PLoS ONE: MicroRNA-338 inhiboi, ja metastaasit mahasyövän mukaan Targeting NRP1 Expression

tiivistelmä

NRP1 kuten monitoiminen kuin tyrosiinia nikinaasireseptoreiden kriittisiä rooleja syövän etenemiseen. MikroRNA (miRNA) ovat tärkeä luokka tunkeutuvan geenit, jotka ovat mukana erilaisia ​​biologisia toimintoja, erityisesti syöpä. On edelleen epäselvää, onko miRNA voi säädellä ilmentymistä NRP1. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa miRNA jotka voisivat estää kasvun, invaasio ja etäpesäkkeiden mahasyövän suuntaamalla NRP1 ilme. Huomasimme, että miR-338 ilmentyminen väheni mahasyövän solulinjoissa ja mahasyövän kudoksissa. Lisäksi olemme havainneet, että miR-338 esti mahasyövässä solumigraation, invaasio, proliferaatio ja edistää apoptoosin kohdistamalla NRP1 ilme. Koska ylävirran säätelijänä NRP1, miR-338 suoraan tavoitteet NRP1. Pakko ilmentyminen miR-338 esti fosforylaatiota Erk1 /2, P38 MAPK ja Akt; kuitenkin, ilmaus fosforyloidun Erk1 /2, P38 MAPK ja Akt palautettiin yliekspressio NRP1. Vuonna AGS infektoidut solut miR-338 tai transfektoidaan SiNRP1, proteiinin tasoja fibronektiinin, vimentiinin, N-kadheriinin ja SNAIL laskivat, mutta ilmentyminen E-kadheriinin lisättiin. Ilmaisu Mesenkymaalisten merkkiaineiden miR-338-ilmentävien solujen palautui normaalille tasolle palauttaminen NRP1 ilmaisun. In vivo
, miR-338 myös vähentynyt kasvaimen kasvua ja tukahdutti D-MVA kohdistamalla NRP1. Sen vuoksi päättelemme, että miR-338 toimii uutena tuumorisuppressorigeenin mahasyövän. miR-338 voi pienentää vaeltavia, invasiivisia, proliferatiivisia ja apoptoottisten käyttäytymistä sekä mahasyövän EMT, se vaimentaa ilmaus NRP1.

Citation: Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) MicroRNA-338 inhiboi, ja metastaasit mahasyövän mukaan Targeting NRP1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10,1371 /journal.pone.0094422

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 18 lokakuu 2013; Hyväksytty: 16 maaliskuu 2014; Julkaistu: 15 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Peng, et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat hanketta Science and Technology komitean Shapingba alueella Chongqing (201302). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Neuropilins, kuten neuropilin1 (NRP1) ja neuropilin2 (NRP2), ovat monipuolisia kuin tyrosiinia nikinaasireseptoreiden, jotka tunnistettiin perustuen heidän kriittisiin roolit kehittyvässä hermostossa [1]. Nrp1 ja NRP2 on 44% homologia ja jakaa monia rakenteellisia ja biologisia ominaisuuksia. NRP1 pääasiassa olemassa bloodvesselendothelia, ja NRP2 esiintyy pääasiassa imusuonten [2], [3]. Myöhemmät tutkimukset tunnistettu NRP-1 reseptorina verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) -A isoformi VEGF-165 sekä endoteelisoluissa ja joissakin kasvainsoluissa [4], [5]. Tutkimus on osoittanut, että NRP1 on säädelty useilla kasvain tyypit ja ilmaistaan ​​eri kasvaimen vasculatures [3], [6], mikä viittaa siihen, että NRP1 on ratkaiseva merkitys syövän etenemiseen. Varhainen tutkimus paljasti, että NRP1 voivat vaikuttaa kasvainten kasvua kuin koreseptoria VEGFR [5]. Tutkijat myöhemmin todettiin, että NRP1 voisi lisätä tumorangiogenesis, kiihdyttää kasvaimen kasvua ja hillitä kasvaimen apoptoosin ilman VEGFR [7]. NRP1 voi olla koreseptoria muita kasvutekijöitä, jossa selvennetään vuoksi VEGF voi viestiä läpi neuropilins puuttuessa VEGFR-1 tai VEGFR-2 [8], [9]. Koska koreseptoria on TβRI /TβRII, NRP1 voi hillitä kasvaimen apoptoosin ja kiihdyttää kasvaimen kasvua kautta sekä kanoninen ja ei-kanoninen signalointi [10]. NRP1, kuten koreseptori on PDGFR /cMET, voi lisätä tumorangiogenesis kautta p38MAPK ja ERK signalointi [11].

ylävirtaan sääntelyn geenit NRP1, transkriptiotekijät SP1 /3 ja AP1 voi säädellä ilmentymistä NRP1 [ ,,,0],12]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että butyraatti n ekspressiota vähentävän neuropi- I peräsuolen solulinjoissa kautta estämällä SP1 transaktivaation [13].

MikroRNA (miRNA) ovat ei-koodaavan RNA-molekyylien noin 21-23 nukleotidin pituisia, että säädellä geeniekspressiota at transkription jälkeisellä tasolla [14], [15], [16]. miRNA ilmaisun profilointi analyysit ovat paljastaneet maailmanlaajuisen alas-säätely kypsä miRNA tasoilla ensisijainen ihmisen kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin [17], [18]. Siten miRNA voi toimia tuumorisuppressorien tai onkogeenien ja säädeltyyn miRNA ilmaisun voisi edistää kasvainsolujen etäpesäkkeitä. On edelleen epäselvää, onko miRNA voi säädellä ilmentymistä NRP1; Siksi pyrimme määrittämään tavoite miRNA of NRP1. Muita toimintoja NRP1 voi paljastua tutkimalla tavoite miRNA on NRP1.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmisen kudosnäytteet ja Solulinjat

Tässä tutkimuksessa käytettiin tuoreita kudoksissa, mukaan lukien 41 ihmisen mahasyövän näytteet ja 24 näytettä vierekkäisten normaalin limakalvokudoksille peräisin 41 potilasta, joille tehtiin leikkaus toisen Affiliated sairaala Chongqing Medical University välillä 2012 ja 2013. Tämä tutkimus suoritettiin mukaan "Biomedical Research osallistuminen ihmisen eettinen arviointi (alustava) "sääntely terveysministeriön ja Helsingin julistuksen eettiset periaatteet lääketieteellisen tutkimustyön ihmiseen kohdistuvan. Kaikki näytteet, jotka on saatu tietoinen suostumus potilaiden ja kokeet hyväksynyt Institutional Review Board toisen Affiliated sairaala Chongqing Medical University. Kaikki osallistujat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen osallistumaan tähän tutkimukseen.

SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 ja N87 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA , USA), ja GES-1 solulinja hankittiin Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Solulinjoja viljeltiin RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO2.

Alukkeet, RNA: n eristäminen ja miRNA Detection

Alukkeet miR-338-3p ja U6 tuotettiin käyttäen miScript Primer Assay kit (Qiagen Dusseldorf Saksa). Sekvenssit miRNA käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG ja U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Käänteinen alukkeita käytettiin myös käänteistranskriptio vaiheessa. Yhteensä miRNA uutettiin viljellyistä soluista ja ihmisen kudosnäytteiden avulla RNAiso Small RNA (Takara Bio, Otsu, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Poly-A-hännät lisättiin miR-338 ja U6 kanssa miRNA Reaction Buffer Mix (TaKaRa Bio), ja sen jälkeen cDNA syntetisoitiin 5 ng kokonais-RNA: sta käyttäen miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (TaKaRa Bio). Reaaliaikainen PCR suoritettiin CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad), jossa SYBR Esisekoite Ex Taq II (Takara Bio). PCR-olosuhteet olivat 95 ° C 30 s, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Tiedot normalisoitiin vastaan ​​U6 snRNA. Monistuksen jälkeen, sulamiskäyrä-analyysi suoritettiin spesifisyyden varmistamiseksi tuotteita.

pcDNA Ekspressioplasmidit ja plasmiditransfektiolla

ORF-sekvenssi NRP1 monistettiin genomisesta DNA: sta eristettiin AGS solusta linja, ja ORF alueen NRP1 cDNA alakloonattiin sitten GV230 vektoriin (GeneChem Corporation, Shanghai, Kiina) kantavassa plasmidi transfektoitiin AGS ja MKN45-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty tuntia transfektion jälkeen soluja käytettiin pelastus kokeilu. AGS-soluja, jotka oli stabiilisti transfektoitu NRP1 valittiin käyttäen 2 ug /ul puromysiiniä (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Ranska), 48 h transfektion jälkeen.

miRNA Gene kloonaus ja Ectopic Expression

ihmisen miR-338-geeni PCR-monistettiin normaalin genomisen DNA: n ja kloonattiin lentivirusvektoria. Lentivirukset tuotettiin kotransfektiolla HEK293T-solujen plasmideilla PGC-LV, pHelper 1,0 ja pHelper 2,0 käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Virukset kerättiin 48 h transfektion jälkeen, ja infektiot suoritettiin, kun läsnä oli 2 mg /ml polybreenin (GeneChem Corporation). Ohjaus miRNA viruse ostettiin GeneChem Corporation (Shanghai, Kiina). AGS soluja, jotka oli stabiilisti tartunnan miR-338 valittiin käyttäen 2 ug /ul puromysiiniä (Invitrogen) 48 h kuluttua tartunnasta.

Gene Expression Knockdown RNA-Interference

NRP1 ilmentyminen AGS solut hiljennettiin transfektoimalla seuraavat kohdistetut siRNA sekvenssit (Sangon Biotech, Shanghai, Kiina) ja Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (jos ei ole määritelty, siRNAkäytettiin). Ohjaus siRNA (sic) on luoda viemällä 4 emässubstituutiota in NRP1 kohdennussekvenssin (GATAGGTCATGACTGCCC). Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, NRP1 ilmentyminen tutkittiin immunoblottauksella.

Luciferase Reporter Assay

PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA tavoite ekspressiovektoria käytettiin 3'-UTR Lusiferaasimäärityksiä (Sangon Biotech, Shanghai, Kiina). Tavoitteena onkogeeni on miRNA-338 valittiin sen perusteella, online mikroRNA kohdetietokannan http://www.microrna.org/microrna/home.do. Aluke sekvenssit villityypin 3'UTR olivat seuraavat: eteenpäin: 5'-CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 'ja reverse 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3'. Koska on olemassa kaksi sitoutumiskohtaa on NRP1 3'UTR, suunnittelimme kaksi alukesekvensseissä mutantti 3'UTR. Yksi mutantti 3'-UTR, alukkeen sekvenssit olivat seuraavat: eteenpäin: 5'-GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'ja reverse: 5'-GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. Muiden mutantti 3'-UTR, alukkeen sekvenssit olivat seuraavat: eteenpäin: 5'-GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'ja reverse: 5'-GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. Lusiferaasin määritys, Lipofectamine 2000 käytettiin cotransfect MKN45 solujen HSA-miR-338 ja PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA tavoite ekspressiovektoreita, jotka sisältävät villin tyypin tai mutantti-kohdesekvenssien. Tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA) 18 h transfektion jälkeen, ja tulokset normalisoitiin vastaan ​​Renilla lusiferaasi. Kukin toimittaja transfektoitiin vähintään kolme kertaa (eri päivinä), ja kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

elinkykyyn ja Clonability Analyysit

Transfektoidut solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 1 x 10 ^{4 solua /kuoppa. MTT-liuosta (20 ui 5 mg /ml MTT) lisättiin viljelmiin (yhteensä tilavuus 200 ui) ja inkuboitiin 4 hattu 37 ° C: ssa. Poistamisen jälkeen kasvualustan, jäljellä olevat kiteet liuotettiin DMSO: hon, ja absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin. Sillä pesäkemuodostusta, solut ympättiin alhainen tiheys (1000 solua /levy) ja annettiin kasvaa, kunnes näkyvissä pesäkkeitä ilmaantui. Sitten solut värjättiin Giemsa, ja pesäkkeet laskettiin.}

Muuttoliike ja Invasion Analyysit

siirtokuoppaan muuttoliike määrityksissä, 10 x 10 ^{4 solut levytettiin yläkammiossa ei-päällystetty kalvo (24-kuoppaisilla insertti, 8 mm: n huokoskoko, BD Biosciences). Sillä invaasio määrityksiä, 2 x 10 5 solua maljattiin alkuun kammio Matrigel päällystetty kalvo (24-kuoppaiset insertti; 8 mm huokoskoko BD Biosciences). Sekä määrityksiä, solut maljattiin seerumittomassa elatusaineessa, ja väliaineessa, jota täydensi 10% seerumia käytettiin kemoattraktantti alemmassa kammiossa. Soluja inkuboitiin 16 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO 2: ssa kudosviljelyinkubaattorissa. 16 tunnin kuluttua, ei-siirretyn /ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä puolin transwell kalvosuodattimella insertit käyttämällä pumpulipuikolla pyyhkäisynäytteitä. Siirrettyjä /hyökkäsi solujen alareunan inserttien värjättiin Giemsa, ja solut laskettiin.}

Vasta-aineet

Vasta-aineita fibronektiinin, vimentiinin, N-kadheriinin, E-kadheriinin, SNAIL ja GAPDH ostettiin Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Fosfo-Erk1 /2, fosfo-Akt, ja fosfori-p38MAPK ostettiin Abcam (Cambridge, UK), ja koko Erk1 /2, Akt, ja p38MAPK olivat BD Biosciences (USA). Vasta-aine NRP1 ostettiin R &D Systems (Minneapolis, MN, USA), ja HRP (piparjuuren peroksidaasi) konjugoidulla vuohen anti-hiiri-IgG ja HRP-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG hankittiin Santa Cruz Biotechnology.

immunoblottauksella

Yhteensä proteiini uutettiin transfektoiduista soluista käyttäen RIPA lyysipuskuria (Beyotime, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kun koko-solu-proteiini-uutteet kvantitoitiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä, vastaavat määrät solulysaateista erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridiin kalvo, joka sen jälkeen estetty 5% rasvatonta maitoa TBST 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Blotteja inkuboitiin sitten primaarisilla vasta-aineilla. Inkuboinnin jälkeen HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineilla, proteiinin vyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- reagenssia (Millipore, Billerica, MA, USA). Seuraavia vasta-aineen laimennoksia käytettiin: anti-fibronektiini, 1:200; anti-vimentiinista, anti-E-kadheriinin ja anti-N-kadheriinin, 1:1200; anti-SNAIL ja anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfo-Erk1 /2, anti-fosfo-Akt, ja anti-fosfo-p38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-kokonais-Erk1 /2, anti-Akt, ja anti-p38MAPK, 1:500; ja HRP-konjugoitua IgG, 1:7000.

vierassiirrekokeissa

Male kateenkorvattomia nude-hiirten 6-8 viikkoa ikäisiä saatiin Animal Experimental Center of Chongqing Medical University ja totutettu 2 viikkoja. Tutkimus tehtiin tiukka mukaisesti suositusten Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals Chongqing Medical University. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Chongqing Medical University. Kaikki leikkauksia tehtiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Yhtä suuret määrät AGS soluja (10 ^{6), jossa pakotettu ilmentyminen miR-338 tai jatk-miR kanssa tai ilman NRP1 palauttaminen, suspensoitiin 100 ui PBS: ää ja injektoitiin subkutaanisesti oikeaan taka kylki kunkin hiiren (10 hiirtä per ryhmä) .Tumor kasvua seurattiin päivittäin kussakin ryhmässä. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa V = 1/2 x b2, jossa a on pisin kasvain akselin, ja b on lyhin kasvain akselilla. Hiiret lopetettiin 5 viikkoa myöhemmin, ja kasvaimet jaettiin kahteen osaan. Yksi osa kiinnitettiin formaliinilla myöhempää immunohistokemiallista analyysiä, ja toinen osa oli säilynyt liquidnitrogen läntisen tai taudille qRT-PCR.}

immunohistokemia

Kasvaimet säilötty formaliiniin pantiin parafiinilohkoihin ja leikattu päälle positiivisesti varautuneita mikroskoopin. Leikkeet poistettiin parafiini ksyleenillä, sammutettua porrastettu alkoholia ja esikäsitellään antigeenin hakuja sitraattipuskurissa 20 minuutin ajan 98 ° C höyrystimen (CD34 ja NRP1). Leikkeitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) ja NRP1 (1:100 R &D Systems). Immunovärjäys suoritettiin käyttäen ultraherkät S-P Detection Kit (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, Kiina), ja väri kehitettiin käyttämällä DAB Kit (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, Kiina) .Subsequently, leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Sitten lasit värjättiin H &E arvioida morfologia.

kvantifiointi immunohistokemiallinen Stain Intensity

määrittämiseksi kasvain mikroverisuonitiheys, viisi satunnaisesti valittua brightfield mikroskooppikuvia (suurennus 40 x; alueella 0,89 mm ^{2) näytettä kohti saatiin kuten edellä on kuvattu, ja jotka värjäytyivät positiivisesti pienten verisuonten laskettiin käyttäen ImageJ ohjelmaa. Punainen kanava, joka vastaa CD34 värjäystä, eristettiin ja digitoidaan osaksi binary kuvan, mustat osoittaa petsattu alusten ja valkoinen osoittaa mitään värjäytymistä. Aluksissa, joissa lumenia oli digitaalisesti täynnä, ja komposiitti D-MVA kvantitoitiin. Käyttäen ImageJ ohjelma, ruskean värinen kuvia spesifinen DAB värjäystä uutetaan väri dekonvoluutiolla makro. Kaikki intensiteetti arvot samassa ryhmässä otettiin keskiarvo laskea suhteet eri ryhmien välillä.}

Tilastollinen analyysi

SPSS 17.0 ohjelmistoa käytettiin tilastolliseen analyysiin. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (S.D.). Ryhmä vertailut suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä. Erot katsottiin merkitsevä p < 0,05.

Tulokset

MIR Selection

sisällytetään myös myöhempää analyysia, proteiini tavoitteet NRP1 jouduttiin yhtäpitävästi ennustaa ainakin kolme seuraavista neljästä ennustelaitteet: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) ja miRDB (mirdb.org/miRDB/). Perustuen tammikuu 2012 julkaisu versio, huomasimme 11 MikroRNA että potentiaalisesti kohdistettu NRP1. Olimme aiemmin tunnistettu useita miRNA poikkeuksellisen ilmaistaan ​​mahakarsinoo- käyttäen geenisiruun [19] (taulukko 1). Perustuen edellä kaksi, me ennustaa ylävirran miRNA of NRP1: miR-338.

miR-338 säätyy alas mahasyövän sissa ja solulinjoissa

Tutkiakseen roolit miR -338 ihmisen mahasyövän kehitys, mittasimme sen ilmentymistasoissa 41 ihmisen mahasyövän näytteitä ja 24 viereisten normaali limakalvo näytteitä. Erään qRT-PCR-analyysi, taso miR-338 ilmentyminen väheni merkittävästi kasvainkudoksessa verrattuna viereisen normaalin limakalvon kudoksissa (Fig. 1A). Lisäksi, miR-338-ekspressio väheni mahasyövän solulinjoissa (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 ja N87) verrattuna normaaliin mahalaukun limakalvon solulinja (GES1) (kuvio 1B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-338 säätyy alas mahalaukun syöpäsoluja, päätelmä saattaa olla merkitystä ihmisen mahalaukun syövän kehittymisessä.

miR-338 Suoraan tavoitteet onkogeeninen NRP1

NRP1 on ollut raportoitu olevan tärkeä molekyyli, joka ajaa mahasyövässä muuttoliikettä ja invaasiota. Käyttämällä ennakointivälineet, ennustimme, että tavoite miRNA on NRP1 oli miR-338. Edelleen vahvistaa, että miR-338 suoraan suunnattu onkogeenin NRP1 teimme lusiferaasireportterista määrityksiä tutkia miR-338 vaikuttaa suoraan sen tavoitteen onkogeenisia NRP1. Havaitsimme kaksi potentiaalista sitoutumiskohtia miR-338 on 3'UTR NRP1 mRNA. Sen määrittämiseksi, onko NRP1 säätelee miR-338 suoraan sitoutumalla 3'UTR NRP1, rakensimme sarjan 3'UTR fragmenttien, mukaan lukien täyspitkä villityypin NRP1 3'UTR, sitoutumiskohdan 1-mutantti ja sitoutumiskohdan 2 mutantti (Fig. 2A). Nämä fragmentit insertoitiin sitten psiCHECK2 lusiferaasireportteriplasmidi. Huomasimme, että kotransfektoimalla miR-338 ja villityypin NRP1 3'UTR aiheutti merkittävän laskun lusiferaasiyksiköt kontrolleihin verrattuna. Kuitenkin kotransfektoimalla miR-338 ja mutantti NRP13'UTR ei aiheuttanut vähenemistä lusiferaasiyksiköt (Fig. 2B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-338 tavoitteet NRP1 suoraan.

miR-338 Estää mahasyövän Cell Migration, invaasio ja lisääntyminen ja Edistää Apoptoosi NRP1

tarkastella toiminnallista merkitystä miR-338 yliekspressio mahasyövän, me tartunnan mahasyövän solulinjoissa AGS ja MKN45 LV-HSA-mir-338. Verrattuna ilmentymisen jatkuu-miR, miR-338 oli merkittävästi yli-ilmennetään AGS ja MKN45 solulinjoja infektion jälkeen LV-HSA-mir-338 (kuvio 3A). Olemme myös havainneet, että verrattuna jatk-miR, ilmaus NRP1 oli merkittävästi säädellä vähentävästi AGS ja MKN45 solulinjoissa infektion jälkeen LV-HSA-mir-338 (kuvio 3B). Solut pakotettiin ilmaus miR-338 osoitti merkittävästi vähentynyt proliferaatio verrattuna soluihin, joissa on pakotettu ilmentyminen jatkuu-miR (kuvio 3C). MIR-338-tartunnan saaneiden solujen oli myös vähentänyt pesäkkeiden muodostumisen taito: määrä pesäkkeitä MIR-338-ilmentävien solujen aleni verrattiin jatk-miR infektoimissa soluissa (kuvio 3D). Transvvell- muuttoliike ja matrigeelin invaasio analyysit osoittivat, että miR-338 vähensi muuttoliikettä ja hyökkäys valmiuksia AGS ja MKN45 soluja (kuvio 3E). Fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) analyysi osoitti, että pakko ilmentyminen miR-338 johtaa mahalaukun syövän solujen apoptoosin. Prosenttiosuus koko apoptoottisten solujen (varhainen apoptoottiset + myöhään apoptoottinen) kasvoi merkittävästi 11% vastauksena miR-338 yliekspressio verrattuna jatk-miR yliekspressio AGS soluissa. 10% lisäys apoptoottisten solujen määrässä havaittiin MKN45 solujen miR-338 yliekspression verrattuna jatkuu-miR (kuvio 3F). miR-338 voi säätelemään NRP1 suoraan estämällä NRP1 transkriptin tai muita välillisiä piirejä, joten seuraavaksi tutkittava vähentäminen NRP1 ilmaisun voisi selittää inhibitio mahasyövän Solujen migraation, invaasion ja proliferaatiota havaittu, kun pakko ilmaus asennuspalveli- 338. Siksi pakko ilmentymistä miR-338 AGS soluissa yhdessä konstruktilla, joka sisältää NRP1 koodaussekvenssin kuitenkaan ole 3'UTR NRP1 mRNA. Tämän seurauksena tämä rakenne tuotti NRP1 mRNA, joka oli resistentti miR-338. Huomasimme, että mahasyövän solumigraation, invaasio, proliferaatio ja apoptoosi palautettiin AGS solulinja pakko miR-338 ilmaisun ja NRP1 palauttaminen (kuva 3G-3J). Nämä tulokset osoittavat, että miR-338 estää mahalaukun syövän solujen vaeltamiseen, invaasiota ja lisääntymistä ja edistää apoptoosia kohdistamalla NRP1.

vaikutus miR-338 on signaalireaktioteissä AGS Solut

Koska ei- tyrosiini-kinaasi-reseptorin, NRP1 voi kohtuullisesti lisätä ilmentymistä fosforylaation Erk1 /2, Akt, ja p38MAPK edistää kasvainsolujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden, sekä hillitä apoptoosin ja immuunivastetta. Koska NRP1 on alavirran kohde miR-338, on oletettu, että miR-338 saattaa vähentää ilmentymistä fosforylaation Erk1 /2, Akt, ja p38MAPK. Olemme havainneet, että pakko ilmentyminen miR-338 inhiboi fosforylaatiota Erk1 /2, mutta suhteellinen ilmentymistaso koko Erk1 /2 ei ole muuttunut merkittävästi. miR-338 voi myös vähentää fosforylaation P38 MAPK ja Akt (kuvio 4A). miR-338 voisi sitoa 3'UTR NRP1 mRNA säännellä fosforylaation ERK1 /2, Akt ja p38MAPK; Emme kuitenkaan tiedä, onko miR-338 voisi sitoa 3'UTRs muiden geenien aikaansaamiseksi samanlaiset. Joten pelastus koe suoritettiin, ja palauttaminen NRP1 ilmaisun vahvistettiin kautta immunoblot-analyysillä (kuvio 4B). Huomasimme, että fosforylaatiota tasot Erk1 /2, Akt ja p38MAPK eivät muuttuneet merkittävästi vuonna AGS solujen pakko miR-338 ilmaisun ja NRP1 palauttaminen (kuvio 4C). Tämän vuoksi päättelemme, että miR-338 säätelee fosforylaatio ERK1 /2, P38 MAPK ja Akt kautta NRP1.

miR-338 Määrittää epiteelikasvaimet Fenotyyppikuvaus mahasyövän

EMT on tärkeä mekanismi syöpään liittyvä invasiivisuus ja etäpesäkkeiden. Ilmiö EMT määritellään siirtymistä epiteelisolujen fibroblastoid- tai mesenkymaalisten kaltaisia ​​soluja. EMT on ominaista menetys epiteelin markkerit ja hankinta mesenkymaalisten komponentteja. E-kadheriinin, occludin ja sytokeratiinin ovat vaimentua aikana EMT, kun taas N-kadheriinin, vimentiinistä, fibronektiiniin ja SNAIL ovat voimistunut. NRP1 parantaa signaloinnin kautta kolme suurta polkuja, jotka on yhdistetty EMT eli TGF-β, Hh ja HGF /cMET. Löytää roolin NRP1 ylläpitämisessä mesenkymaaliset fenotyyppi mahalaukun solujen, me pudotti ilmaus NRP1 RNA interferenssi (RNAi) (Kuva. 5A) ja tutki ilmaus mesenkymaalisten markkereita, kuten fibronektiinin, vimentiinistä, N-kadheriinin ja SNAIL, sekä epiteelin merkki E-kadheriinin, in AGS soluissa. Olemme havainneet, että ekspressiotasot fibronektiinin, vimentiinin, N-kadheriinin ja SNAIL laskivat, mutta ilmentyminen E-kadheriinin on lisääntynyt NRP1-köyhdytettyä kasvainsoluja (kuvio. 5B). Tulos osoittaa, että NRP1 voi ajaa EMT menetelmä mahasyövän. Koska NRP1 on alavirran kohde miR-338, on oletettu, että miR-338 voi määrittää epiteelin fenotyyppi mahasyövän. Sen määrittämiseksi, onko molekyyli muuttuu tyypillistä alennetun EMT tapahtui miR-338-ilmentäviä soluja, tutkimme ilmaus mesenkymaalisten ja epiteelin merkkiaineiden AGS soluissa. Immunoblot-analyysi osoitti, että ekspressiotasot fibronektiinin, vimentiinin, N-kadheriinin ja SNAIL määrä väheni AGS solujen pakotettu ilmentyminen miR-338. Lisäksi pakko ilmentyminen miR-338 lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin, että AGS solulinja, kun taas kontrolli-infektoituja soluja jäi E-kadheriinin negatiivinen. Huomasimme, että miR-338 säännelty fosforylaation ERK1 /2, P38 MAPK ja Akt kautta NRP1; Siksi oli tarpeen tietää, onko miR-338 voi säädellä EMT kautta NRP1. Immunoblot-analyysi osoitti, että ekspressio edellä mesenkymaalisten merkkiaineiden miR-338-ilmentävien solujen palautui normaalille tasolle, että palauttaminen NRP1 ilmentymisen (Fig. 5C). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että miR-338 voi estää EMT kautta NRP1 mahalaukun syöpäsoluja.

miR-338 Vähennykset tuumorikasvun ja vaimentaa D-MVA by kohdistaminen NRP1 In Vivo

Perustuen havaittuun pienenee muuttavien, invasiivisia ja proliferatiivinen käyttäytymistä AGS ja MKN45 infektoimia soluja LV-HSA-mir-338, tutkimme seuraavaksi roolia miR-338 in kasvua in vivo. Me ihon alle ympätty paljaisiin hiiriin yhtä paljon (1 x 10 ^{6 solua hiirtä kohti) AGS solujen pakotettu ilmentyminen miR-338 tai jatk-miR kanssa tai ilman NRP1 ennalleen. Kasvaimen esiintymistiheys arvioitiin joka toinen viikko, ja kasvaimia esiintyi kaikissa hiirissä. miR-338 ilmentymisen nude-hiiret, kasvaimet mitattiin käyttäen qRT-PCR: ää, ja olemme havainneet, että miR-338 ilmentyminen kasvoi merkittävästi kasvaimia, että yli-ilmentynyt miR-338 (kuvio 6A). Pakko ilmentyminen miR-338 inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua in vivo, mutta yliekspressio NRP1 voisi palauttaa kasvaimen kasvua (kuvio 6B). Seuraavaksi tutkimme NRP1 ilmaisun nude hiiren kasvainten Western blot ja immunohistokemia. Huomasimme, että NRP1 ilmaisu merkittävästi vähentynyt kasvaimia, jotka yli-ilmentynyt miR-338; kuitenkin, NRP1 ilmentyminen palautettiin kasvaimia, jotka yli-ilmentynyt NRP1 (kuvio 6C, 4D). Niinpä päätellä, että miR-338 inhiboi kasvaimen kasvua hillitsemällä NRP1 ilmentymistä in vivo. NRP1 voi parantaa tumorangiogenesis; Siksi me arveltu, että pakko ilmentymistä miR-338 estäisivät tumorangiogenesis kautta NPR1. Immunohistokemiallinen värjäys CD34 käytettiin arvioimaan määrän ja morfologisia ominaisuuksia verisuonten kussakin kasvain. Alukset laskettiin laskemalla rakenteiden diskreetti värjäystä kullakin alalla ottamatta huomioon aluksen koon tai avautumisessa. Alukset on kasvaimia, jotka yli-ilmentynyt miR-338 olivat subjektiivisesti vähemmän kuin jatk-miR yliekspressoivia kasvaimet; kuitenkin, määrää alusten palautettiin kasvaimia, jotka yli-ilmentynyt NRP1 (kuvio 6E). Digitoitu mikrovaskulaarinen alue (D-MVA) analysoitiin sisällyttää aluksen koon ja avautumisessa meidän analyysi kasvaimen verisuoniston tarjoamalla arvio integroitujen luumenalue ja oletettavasti verenkiertoa kohtisuorassa kasvain osassa. D-MVA pelkistettiin miR-338 yliekspressoitu kasvaimia. Yllätykseksemme huomasimme, että NRP1-yli-ilmentynyt kasvaimia eivät merkittävästi näytä lisääntynyt angiogeneesiä, mutta väheneminen D-MVA johtuen miR-338 yliekspressio palautettiin kasvaimia, jotka yli-ilmentynyt NRP1 (kuvio 6F ja 6G). Spekuloida, että NRP1 ekspressio jo ylössäädellään mahasyövän, niin edelleen yli-ilmentynyt NRP1 voi merkittävästi lisätä kasvaimen verisuonistossa, mutta voi palauttaa kasvaimen verisuonisto, joka on vähennetty miR-338. Nämä tulokset osoittivat, että miR-338 vähentää kasvaimen kasvua ja estää D-MVA kohdistamalla NRP1 in vivo.}

Keskustelu

Käyttämällä geenilastut ja bioinformatiikan, me ennustaa, että tavoite miRNA on NRP1 oli miR -338. Tutkimus on osoittanut, että ilmentyminen miR-338 vaihtelee eri kasvaimissa. Huang XH et ai. osoittivat, että miR-338-3p tukahdutetaan maksan syöpäsoluinvaasiota kohdistamalla tasoittaa [20]. Lisäksi ihosyövän, miR-193a, miR-338, ja miR-565 osoitettiin olevan ali-ilmentynyt potilailla, joilla on BRAF-mutaatio [21]. Näiden tietojen, me päätellä, että miR-338 voi toimia kasvaimia estävä. Ei ole julkaisuihin siitä, onko miR-338 on ali-ilmentynyt mahasyövän. Tutkimuksessamme ilmentymistasojen miR-338 oli ensimmäinen mitattiin 41 ihmisen mahasyövän näytteet ja 24 näytettä vierekkäisten normaalin limakalvon kudoksissa. Sitten arvioitiin ilmaus miR-338 viidessä mahasyövässä solulinjoissa ja normaalissa mahan limakalvoa solulinjat. Olemme havainneet, että ilmentyminen miR-338 on alassäädetty sekä kasvaimen kudokset ja syöpäsolulinjoissa. Lisäksi yli-ilmennetty miR-338 voi estää mahalaukun syövän solujen vaeltaminen, invaasio ja leviämisen, ja edistää apoptoosia. Samaan aikaan nämä kasvaimia ominaisuuksia voidaan täysin palauttaa NRP1 yli-ilmentymisen. Lisäksi, lusiferaasireportteri määrityksissä viittasi siihen, että miR-338 tavoitteet NRP1 suoraan. Näin ollen teemme sen johtopäätöksen, että miR-338 toimii mahdollisena tuumorisuppressori mahasyövän, joka on toiminto, joka suoritetaan hillitsemällä ilmentymistä NRP1.

Ei-tyrosiini-kinaasi-reseptorin, NRP1 voi kohtuullisesti lisätä ilmaus fosforylaation Erk1 /2, Akt, ja p38MAPK. M Akagi et al. todettiin, että inhibitio NRP-1 vähensi ilmaus fosforylaation Erk1 /2, Akt, ja p38MAPK [22]. Lisäksi tutkimus on osoittanut, että ilmaisu ERK1 /2 fosforylaatio säädellään ylöspäin NRP-1-yli-ilmentävät solut [23]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että yli-ilmentynyt miR-338 saattaa vähentää ilmentymä fosforylaation Erk1 /2, Akt, ja p38MAPK, vaikutus, joka oli päinvastainen kun NRP1 palauttaminen. Aktivointi ERK, Akt ja p38MAPK yhdessä apoptoosiresistenssiin /solu eloonjääminen on hyvin dokumentoitu erilaisissa mallin järjestelmien [24], [25], [26].

• PLoS ONE: suhde P53 tila ja vastaus Kemoterapia potilailla, joilla on mahasyövän: Meta-Analysis
• PLoS ONE: n ilmentyminen EGR Family mahasyövän: alassäätely HER4 ja sen aktivoivat Ligandi NRG4