PLOS ONE: microARN-338 inhibe la croissance, invasion et la métastase du cancer gastrique par ciblage NRP1 Expression

Résumé

NRP1 comme des récepteurs non-tyrosine-kinase multifonctionnels jouent un rôle crucial dans la progression tumorale. Les microARN (miARN) sont une classe importante de gènes envahissants qui sont impliqués dans une variété de fonctions biologiques, en particulier le cancer. On ignore si miARN peuvent réguler l'expression de NRP1. Le but de cette étude était d'identifier les miARN qui pourraient inhiber la croissance, l'invasion et les métastases du cancer gastrique en ciblant l'expression NRP1. Nous avons trouvé que l'expression de miR-338 a été réduite dans les lignées cellulaires de cancer gastrique et dans les tissus de cancer gastrique. De plus, nous avons constaté que miR-338 a inhibé la migration des cellules de cancer de l'estomac, l'invasion, la prolifération et la promotion de l'apoptose en ciblant l'expression NRP1. En tant que régulateur en amont de NRP1, miR-338 vise directement NRP1. L'expression forcée de miR-338 a inhibé la phosphorylation de ERK1 /2, P38 MAPK et Akt; Cependant, l'expression de ERK1 phosphorylée /2, Akt et p38 a été restaurée par la surexpression de NRP1. Dans les cellules AGS infectées par miR-338 ou transfectées avec SiNRP1, les niveaux de la fibronectine, la vimentine, la N-cadhérine et la protéine MOLLUSQUES ont diminué, mais l'expression de la E-cadhérine a été augmentée. L'expression de marqueurs de cellules mésenchymateuses dans miR-338 exprimant a été rétablie à un niveau normal par la restauration de l'expression NRP1. In vivo
, miR-338 a également diminué la croissance tumorale et supprimée D-MVA en ciblant NRP1. Par conséquent, nous concluons que miR-338 agit comme un gène suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique nouveau. miR-338 peut diminuer les comportements migratoires, envahissantes, prolifératives et apoptotiques, ainsi que EMT de cancer de l'estomac, en atténuant l'expression de NRP1

Citation:. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) microARN-338 inhibe la croissance, invasion et la métastase du cancer gastrique par ciblage NRP1 expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10.1371 /journal.pone.0094422

Editeur: Chih-Hsin Tang, Université médicale de Chine, Taiwan

Reçu le 18 Octobre 2013; Accepté le 16 Mars 2014; Publié: 15 Avril 2014

Droit d'auteur: © 2014 Peng, et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par projet de la commission des sciences et de la technologie dans le district de Shapingba de Chongqing (201302). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

neuropilines, y compris neuropilin1 (NRP1) et neuropilin2 (NRP2), sont des récepteurs multifonctionnels non-tyrosine-kinase qui ont d'abord été identifiés sur la base de leurs rôles essentiels dans le système nerveux en développement [1]. NRP1 et NRP2 ont 44% d'homologie et partagent de nombreuses propriétés structurales et biologiques. NRP1 existe principalement dans bloodvesselendothelia et NRP2 se trouve principalement dans les vaisseaux lymphatiques [2], [3]. Les investigations ultérieures ont identifié NRP-1 en tant que récepteur du facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF) -A isoforme VEGF-165 dans les cellules endotheliales et certaines cellules tumorales [4], [5]. La recherche a montré que NRP1 est régulée à la hausse dans plusieurs types de tumeurs et est exprimée en vasculatures tumorales différentes [3], [6], ce qui suggère que NRP1 joue un rôle crucial dans la progression tumorale. Les premières recherches ont révélé que NRP1 pourrait affecter la croissance des tumeurs en tant que co-récepteur de VEGFR [5]. Les scientifiques ont découvert plus tard que NRP1 pourrait stimuler tumorangiogenesis, accélérer la croissance de la tumeur et l'apoptose bordure de tumeur sans VEGFR [7]. NRP1 peut être un corécepteur d'autres facteurs de croissance, ce qui met en lumière la raison pour laquelle le VEGF peut signaler à travers neuropilines en l'absence de VEGFR-1 ou de VEGFR-2 [8], [9]. En tant que corécepteur de TβRI /TβRII, NRP1 peut freiner l'apoptose tumorale et d'accélérer la croissance de la tumeur via la signalisation tant canonique et non canonique [10]. NRP1, comme un corécepteur du PDGFR /ÉÉGC, peut stimuler tumorangiogenesis via P38MAPK et la signalisation ERK [11].

Comme gènes de régulation en amont de NRP1, les facteurs de transcription sp1 /3 et AP1 peut réguler l'expression de NRP1 [ ,,,0],12]. Certaines recherches ont montré que le butyrate supprime l'expression de la neuropiline I dans des lignées cellulaires colorectales par l'inhibition de la transactivation Sp1 [13].

Les microARN (miARN) sont non-codant des molécules d'ARN d'environ 21 à 23 nucléotides de longueur qui réguler l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel [14], [15], [16]. expression de miRNA profilage analyses ont révélé une régulation globale des niveaux d'âge mûr miRNA dans les tumeurs humaines primaires rapport aux tissus normaux [17], [18]. Ainsi, les miRNAs peut fonctionner comme suppresseurs de tumeur ou oncogènes et l'expression de miARN dérégulée pourrait contribuer à la métastase des cellules tumorales. On ignore si miARN peuvent réguler l'expression de NRP1; par conséquent, nous avons cherché à déterminer les miARN cibles de NRP1. Des fonctions supplémentaires de NRP1 peuvent être découverts en étudiant les miARN cibles de NRP1.

Matériel et méthodes

Spécimens Tissue humain et des lignées cellulaires

Cette étude des tissus frais utilisés, y compris les 41 échantillons de cancer gastrique humains et 24 échantillons de tissus muqueux normaux adjacents provenant de 41 patients ayant subi une chirurgie au second hôpital affilié de l'Université médicale de Chongqing entre 2012 et 2013. Cette étude a été réalisée en fonction de la «recherche biomédicale impliquant l'évaluation éthique humaine (provisoire) «réglementation du ministère de la Santé et de la Déclaration d'Helsinki sur les principes éthiques applicables aux recherches médicales sur des sujets humains. Tous les échantillons ont été obtenus avec le consentement éclairé des patients et les expériences ont été approuvées par le conseil d'administration du deuxième hôpital affilié de l'Université médicale de Chongqing Institutional Review. Tous les participants ont donné par écrit son consentement à participer à cette étude informés

Le SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 et de la N87 lignées cellulaires ont été obtenues à partir de l'American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , Etats-Unis), et la lignée cellulaire GES-1 a été acheté dans le type Culture Collection de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Les lignées cellulaires ont été cultivées dans RPMI 1640 (Hyclone, Logan, Utah, USA) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et ont été incubées à 37 ° C avec 5% de CO2.

Amorces, Isolement de l'ARN et ARNmi de détection

les amorces pour miR-338-3p et U6 ont été produites en utilisant le kit miScript Primer Assay (Qiagen Dusseldorf Allemagne). Les séquences des miARN utilisées dans cette étude sont les suivants: miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG et U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Les amorces inverses ont également été utilisés dans l'étape de transcription inverse. Total des miARN a été extrait des cellules en culture et des échantillons de tissus humains en utilisant RNAiso pour les petits ARN (Takara Bio, Otsu) selon les instructions du fabricant. la queue poly-A ont été ajoutés à miR-338 et U6 avec la réaction miARN tampon Mix (Takara Bio), puis l'ADNc a été synthétisé à partir de 5 ng d'ARN total en utilisant le miARN PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara Bio). PCR en temps réel a été réalisée dans un système de détection par PCR en temps réel CFX96 (Bio-Rad) avec SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio). Les conditions de PCR étaient 95 ° C pendant 30 s, suivie par 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 30 s. Les données ont été normalisées contre le U6 snRNA. Après amplification, une analyse de courbe de fusion a été réalisée pour confirmer la spécificité des produits.

pcDNA Plasmides d'expression et le plasmide Transfection

La séquence de l'ORF a été amplifié NRP1 à partir d'ADN génomique isolé à partir de la cellule AGS ligne, et la région de l'ORF NRP1 ADNc a ensuite été sous-cloné dans le vecteur d'GV230 (GeneChem Corporation, Shanghai, Chine) .Le plasmide a été transfecté dans AGS et des cellules MKN45 utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-quatre heures après la transfection, le les cellules ont été utilisées pour une expérience de sauvetage. les cellules AGS qui ont été transfectées de manière stable avec NRP1 ont été sélectionnés en utilisant 2 ug /uL puromycine (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) 48 h après la transfection.

miRNA Gene Clonage et expression ectopique

Le gène miR-338 humaine a été amplifié par PCR à partir d'ADN génomique normal et clone dans un vecteur lentiviral. Les lentivirus ont été générés par la co-transfection de cellules HEK293T avec des plasmides PGC-BT, pHelper 1.0 et 2.0 pHelper utilisant de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Les virus ont été récoltées 48 h après la transfection, et les infections ont été réalisées en présence de 2 mg /ml de polybrène (GeneChem Corporation). Contrôle miRNA viruse a été acheté chez GeneChem Corporation (Shanghai, Chine). les cellules AGS qui ont été stablement infectées par miR-338 ont été sélectionnées en utilisant 2 ug /uL puromycine (Invitrogen) 48 h après l'infection.

Gene Expression Knockdown par l'ARN-interférence

NRP1 expression par AGS les cellules ont été réduits au silence par transfection des séquences suivantes de siARN ciblées (Sangon Biotech, Shanghai, Chine) avec Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (où non spécifié, siRNA n ° 3 a été utilisé). Contrôle siRNA (SiC) ont été générés par l'introduction de 4 substitutions de base dans NRP1 séquence de ciblage (GATAGGTCATGACTGCCC). Quarante-huit heures après la transfection, expression NRP1 a été examiné par immunoblotting.

Luciferase Reporter Assay

Un vecteur d'expression cible PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA a été utilisé pour des essais 3'UTR de luciférase (Sangon Biotech, Shanghai, Chine). L'oncogène cible de miARN-338 a été sélectionné sur la base de la base de données http://www.microrna.org/microrna/home.do cible de microARN en ligne. Les séquences d'amorces pour le 3'UTR de type sauvage ont été les suivantes: avant: 5'CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 'et inverse 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3'. Parce qu'il ya deux sites de liaison dans le NRP1 3'UTR, nous avons conçu deux séquences d'amorces pour le 3'UTR mutant. Pour un mutant 3'UTR, les séquences d'amorces sont les suivantes: l'avant: 5'GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'et inverse: 5'GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. Pour l'autre 3'UTR mutant, les séquences d'amorces sont les suivantes: à l'avant: 5'GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'et inverse: 5'GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. Pour le dosage de la luciférase, de la lipofectamine 2000 a été utilisé pour co-transfecter des cellules MKN45 avec le hsa-miR-338 et des vecteurs d'expression cible double-Luciferase miARN PsicheckTM-2 contenant de type sauvage ou les séquences cibles mutantes. L'activité de la luciférase de luciole a été mesurée en utilisant le double dosage de luciférase (Promega, Madison, WI, USA) 18 h après la transfection, et les résultats ont été normalisés contre Renilla luciférase. Chaque plasmide rapporteur a été transfecté au moins trois fois (sur plusieurs jours), et chaque échantillon a été testé en triple.

Viabilité cellulaire et dosages
clonabilité

Les cellules transfectées ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 x 10 ^{4 cellules /puits. Une solution de MTT (20 ul de 5 mg /ml de MTT) a été ajouté aux cultures (pour un volume total de 200 ul) et on incube pendant 4 chapeau 37 ° C. Suite à l'élimination du milieu de culture, les cristaux restants ont été dissous dans du DMSO et l'absorbance à 570 nm a été mesurée. Pour le dosage de formation de colonies, les cellules ont été ensemencées à faible densité (1000 cellules /plaque) et on les laisse croître jusqu'à ce que des colonies visibles sont apparues. Les cellules ont ensuite été colorées au Giemsa, et les colonies ont été comptées.}

Migration et dosages
Invasion

Pour les essais de migration Transwell, 10 × 10 ^{4 cellules ont été étalées dans la chambre supérieure avec une membrane non revêtue (insert 24 puits; 8 mm taille des pores; BD Biosciences). Pour les essais d'invasion, 2 × 10 5 cellules ont été étalées dans la chambre supérieure avec une membrane Matrigel revêtu (insert 24 puits, la taille des pores de 8 mm; BD Biosciences). Pour les deux essais, les cellules ont été étalées dans un milieu exempt de sérum et un milieu additionné de 10% de sérum a été utilisé comme agent chimio-attractif dans la chambre inférieure. Les cellules ont été incubées pendant 16 h à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur de culture tissulaire. Au bout de 16 h, les cellules non migrées /non-envahissant ont été retirées des faces supérieures des éléments filtrants à membrane Transwell en utilisant des tampons de coton-tige. Les cellules /envahies migrés sur les côtés inférieurs des plaquettes ont été colorées avec du Giemsa et les cellules ont été comptées.}

Anticorps

Des anticorps contre la fibronectine, la vimentine, la N-cadhérine, la E-cadhérine, ESCARGOT et GAPDH ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Phospho-ERK1 /2, phospho-Akt, et phospho-P38MAPK ont été achetés chez Abcam (Cambridge, Royaume-Uni), et le total ERK1 /2, Akt et P38MAPK étaient de BD Biosciences (USA). Un anticorps contre NRP1 a été acheté chez R &D Systems (Minneapolis, MN, USA), et HRP (peroxydase de raifort) conjugué à de chèvre anti-IgG de souris et de chèvre anti-lapin conjugué à HRP IgG ont été achetés chez Santa Cruz Biotechnology

immunotransfert

la protéine totale a été extraite à partir des cellules transfectées à l'aide de tampon de lyse RIPA (Beyotime, Chine) selon les instructions du fabricant. Après que les extraits protéiques de cellules entières ont été quantifiés en utilisant le dosage des protéines BCA, des quantités équivalentes de lysats cellulaires ont été résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS à 10% et ont été transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène, qui a été ensuite bloqué dans du lait à 5% dégraissé en TBST pendant 1 heure à 4 ° C. Les blots ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires. Après incubation avec des anticorps secondaires HRP conjugués, les bandes de protéines ont été visualisées en utilisant un réactif de chimioluminescence amélioré (Millipore, Billerica, MA, USA). Les dilutions d'anticorps suivants ont été utilisés: anti-fibronectine, 1:200; l'anti-vimentine, anti-E-cadhérine et anti-N-cadhérine, 1:1200; anti-ESCARGOT et anti-GAPDH, 1:500; l'anti-phospho-ERK1 /2, anti-phospho-Akt et anti-phospho-P38MAPK, 1:2000; anti NRP1, 1:600; anti totale ERK1 /2, anti-Akt et anti-P38MAPK, 1:500; et HRP-conjugué IgG, 1:7000.

Les expériences de xénogreffe

souris nude athymiques Homme 6 à 8 semaines d'âge ont été obtenues à partir du Centre Expérimental des animaux de l'Université médicale de Chongqing et ont été acclimatés pendant 2 semaines. Cette étude a été menée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Université médicale de Chongqing. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l'éthique de l'expérimentation animale de l'Université médicale de Chongqing. Toutes les opérations ont été effectuées sous anesthésie au pentobarbital sodique, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Un nombre égal de cellules AGS (10 ^{6) avec l'expression forcée de miR-338 ou cont-miR, avec ou sans restauration NRP1, ont été mis en suspension dans 100 ul de PBS et injection sous-cutanée dans le flanc arrière droit de chaque souris (10 souris par groupe) .Tumor croissance a été surveillée quotidiennement dans chaque groupe. Le volume tumoral a été calculé selon la formule V = 1/2 x b2, où a est l'axe le plus long de la tumeur, et b est l'axe le plus court de la tumeur. Les souris ont été sacrifiées 5 jours plus tard et les tumeurs ont été divisés en deux parties. Une partie a été fixé dans le formol pour l'analyse immunohistochimique subséquente, et l'autre partie a été conservée dans western blot pour azote liquide ou qRT-PCR.}

immunohistochimie

Tumeurs conservés dans le formol ont été placés dans des blocs de paraffine et sectionnée sur des lames de microscope chargées positivement. Les coupes ont été déparaffinées dans du xylene, hydraté dans l'alcool gradué et prétraitées pour la récupération de l'antigène dans un tampon citrate pendant 20 min à 98 ° C un vaporisateur (CD34 et NRP1). Les sections ont été incubées à 4 ° C pendant une nuit avec le CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) et NRP1 (1:100 R & D Systems). Immunocoloration a été réalisée en utilisant le kit ultrasensible S-P Detection (KIT-9720, Maixin, Fuzhou, Chine), et la couleur a été développé en utilisant un kit DAB (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, Chine) .Subsequently, les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline. Les lames ont ensuite été colorées avec H &. E pour évaluer la morphologie

Quantification de immunohistochimique Stain Intensité

Pour déterminer la densité des microvaisseaux de la tumeur, cinq images sélectionnées au hasard en fond clair microscopique (grossissement 40 ×; zone 0,89 mm ^{2) pour chaque échantillon a été obtenu comme décrit ci-dessus, ainsi que les microvaisseaux colorées positivement ont été comptées en utilisant le programme ImageJ. Le canal rouge, correspondant à CD34 coloration, a été isolé et numérisé en une image binaire, avec indication noire des navires colorés et blanc indiquant l'absence de coloration. Les navires avec lumens ont été numériquement remplis, et un composite D-MVA a été quantifiée. Utilisation du programme ImageJ, images de couleur brune spécifiques pour la DAB coloration ont été extraites par une macro couleur de déconvolution. Toutes les valeurs d'intensité au sein du même groupe ont été moyennées pour calculer les ratios entre les différents groupes.}

logiciel d'analyse statistique

SPSS 17.0 a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données sont présentées comme le moyen ± écart-type (e.t.). comparaisons de groupe ont été effectuées en utilisant le test t de Student. Les différences ont été considérées comme significatives à la p <. 0.05

Résultats MIR Sélection

Pour être inclus dans notre analyse ultérieure, les cibles protéiques de NRP1 ont dû être concordante prédite par au moins trois des quatre outils de prédiction suivants: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan index.html) et miRDB (mirdb.org/miRDB/). Basé sur la version Janvier 2012 version, nous avons trouvé 11 microARN que potentiellement NRP1 ciblés. Nous avions déjà identifié plusieurs miARN anormalement exprimés dans le cancer gastrique en utilisant une puce génétique [19] (tableau 1). Sur la base des deux ci-dessus, nous avons prédit un miARN en amont de NRP1: miR-338

miR-338 est régulée à la baisse dans le cancer gastrique Tissues et lignées cellulaires

Pour explorer les rôles de miR. -338 dans le développement du cancer de l'estomac humain, nous avons mesuré les niveaux d'expression dans 41 échantillons de cancer gastrique humains et 24 échantillons normaux adjacents de la muqueuse. Selon une analyse qRT-PCR, le niveau d'expression de miR-338 a été considérablement réduite dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus adjacents normaux de la muqueuse (Fig. 1A). En outre, miR-338 expression a été réduite dans les lignées cellulaires de cancer gastrique (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 et N87) par rapport à la gastrique lignée cellulaire de la muqueuse normale (GES1) (figure 1B). Ces résultats suggèrent que miR-338 est régulée à la baisse dans les cellules de cancer gastrique, une constatation qui pourrait être pertinente pour le développement du cancer de l'estomac humain.

miR-338 vise directement

NRP1 de oncogénique NRP1 a été signalé comme étant une molécule importante qui entraîne la migration de cancer de l'estomac et de l'invasion. L'utilisation d'outils de prédiction, nous avons prédit que la cible miARN de NRP1 était miR-338. Pour confirmer en outre que miR-338 vise directement oncogène NRP1, nous avons effectué des dosages de rapporteur luciférase d'examiner si miR-338 interagit directement avec son NRP1 oncogène cible. Nous avons identifié deux sites de liaison potentiels pour miR-338 à la 3'UTR de l'ARNm NRP1. Pour déterminer si NRP1 est réglementé par miR-338 par liaison directe à la 3'UTR de NRP1, nous avons construit une série de fragments 3'UTR, y compris la pleine longueur de type sauvage NRP1 3'UTR, un site de liaison 1 et mutant un site de liaison 2 mutant (Fig. 2A). Ces fragments ont ensuite été insérés dans le plasmide rapporteur luciférase psiCHECK2. Nous avons trouvé que la co-transfection de miR-338 et de type sauvage NRP1 3'UTR a provoqué une diminution significative des unités de luciférase par rapport aux témoins. Cependant, la co-transfection de miR-338 et le mutant NRP13'UTR n'a pas provoqué une diminution des unités de luciférase (Fig. 2B). Ces résultats suggèrent que miR-338 cibles NRP1 directement.

miR-338 inhibe le cancer gastrique migration cellulaire, l'invasion et la prolifération et favorise l'apoptose par NRP1

Pour examiner la signification fonctionnelle de miR-338 surexpression dans le cancer gastrique, nous avons infecté les cellules cancéreuses gastriques lignes AGS et MKN45 avec LV-hsa-mir-338. Par rapport à l'expression de miR-suite, miR-338 était significativement surexprimé dans l'AGS et des lignées de cellules MKN45 après infection par le LV-hsa-miR-338 (figure 3A). Nous avons également constaté que, par rapport cont-miR, l'expression de NRP1 était significativement régulée à la baisse dans les AGS et des lignées cellulaires MKN45 après l'infection par LV-hsa-mir-338 (figure 3B). Les cellules présentant une expression forcée de miR-338 présentait une diminution significative par rapport à la prolifération des cellules présentant une expression forcée de miR-suite (figure 3C). Les cellules miR-338 infectées présentaient également réduit la capacité de formation de colonies: le nombre de foyers dans les cellules miR-338 exprimant a diminué par rapport aux cellules cont-miR-infectées (Figure 3D). La migration Transwell et Matrigel essais d'invasion ont démontré que miR-338 réduit de manière significative les capacités de migration et d'invasion de l'AGS et MKN45 cellules (Figure 3E). La cellule activé par fluorescence (FACS) L'analyse a montré que l'expression forcée de miR-338 conduit à l'apoptose des cellules gastriques du cancer. Le pourcentage de cellules apoptotiques totaux (début apoptotique + fin apoptotique) significativement augmenté de 11% en réponse à miR-338 surexpression par rapport cont-miR surexpression dans les cellules AGS. Une augmentation de 10% du nombre de cellules apoptotiques a été observée dans les cellules MKN45 avec miR-338 surexpression par rapport à cont-miR (Figure 3F). miR-338 pourrait réguler l'expression de NRP1 en inhibant directement NRP1 transcription ou d'autres circuits indirects, de sorte que nous avons ensuite vérifié si la réduction de l'expression NRP1 pourrait expliquer l'inhibition de l'estomac la migration des cellules cancéreuses, l'invasion et la prolifération observée après l'expression forcée de Mir- 338. Nous avons donc forcé l'expression de miR-338 dans les cellules AGS avec une construction contenant la séquence codante NRP1 mais manque le 3'UTR de l'ARNm NRP1. Par conséquent, cette construction a abouti à un ARNm NRP1 qui était résistant à miR-338. Nous avons constaté que la migration des cellules de cancer de l'estomac, l'invasion, la prolifération et l'apoptose ont été restaurés dans la lignée de cellules AGS avec l'expression de miR-338 forcé et NRP1 restauration (Figure 3G-3J). Ces résultats montrent que miR-338 inhibe la migration des cellules de cancer de l'estomac, l'invasion et la prolifération et favorise l'apoptose en ciblant NRP1.

Effet de miR-338 sur les voies de signalisation dans les cellules AGS

En tant que non le récepteur tyrosine kinase, NRP1 peut légèrement augmenter l'expression de la phosphorylation de ERK1 /2, Akt et de promouvoir P38MAPK prolifération des cellules tumorales et des métastases, ainsi que pour lutter contre l'apoptose et les réponses immunitaires. Parce que NRP1 est une cible en aval de miR-338, nous avons supposé que miR-338 pourrait diminuer l'expression de la phosphorylation de ERK1 /2, Akt et P38MAPK. Nous avons constaté que l'expression forcée de miR-338 a inhibé la phosphorylation de ERK1 /2, mais le niveau d'expression relatif du total des ERK1 /2 n'a pas été modifiée de façon significative. miR-338 pourrait également diminuer la phosphorylation de la p38 MAPK et Akt (figure 4A). miR-338 pourrait lier le 3'UTR de l'ARNm NRP1 pour réguler la phosphorylation de ERK1 /2, Akt et P38MAPK; Cependant, nous ne savons pas si miR-338 pourrait lier les 3'UTRs d'autres gènes pour obtenir un effet égal. Donc, l'expérience de sauvetage a été effectuée, et la restauration de l'expression NRP1 a été confirmée par une analyse immunoblot (figure 4B). Nous avons constaté que les niveaux de ERK1 /2 de phosphorylation, Akt et P38MAPK ne sont pas significativement modifiés dans les cellules AGS avec expression miR-338 forcé et NRP1 restauration (figure 4C). Par conséquent, nous concluons que miR-338 régule la phosphorylation de ERK1 /2, P38 MAPK et Akt via NRP1.

miR-338 Détermine la épithélial Phénotype de cancer gastrique

EMT est un mécanisme important associée à l'invasivité du cancer et des métastases. Le phénomène de l'EMT est définie comme étant la transition des cellules épithéliales à fibroblastoid- ou des cellules mésenchymateuses analogue. EMT est caractérisée par la perte des marqueurs épithéliaux et l'acquisition de composants mésenchymateux. E-cadhérine, occludin et cytokératine sont downregulated pendant EMT, alors que la N-cadhérine, la vimentine, la fibronectine et ESCARGOT sont régulés à la hausse. NRP1 améliore la signalisation via trois voies principales qui ont été liés à EMT, à savoir, le TGF-β, Hh et HGF /cMet. Pour trouver le rôle de NRP1 dans le maintien du phénotype mésenchymateuses des cellules gastriques, nous avons frappé vers le bas l'expression de NRP1 par interférence ARN (ARNi) (Fig. 5A) et examiné l'expression des marqueurs de mésenchymateuses telles que la fibronectine, la vimentine, la N-cadhérine et ESCARGOT, ainsi que le marqueur E-cadhérine épithéliale, dans les cellules AGS. Nous avons constaté que les niveaux de la fibronectine, la vimentine, la N-cadhérine et d'escargot expression ont diminué mais l'expression de la E-cadhérine a été augmentée dans les cellules tumorales NRP1 appauvrie (Fig. 5B). Le résultat montre que NRP1 peut conduire processus EMT dans le cancer gastrique. Parce que NRP1 est une cible en aval de miR-338, nous avons supposé que miR-338 pourrait déterminer le phénotype épithélial du cancer gastrique. Pour déterminer si les changements moléculaires typiques d'une EMT réduite se sont produits dans les cellules miR-338 exprimant, nous avons examiné l'expression de mésenchymateuses et épithéliales marqueurs dans les cellules AGS. L'analyse par immunotransfert a démontré que les niveaux de la fibronectine, la vimentine, la N-cadhérine et d'escargot expression ont été diminuées dans les cellules AGS avec l'expression forcée de miR-338. En outre, l'expression forcée de miR-338 a augmenté l'expression de la E-cadhérine dans la lignée de cellules AGS, tandis que les cellules témoins infectées sont restées E-cadhérine négatif. Nous avons constaté que miR-338 régulée la phosphorylation de ERK1 /2, P38 MAPK et Akt via NRP1; par conséquent, il était nécessaire de vérifier si miR-338 pourrait réglementer EMT via NRP1. L'analyse par immunoempreinte a montré que l'expression des marqueurs ci-dessus mésenchymateuses dans les cellules miR-338 exprimant a été rétablie à un niveau normal par la restauration de l'expression NRP1 (Fig. 5C). Au total, ces résultats ont démontré que miR-338 pourrait inhiber EMT via NRP1 dans les cellules de cancer gastrique.

miR-338 Diminue la croissance tumorale et Elimine D-MVA par ciblage NRP1 In Vivo

d'après les baisses observées dans les comportements migratoires, invasives et prolifératives dans AGS et MKN45 cellules infectées avec LV-hsa-mir-338, nous avons ensuite étudié le rôle de miR-338 dans la croissance in vivo. Nous sous-cutanée inoculé des souris nude avec des nombres égaux (1 × 10 ^{6 cellules par souris) de cellules AGS avec l'expression forcée de miR-338 ou cont-miR, avec ou sans restauration NRP1. l'incidence tumorale a été évaluée deux fois par semaine, et les tumeurs est apparue chez toutes les souris. expression miR-338 dans les tumeurs de souris nues a été mesurée en utilisant qRT-PCR, et nous avons trouvé que miR-338 expression significativement augmentée dans les tumeurs qui surexprimés miR-338 (figure 6A). L'expression forcée de miR-338 a inhibé significativement la croissance tumorale in vivo, mais la surexpression de NRP1 pourrait restaurer la croissance tumorale (Figure 6B). Ensuite, nous avons examiné l'expression de NRP1 dans les tumeurs de souris nues par western blot et immunohistochimie. Nous avons constaté que l'expression NRP1 significativement diminué dans les tumeurs qui surexprimés miR-338; Cependant, l'expression NRP1 a été restauré dans les tumeurs qui surexprimés NRP1 (Figure 6C, 4D). Ainsi, nous avons déduit que miR-338 a inhibé la croissance tumorale par l'arrêt de l'expression NRP1 in vivo. NRP1 peut stimuler tumorangiogenesis; Par conséquent, nous avons supposé que l'expression forcée de miR-338 empêcherait tumorangiogenesis via NPR1. Une coloration immunohistochimique pour CD34 a été utilisé pour évaluer le nombre et les caractéristiques morphologiques des vaisseaux sanguins au sein de chaque tumeur. Les vaisseaux ont été dénombrées par comptage du nombre de structures dont la coloration discrète à l'intérieur de chaque champ sans tenir compte de la taille du navire ou de la perméabilité. Les vaisseaux dans les tumeurs qui surexprimés miR-338 étaient subjectivement moins que les tumeurs cont-miR-surexprimant; cependant, le nombre des vaisseaux a été rétablie dans les tumeurs surexprimant NRP1 (figure 6E). La zone microvasculaire numérique (D-MVA) a été analysé pour incorporer la taille du navire et la perméabilité à l'analyse du système vasculaire de la tumeur en fournissant une estimation de la surface de la lumière intégrée, et probablement la perpendiculaire du flux sanguin vers la section de la tumeur. Le D-MVA a été réduite dans les miR-338 tumeurs surexprimés. A notre grande surprise, nous avons constaté que les tumeurs NRP1-surexprimés fait pas de manière significative montrent une augmentation de l'angiogenèse, mais la réduction de la D-MVA en raison de miR-338 surexpression a été restauré dans les tumeurs qui surexprimés NRP1 (Figure 6F et 6G). Nous pensons que l'expression NRP1 était déjà régulée positivement dans le cancer gastrique, donc encore NRP1 surexprimée ne peut pas augmenter de manière significative la vascularisation des tumeurs, mais peut restaurer la vascularisation de la tumeur qui a été réduit par miR-338. Ces résultats indiquent que miR-338 réduit la croissance tumorale et supprime D-MVA en ciblant NRP1 in vivo.}

Discussion

Utilisation de puces à ADN et la bioinformatique, nous prédit que la cible miARN de NRP1 était miR -338. La recherche a montré que l'expression de miR-338 varie dans différentes tumeurs. Huang XH et al. a montré que miR-338-3p supprimé foie invasion des cellules cancéreuses en ciblant lissée [20]. En outre, dans les mélanomes, miR-193a, miR-338 et miR-565 ont été présentés à sous-exprimés chez les patients présentant une mutation BRAF [21]. A partir de ces données, nous avons déduit que miR-338 peut agir comme un suppresseur de tumeur. Il n'y a pas de littérature publiée quant à savoir si miR-338 est sous-exprimée dans le cancer gastrique. Dans notre étude, les niveaux de miR-338 expression ont d'abord été mesurées dans 41 échantillons de cancer gastrique humains et 24 échantillons de tissus normaux adjacents de la muqueuse. Nous avons ensuite évalué l'expression de miR-338 dans cinq lignées cellulaires de cancer gastrique et dans des lignées cellulaires de la muqueuse gastrique normale. Nous avons découvert que l'expression de miR-338 a été régulée à la baisse dans les tissus tumoraux et lignées de cellules cancéreuses. En outre, la surexpression de miR-338 peut inhiber la migration des cellules du cancer gastrique, l'invasion et la prolifération, et de favoriser l'apoptose. Pendant ce temps, ces qualités tumorigènes peuvent être complètement restaurées par NRP1 surexpression. En outre, les dosages de rapporteur de luciférase ont suggéré que miR-338 cible NRP1 directement. Ainsi, nous concluons que miR-338 agit comme un suppresseur de tumeur potentielle dans le cancer gastrique, une fonction qui est accompli en limitant l'expression de NRP1.

Comme un récepteur non-tyrosine-kinase, NRP1 peuvent augmenter modérément la l'expression de la phosphorylation de ERK1 /2, Akt et P38MAPK. M Akagi et al. ont trouvé que l'inhibition de NRP-1 a réduit l'expression de la phosphorylation de ERK1 /2, Akt et P38MAPK [22]. En outre les cellules, les recherches ont montré que l'expression de ERK1 /2 phosphorylation a été régulée à la hausse dans le PNR-1-surexprimant [23]. Dans cette étude, nous avons constaté que surexprimée miR-338 pourrait diminuer l'expression de la phosphorylation de ERK1 /2, Akt et P38MAPK, un effet qui a été renversé sur la restauration NRP1. L'activation d'ERK, d'Akt et P38MAPK en association avec l'apoptose survie /résistance cellulaire a été bien documentée dans divers systèmes modèles [24], [25], [26].

• PLOS ONE: Relation entre P53 Statut et la réponse à la chimiothérapie chez les patients atteints de cancer gastrique: une méta-analyse
• PLOS ONE: Expression de la famille EGF dans le cancer gastrique: La régulation négative de HER4 et son activation Ligand NRG4