad sekundära antikroppar (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) för en timme. Specifika band detekterades med användning av den förstärkta chemoilluminescence reagens (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) på autoradiografisk film.

Subkutan tumörtillväxt studie

Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjer och godkända protokoll från University of Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional Animal Care och användning kommittén (Tillståndsnummer 2012-0081). Djuren övervakades dagligen under hela försöket för några tecken på ångest. Kvinna SCID-möss (6 till 8 veckor) användes för jämförande modellering av subkutan tumörtillväxt. Gastric cancerceller (10 × 10 ^{6 NCI-N87 eller 20 × 10 6 SNU16 celler) injicerades subkutant i varje mus. Mössen vägdes två gånger i veckan. Fjorton dagar efter tumörcellinjektion, alla möss hade mätbar tumör (en medeltumörstorlek av 100 till 150 mm 3). Mössen delades sedan slumpvis grupperade (n = 6~8 per grupp) och behandlades intraperitonealt med PBS (kontroll), NAB-paklitaxel (10 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan), oxaliplatin (5 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan), och epirubicin (1 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan) i 14 dagar. Tumörstorleken mättes två gånger i veckan via tjocklek, och tumörvolymen (V) beräknades genom användning av formeln V = ½ [L x (W) 2], L = längd och W = bredd. Relativ tumörvolym (RTV) bestämdes enligt formeln RTV = V _{n /V 0 där V 0 och V 1 representerar tumörvolymen vid dag 0 och den efterföljande mätningen dag, respektive. Tumörtillväxthämningsvärdet beräknades genom användning av formeln (1-RTVt /RTVc) x 100% där t och c representerar behandling och kontrollgruppen. Efter avslutad behandling, var alla möss avlivades med CO2, tumörer avlägsnades, vägdes, dissekeras och bearbetas för histologisk, immunhistokemisk och Western blot-analys.}}

Immunhistokemisk analys

Tumörvävnadsprover fixerades i 4% paraformaldehyd och inbäddades i paraffin. Intratumoral proliferation mättes genom Ki67 nukleär antigen-färgning enligt tillverkarens protokoll (Abcam, Cambridge, MA). Paraffininbäddade vävnadssnitt skars (5 ^ m), avparaffinerades, rehydratiseras och antigen hämtas. Vävnadssnitt inkuberades med CAS blockeringsbuffert följt av en timmes inkubation med 1:200 spädning av primär Ki67 eller fosfor-stathmin antikropp (1:200) och 40 minuters inkubation med Cy3 (1:200 utspädning) sekundär antikropp. Glasen monteras med monteringslösning innehållande 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen). Intratumoral proliferativ index och stathmin aktivitet utvärderades genom att beräkna positiva celler från fem olika hög effekt fält (HPF) i en blindad sätt. Intratumoral apoptotisk aktivitet utvärderades genom färgning vävnadssnitt med "Apoptag Apoptos Detection Kit" enligt tillverkarens (Millipore) instruktioner. Fluorescensmikroskopi användes för att detektera fluorescerande signaler med hjälp av IX81 Olympus mikroskop utrustat med en Hamamatsu Orca digitalkamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) och en DSU spinn konfokala enhet med hjälp Slidebook programvara (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).

Animal överlevnadsanalys

djur~~POS=TRUNC studier~~POS=HEADCOMP överlevnad utfördes med användning av 6- till 8 veckor gamla kvinnliga SCID möss [41]. Mössen injicerades intraperitonealt med SNU16 (40 × 10 ^{6) celler och kroppsvikt mättes två gånger i veckan. Tre veckor efter tumörcellinjektion mössen slumpvis grupperade (n = 6 till 8 per grupp).}

I den första överlevnadsstudie, behandlades mössen intraperitonealt med PBS (kontroll), NAB-paklitaxel (10 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan) och oxaliplatin (5 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan) i 2 veckor. I den andra överlevnadsstudie behandlades möss intraperitonealt med PBS (kontroll), NAB-paklitaxel (10 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan), docetaxel (3 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan ) eller oxaliplatin (5 mg /kg i 100 pl PBS, 2 gånger i veckan) i 2 veckor. Djurens lidande minskades euthanizing när du svänger döende enligt fördefinierade kriterier, bland annat snabb viktminskning eller vinst (> 15%), underlåtenhet att äta eller dricka, letargi, oförmåga att hålla sig upprätt och brist på styrka. Djuröverlevnad utvärderades från den första dagen av behandlingen tills döden.

Statistisk analys

Överlevnadsanalys utvärderades med GraphPad Prism 5 Software (GraphPad Software, San Diego, CA). In vitro cellproliferations Data uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Statistisk analys utfördes med ANOVA för jämförelse flera grupp och t-test för gruppen jämförelse individen. Överlevnad gruppjämförelse utfördes via log-rank test inom en analys Kaplan-Meier-typ. Värden på p < 0,05 ansågs representera statistiskt signifikanta skillnader grupp

Resultat

Stathmin uttryck i gastric cancerceller

Analys av den mänskliga gastric cancerceller AGS, nci. N87 och SNU16 visade att alla tre linjer uttryckte stathmin. Ingen skillnad av total stathmin expression hittades bland dessa tre cellinjer. Expression av fosfo-stathmin varierade mellan cellinjer, i följande ordning: SNU16 > AGS > NCI-N87-celler (Figur 1A).

Nab-paklitaxel inhiberar gastrisk cancercelldelning

Nab-paklitaxel hämmade magcancer cellproliferation på ett dos-beroende sätt, och hämning av cellproliferation dök att följa samma ordning som uttryck av fosfo-stathmin (Figur 1B). Vid 100 nM koncentration hämning i celltillväxt var 94,5, 66,7 och 41,8 procent i SNU16, AGS och NCI-N87-celler respektive. NAB-paclitaxel uppvisade den högsta antiproliferativa potensen med en lägsta effektiva dos som finns i alla 3 testade cellinjer jämfört med 5-fluouracil, oxaliplatin och epirubicin. IC _{50 av NAB-paklitaxel var 5 nM i SNU16, 23 nM i AGS och 49 nM i NCI-N87-celler, som var mindre än 5-fluouracil (6,46 iM i SNU16 > 10 nm i AGS och 10,2 iM i NCI-N87-celler), oxaliplatin (1,51 iM i SNU16, 1,64 | iM i AGS och 1,05 | iM i NCI-N87 celler) eller epirubicin (0,12 iM i SNU16, 0,16 | iM i AGS och 0,25 | iM i NCI-N87-celler) ( Figur 1C).}

Nab-paklitaxel inducerar G2 gripande och mitotisk celldöd in vitro

för att utvärdera den bakomliggande mekanismen av tillväxthämning genom haffar-paklitaxel, cellcykelprofil analyserades. Såsom visas i fig 2A, NAB-paklitaxel (100 nM) resulterade i G2-M-cellcykelstopp vid SNU16 celler. Den procentuella andelen av propidiumjodid positiva celler i G2-M-fas ökade från 35,6 till 71,6 efter 100 nM NAB-paklitaxel behandling under 12 timmar. Liknande förändringar skett i AGS och NCI-N87-celler med NAB-paklitaxel och docetaxel behandling men inte med oxaliplatin och epirubicin behandling (figurer S1 och S2).

Effekt av NAB-paklitaxel på mitotiska celldöd, uttryck av fosfo -stathmin och apoptosrelaterade proteiner mättes genom immunocystochemistry och Western blöt. NAB-paklitaxel behandling orsakade mikrotubuli störningar och mitotiska gripanden i gastric cancerceller som observerades av kärnan fragmentering och karyopyknotiskt (Figur 2B). Expression av fosfo-stathmin ökades efter nab-paklitaxel behandling, och högre uttryck av fosfo-stathmin associerades med en större grad av mitotiska anhållanden, nucleus fragmentering eller karyopyknotiskt, och celldöd (figur 2B och 2C). Nukleär fragmentation och karyopyknotiskt inträffade i 16,7% av celler med låg expression av fosfo-stathmin men i 95,7% av celler med hög expression av fosfo-stathmin (r = 0,672, p < 0,001). Det fanns också bevis för tidsberoende ökat uttryck av fosfor-stathmin genom NAB-paklitaxel behandling (figur 2D).

Vi undersökte om den mitotiska celldöd inducerad av NAB-paklitaxel kunde delvis korreleras med induktion av apoptos . Utvärdering av PARP-1-klyvning och kaspas-3-klyvning som markörer för induktion i apoptos avslöjade att i gastriska cancerceller nab-paklitaxel, orsakade oxaliplatin och epirubicin behandling en ökning i uttrycket av både spjälkas PARP-1 och kaspas-3. Detta uttryck av apoptosrelaterade proteiner verkade högre efter NAB-paklitaxel behandling jämfört med oxaliplatin eller epirubicin behandlingar (Figur 2E).

Nab-paklitaxel hämmar tillväxten av magcancer xenografter

In vivo antitumör effekterna av NAB-paklitaxel utvärderades i en murin xenograft modell med SNU16 celler. NAB-paklitaxel vid 10 mg /kg i veckan under två veckor tolererades väl två gånger utan uppenbara tecken på toxicitet som bedöms av mus vikt och daglig bedömning. Efter en två veckors behandling, nab-paklitaxel terapi resulterade i statistiskt signifikant tumörväxtinhibition (p = 0,0004) som var större än de hos oxaliplatin (p = 0,0361) och epirubicin (p = 0,032) jämfört med vehikelkontroll, respektive (Figur 3A). Tumörtillväxthämning hastigheten efter en 2-veckors behandling med nab-paklitaxel, oxaliplatin och epirubicin var 77, 17,2 och 21,4 procent (p = 0,002), respektive. Endast NAB-paklitaxel behandling skapat en storleksminskning av subkutana lesioner jämfört med deras förutbestämda tumörstorlek. Medeltumörvikten minskade signifikant genom NAB-paklitaxel behandling (0,154 ± 0,075 g vs. 0,756 ± 0,232 g, p = 0,037), men inte av oxaliplatin (0,408 ± 0,12 g) eller epirubicin (0,46 ± 0,172 g) behandling jämfört med vehikel kontroll, respektive (figur 3A). Vi utvärderade också antitumöreffekterna av NAB-paklitaxel på NCI-N87 xenotransplantat mus lokala tumörer. Efter två veckors behandling, NAB-paklitaxel terapi resulterade i signifikant tumörvolymen hämning (p = 0,0023) (figur 3B) och tumörtillväxthämningshastigheten var 72,8 procent. Medeltumörvikt i NAB-paklitaxel behandlingsgrupp var signifikant lägre än den i vehikelgruppen (0,093 ± 0,026 g vs. 0,288 ± 0,02 g, p = 0,0054) (figur 3B). Ingen signifikant förändring i mus kroppsvikt observerades i någon av NAB-paclitaxel, oxaliplatin eller epirubicin terapigrupper.

Nab-paklitaxel inducerar mitotiska celldöd in vivo

Mekanismer för in vivo antitumöraktivitet av NAB-paklitaxel undersöktes vidare i tumörvävnad som erhållits från SNU16 och NCI-N87 xenotransplantat. En signifikant ökning i uttrycket av fosfo-stathmin observerades i SNU16 (Figur 4A) och NCI-N87 (Figur 4B) xenograft tumörer med behandling av NAB-paklitaxel med både immunhistologisk och Western blot-analyser.

Tumör vävnad från nAB-paklitaxel behandlade möss visade en minskad tumörcelltillväxt hastighet. En Ki67 uttryck baserad intratumoral proliferativ index sjönk med 90,7% (p = 0,001) jämfört med kontroller i NAB-paklitaxel behandlade gruppen, till skillnad från 72,6% (p = 0,004) i oxaliplatin-behandlade gruppen och 67,7% (p = 0,003 ) i epirubicin behandlade gruppen (figur 5A). Nab-paklitaxel orsakade en starkare hämmande effekt på tumörcellproliferation än oxaliplatin och epirubicin.

Undersökning av apoptos i tumörvävnader visade att induktion i apoptotiska index var 7,9-faldigt i NAB-paclitaxel-gruppen (p = 0,013 ), 5,7-faldigt i oxaliplatinbaserade behandlade djur (p = 0,024), och 5,2-faldig i epirubicin behandlade gruppen (p = 0,042) över baslinjen inom kontrollgruppen (figur 5B).

Nab-paclitaxel ökar djuröverlevnad

i den första överlevnadsstudie, medianöverlevnad för SCID-NOD-möss var 24 dagar i kontrollgruppen. Denna ökade till 86 dagar efter nab-paklitaxel behandling (p = 0,0004 i förhållande till kontrollgruppen, p = 0,0005 jämfört med oxaliplatin-grupp) och 37,5 dagar efter oxaliplatin behandling (p = 0,0004 i förhållande till kontrollgruppen). Gruppen överlevnadsintervall var också överlägsen efter NAB-paklitaxel behandling (intervall: 75 till 95 dagar) jämfört med behandling med oxaliplatin. (Intervall: 34 till 41 dagar) (figur 6A) Review

I den andra överlevnadsstudie, median överlevnad SCID-NOD-möss var 31 dagar i kontrollgruppen. Denna ökade till 93 dagar efter nab-paklitaxel behandling (p = 0,0007 mot kontroll och oxaliplatin grupp, och p = 0,0416 jämfört med docetaxel grupp), till 81 dagar efter docetaxel behandling (p = 0,0007 jämfört med kontroller) och till 40 dagar genom oxaliplatin behandling (p = 0,038 vs kontrollgrupp). Gruppen överlevnadsintervall var 75 till 96 dagar efter NAB-paklitaxel behandling jämfört med docetaxel behandling (intervall: 74 till 93 dagar) och oxaliplatin behandling (intervall: 35 till 45 dagar). (Figur 6B) Review

Diskussion

Avancerat magsäckscancer är livshotande och utgör en formidabel behandling utmaning. Traditionella dubbel- eller trippel cytotoxiska kemoterapier har begränsade effekter och kan orsaka biverkningar och chemoresistance [42] - [44]. Den aktuella studien visar tydligt att NAB-paclitaxel har betydligt starkare antitumöreffekter på gastric cancercellinjer än vad som nu används cytostatika oxaliplatin och epirubicin in vitro och in vivo, mätt med antiproliferativa effekter, apoptos, mitotiska celldöd, lokaliserad antitumör respons och överlevnad relaterad till tumörbörda.

in vitro studie visade att nAB-paclitaxel är mycket potent i att hämma celltillväxt för mänskliga gastric cellinjer än oxaliplatin och epirubicin. SNU16-celler är mer känsliga för nab-paklitaxel än NCI-N87-celler. Vissa studier har visat att stathmin korrelerade med taxan motstånd och stathmin knockdown kan öka känsligheten för taxan [33], [36]. Vi testade uttrycket av stathmin och fann ingen skillnad bland dessa tre cellinjer. Intressant, när vi undersökte uttrycket av fosfo-stathmin fann vi att förmågan hos NAB-paklitaxel för att hämma in vitro celltillväxt var i samma rangordning som ett uttryck för fosfor-stathmin i dessa tre gastriska cancerceller: SNU16 > AGS > NCI-N87. Det föreföll därför inledningsvis att fosfor-stathmin uttryck korrelerade med NAB-paklitaxel effektivitet, utlåning visst stöd till en hypotes att fosfor-stathmin kan tjäna som en potentiell biomarkör för att förutsäga NAB-paklitaxel antitumörsvar i magcancer behandling.

Vi utförde en NCI-N87 xenotransplantat studie för att utvärdera antitumöreffekten av NAB-paclitaxel. Snarare oväntat, NAB-paclitaxel signifikant hämmade NCI-N87 xenotransplantat tumörtillväxt jämfört med kontrollgruppen. Dessa något avvikande resultat verkar antyda att in vivo antitumöreffekt av NAB-paklitaxel i magcancer kan vara oberoende från baslinjen uttrycket av fosfo-stathmin eller total stathmin. Eftersom endast tre cellinjer testades, kan vi inte göra en definitiv slutsats om förhållandet mellan stathmin eller fosfor-stathmin och NAB-paklitaxel effekt i magcancer. Ytterligare forskning med stathmin knackade-outs bör vara användbara för att ta itu med denna fråga och undersöka vilken roll stathmin som biomarkör för NAB-paklitaxel effekt.

I denna studie, vi jämförs sedan antitumöreffekterna av nab paklitaxel med oxaliplatin och epirubicin på SNU16 xenograft lokala tumörer. NAB-paklitaxel visade starkare antitumör effekt än oxaliplatin och epirubicin som överensstämde med in vitro cellproliferations resultat och tumörvävnad celltillväxt och apoptos uppgifter. Även om 5-fluouracil är den mest etablerade monoterapi läkemedel i kemoterapeutisk magsäckscancer vård, är tumörrespons av 5-fluorouracil rapporteras vara otillräckligt förutspådde i SCID musmodeller till den punkt där även några antitumöreffekter har observerats [45]. Cisplatin och oxaliplatin, mer kraftfulla inducerare av apoptos och även som ofta används vid magcancer kemoterapeutisk behandling, har valts ut oftare som medel för jämförelseändamål med nya medel som skall testas [22], [45]. Lösningsmedelsbaserade paclitaxel har fler biverkningar och inte lägga fördelar överlevnad jämfört med oxaliplatin i klinisk behandling av magsäckscancer [22]. I våra studier, gjorde oxaliplatin inte skiljer sig statistiskt från epirubicin. Vi väljer därför oxaliplatin som en baslinje medel i djuröverlevnad studie och funnit att NAB-paklitaxel ökade median mus överlevnad med ungefär 40 dagar under oxaliplatin, en mer än dubbel effekt än vad som uppnås med oxaliplatin. Docetaxel verkar vara mer aktiva taxan, med snabbare cellulärt upptag och längre intracellulär lagring jämfört med lösningsmedelsbaserade paklitaxel [46]. Vi utförde en annan överlevnadsstudie att jämföra antitumöreffekterna av NAB-paklitaxel med docetaxel och fann att medianöverlevnadstiden var något förlängas efter NAB-paklitaxel behandling (93 dagar jämfört med 81 dagar, p = 0,0416). Våra resultat överensstämde med resultaten från en färsk bröstcancer prov för fas II, som visade att 100 mg /m ^{2 NAB-paklitaxel hade förlängd medianöverlevnad (hazard ratio 0,575, p = 0,008) jämfört med docetaxel [47]. Baserat på våra resultat, NAB-paklitaxel visade starkare antitumör effekt i experimentell magcancer och verkar representera en någorlunda potent ny kemoterapeutiskt medel för klinisk magcancer behandling.}

Stathmin är en viktig mikrotubuli mikrotubuli-destabiliserande fosfoprotein. När stathmin fosforyleras, dess mikrotubuli-destabiliserande aktivitet minskade [32], [34] och detta kan förbättra känsligheten för taxan. Stathmin fosforyleras främst på cyklin-beroende proteinkinas (CDK) bindningsställe Ser38 i mitos [32], så vi fokuserat vår uttryck analyser på ser38 återstod. Vi fann att NAB-paklitaxel behandling ökade fosfor-stathmin uttryck in vitro och in vivo och var korrelerad med mitotiska gripanden, nukleär fragmentation, karyopyknotiskt och mitotisk celldöd. Mitotiska celldöd inträffade i dessa celler med hög expression av fosfor-stathmin. Zhou et al. [33] fann att nedregleras stathmin uttryck efter STMN1 gen knockdown i levercancer cell lagt 7,7-faldig känslighet nab-paklitaxel och 2,7-faldig känslighet för lösningsmedelsbaserade paklitaxel men ingen känslighet för doxorubicin. Den molekylära naturen som utlöser celldöd under långvarig mitotiska arrestering fortfarande dåligt definierade [17], [32]. Spindelmonterings vägspärrar har länge ansetts spela en avgörande roll under denna process [48]. I denna studie, NAB-paklitaxel inducerade fosforylering av stathmin i gastric cancerceller, vilket förväntas stabilisera mikrotubuli apparaten, vilket i sin tur kan leda till mitotiska gripanden och utlösa celldöd. Även om dessa är tidiga och preliminära uppgifter, visst stöd för fosfor-stathmin reglerar NAB-paklitaxel antitumöraktivitet har observerats och förtjänar att utvärderas ytterligare.

Sammanfattningsvis visar denna studie att monoterapi haffar-paclitaxel hade starkare antitumöraktivitet i experimentella magcancer än den nuvarande standarden kemoterapeutiska medel oxaliplatin och epirubicin, och verkade vara överlägsen taxan jämfört med docetaxel. Denna starka antitumöraktivitet stöder den logiska grunden för klinisk utvärdering av NAB-paklitaxel som lovande mikrotubuli-hämmande agens i magcancer.

Bakgrundsinformation
figur S1.
Nab-paklitaxel leder till G2-M-fasen rest i gastric cancerceller. (A) Histogram visar cellcykelprofiler av AGS och NCI-N87-celler vid olika tidpunkter efter nab-paklitaxel behandling. Gastriska cancerceller odlades i 24 timmar och behandlades sedan med 100 nM NAB-paklitaxel i 12 timmar eller 24 timmar. Cellcykelanalys utfördes genom flödescytometri. Resultaten som visas är representativa för två oberoende försök. (B) Cellcykelfördelning för gastric cancerceller som behandlats med 100 nM NAB-paklitaxel. . Symbol * markerar förhållanden under vilka celler hade upplösts
doi: 10.1371 /journal.pone.0058037.s001
(TIF) Review figur S2.
cellcykelprogression av gastriska cancerceller som behandlas med oxaliplatin, epirubicin och docetaxel. (A) histogram visar cellcykelprofiler av SNU16 och AGS-celler efter oxaliplatin epirubicin och docetaxel behandling. Gastriska cancerceller odlades i 24 timmar och behandlades därefter med 10 | iM nab-paklitaxel, oxaliplatin, epirubicin och docetaxel i 8 timmar. Cellcykeln utfördes genom flödescytometri. Resultaten som visas är representativa för två oberoende försök.

• PLOS ONE: Återställande av MIR-1228 * Expression Dämpar Epithelial-Mesenkymala Övergång i Gastric Cancer
• PLOS ONE: MDM2 SNP309 rs2279744 Polymorfism och Gastric Cancer Risk: en metaanalys