Ploche ONE: microRNA-338 inhibuje rast, invázia a metastázy rakoviny žalúdka zacielením NRP1 Expression

abstraktné

NRP1 ako multifunkčné non-tyrozín-kináza receptory hrajú kľúčovú úlohu v progresii nádoru. MikroRNA (miRNAs) sú dôležitou triedou všadeprítomné génov, ktoré sa zúčastňujú radu biologických funkcií, najmä rakoviny. Zostáva nejasné, či miRNA môžu regulovať expresiu NRP1. Cieľom tejto štúdie bolo identifikovať miRNA, ktoré by mohli inhibovať rast, invázia a metastáz rakoviny žalúdka zacielením NRP1 výraz. Zistili sme, že mier-338 expresie bola znížená v žalúdočných nádorových bunkových línií a v žalúdočných rakovinových tkanivách. Navyše sme zistili, že mier-338 inhibuje žalúdočné migráciu nádorových buniek, inváziu, proliferáciu a podporovať apoptózu zacielením NRP1 výraz. Ako upstream regulátor NRP1, Mir-338 sa priamo zameriava NRP1. Nútené expresie MIR-338 inhibuje fosforyláciu ERK1 /2, P38 MAPK a Akt; Avšak výraz fosforylovaného ERK1 /2, P38 MAPK a Akt bol obnovený nadmernou expresiou NRP1. V AGS bunkách infikovaných s MIR-338, alebo transfekciou SiNRP1, došlo k zníženiu hladiny proteínu v fibronektín, vimentin, N-cadherinu a Slimák, ale expresia E-cadherinu bola zvýšená. Expresie mezenchymálnych markerov v Mir-338 exprimujúcich buniek bola obnovená na normálnu úroveň navrátením NRP1 výrazu. In vivo
, Mir-338 sa znížil aj rast nádoru a potlačila D-MVA zacielením NRP1. Preto sme došli k záveru, že mier-338 sa chová ako nové tumor supresorového génu pri rakovine žalúdka. MIR-338 môže znížiť migračný, invazívne, proliferačnej a apoptotické chovanie, ako aj rakoviny žalúdka EMT, zoslabením expresie NRP1

Citácia :. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) microRNA-338 inhibuje rast, invázia a metastázy z rakoviny žalúdka zacielením NRP1 výraz. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10,1371 /journal.pone.0094422

Editor: Chih-Hsin Tang, Čína lekárska univerzita, Taiwan

prijatá: 18. októbra 2013; Prijaté: 16. marca 2014; Uverejnené: 15.apríla 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený projekt pre vedu a techniku ​​výboru Shapingba okrese Chongqing (201302). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Neuropilins vrátane neuropilin1 (NRP1) a neuropilin2 (NRP2), sú multifunkčné receptory non-tyrozín kinázy, ktoré boli prvýkrát identifikované na základe ich kritické úlohy vo vyvíjajúcom sa nervovom systéme [1]. Nrp1 a Nrp2 majú 44% homológie a zdieľajú mnoho štrukturálne a biologické vlastnosti. NRP1 existuje hlavne v bloodvesselendothelia a NRP2 sa vyskytuje hlavne v lymfatických ciev [2], [3]. Následné vyšetrovanie identifikované NPR-1, ako receptor pre vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF) -A izoformy VEGF-165 v oboch endotelových bunkách a niektorých nádorových buniek [4], [5]. Výskum ukázal, že NRP1 sú up-regulované v rôznych typov nádorov, a je vyjadrená v rôznych nádorových vasculatures [3], [6], čo naznačuje, že NRP1 hrá dôležitú úlohu v progresii nádoru. Čoskoro výskum ukázal, že NRP1 by mohli mať vplyv na rast nádorov, ako coreceptor VEGFR [5]. Vedci neskôr zistil, že NRP1 by mohol zvýšiť tumorangiogenesis, urýchliť rast nádoru a obrubník apoptózu nádorových buniek, bez toho aby VEGFR [7]. NRP1 môže byť coreceptor iných rastových faktorov, ktoré osvetľuje prečo VEGF signál cez neuropilins v neprítomnosti VEGFR-1 alebo VEGFR-2 [8], [9]. Ako coreceptor z TβRI /TβRII, NRP1 môže zabrániť apoptózu nádorových buniek a urýchlenie rastu nádoru prostredníctvom ako kanonické a non-kanonické signalizácia [10]. NRP1, ako coreceptor PDGFR /cMet, môže zvýšiť tumorangiogenesis cez P38MAPK a EQF signalizácie [11].

upstream regulačné gény NRP1, že transkripčné faktory SP1 /3 a AP1 môže regulovať expresiu NRP1 [ ,,,0],12]. Niektoré výskumy ukázali, že butyrát potláča expresiu neuropilin Aj v kolorektálneho bunkových líniách prostredníctvom inhibície SP1 transaktivace [13].

mikroRNA (miRNA) sú nekódujúca RNA molekuly asi 21 až 23 nukleotidov, ktoré regulujú génovú expresiu na posttranskripční úrovni [14], [15], [16]. miRNA expresie profilovanie analýzy odhalili globálne down-reguláciu hladiny zrelé miRNA v primárnych ľudských nádorov vzhľadom na normálnu tkanive [17], [18]. Tak, miRNA môže fungovať ako nádorové supresormi alebo onkogénov a porušenú reguláciou expresie miRNA by mohli prispieť k nádorových buniek metastáz. Zostáva nejasné, či miRNA môžu regulovať expresiu NRP1; Preto sme sa zamerali na určenie cieľovej miRNA z NRP1. Medzi ďalšie funkcie NRP1 môžu byť objavené pri štúdiu cieľovej miRNA z NRP1.

Materiály a metódy

Human vzorky tkaniva a bunkových línií

Táto štúdia použité čerstvé tkanivá, vrátane 41 ľudských vzoriek rakovina žalúdka a 24 vzoriek susedných normálnych sliznice odvodených z 41 pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok na druhom Affiliated nemocnice Chongqing lekárskej univerzity v rokoch 2012 až 2013. Táto štúdia bola vykonaná v súlade s "biomedicínsky výskum týkajúci sa ľudských etické posúdenie (nezaručené) "Vyhláška ministerstva zdravotníctva a Helsinskej deklarácie o etických zásadách pre lekársky výskum na človeku. Všetky vzorky boli získané s informovaným súhlasom pacienta a experimenty boli schválené Institutional Review Board druhej Affiliated nemocnice Chongqing lekárskej univerzity. Všetci účastníci ak písomný informovaný súhlas s účasťou v štúdii

SGC-7901, HGC-27, AGS, bunkové línie MKN-45 a N87 boli získané z American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , USA) a bunkové línie GES-1 bol zakúpený od Type Culture Collection čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína). Bunkové línie boli kultivované v RPMI 1640 (Hyclone, Logan Utah USA), doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS) a boli inkubované pri 37 ° C s 5% CO2.

Základný náter Izolácia RNA a miRNA detekcie

priméry pre mier-338-3p a U6 boli vyrobené s použitím súpravy miScript Primer metóda (Qiagen Dusseldorf Nemecko). Sekvencia miRNA použitých v tejto štúdii boli nasledujúce: Mir-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG a U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Reverzný priméry boli taktiež použité v kroku reverznej transkripcie. Celková miRNA bola extrahovaná z kultivovaných buniek a vzorky ľudských tkanív s použitím RNAiso pre malé RNA (Takara Bio, Otsu, Japonsko) v súlade s pokynmi výrobcu. chvosty Poly-A sa pridá k Mir-338 a U6 s miRNA reakčným pufra Mix (Takara Bio), a potom sa cDNA sa syntetizuje z 5 ng celkovej RNA pomocou RT miRNA PrimeScript zmes enzýmov (Takara Bio). Real-time PCR bola vykonávaná v reálnom čase systéme CFX96 PCR detekcie (Bio-Rad) s SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio). Podmienky PCR boli 95 ° C počas 30 s, nasleduje 40 cyklov 95 ° C počas 5 sekúnd a 60 ° C počas 30 s. Údaje boli normalizované proti U6 snRNA. Po zosilnenie, je analýza krivky topenia bola vykonaná na potvrdenie špecifickosti produktov.

pcDNA expresné plazmidy a Plasmid transfekcia

ORF sekvencie NRP1 bol amplifikovaný z genómovej DNA izolovanej z AGS bunky linka, a oblasť ORF NRP1 cDNA potom bola subklonována do vektora GV230 (génoch Corporation, Shanghai, Čína) .v plazmid bol transfekován do AGS a MKN45 buniek použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty štyri hodín po transfekciu bunky boli použité pre záchranný experimentu. AGS bunky, ktoré boli stabilne transfekovány NRP1 boli vyberané na 2 ug /ul puromycin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francúzsko) 48 h po transfekciu.

miRNA Gene Klonovanie a expresia Mimomaternicové

ľudský MIR-338 gén bol amplifikovaný PCR z genómovej DNA normálneho a klonovaný do lentivirovým vektorom. Lentiviry boli generované kotransfekcí HEK293T buniek s plazmidy PGC-NN, pHelper 1,0 a 2,0 pHelper za použitia Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vírusy boli zozbierané 48 hodín po transfekciu a infekcie bola vykonávaná v prítomnosti 2 mg /ml polybrenu (génoch Corporation). Kontrolný miRNA vírus bol zakúpený od génoch Corporation (Shanghai, Čína). AGS bunky, ktoré boli stabilne infikované MIR-338 boli vybrané za použitia 2 ug /ul puromycin (Invitrogen) 48 hodín po infekcii.

Gene Expression povalení by RNA interferencie

NRP1 expresie AGS bunky bol umlčaný transfekciu nasledujúce cielené siRNA sekvencie (Sangon Biotech, Shanghai, Čína), s Lipofectamine 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (pokiaľ to nie je uvedené, bolo použité siRNA). Kontrolný siRNA (sic) boli vytvorené zavedením 4 substitúcie báz v NRP1 zacielenia sekvencie (GATAGGTCATGACTGCCC). Štyridsať osem hodín po transfekciu, NRP1 expresia bola skúmaná imuno-blottingom.

Luciferase Reporter Assay

A PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA cieľovej expresný vektor bol použitý pre testy 3'UTR luciferázové (Sangon Biotech, Shanghai, Čína). Cieľovou Onkogén miRNA-338 bol vybraný na základe on-line microRNA cieľovej databáze http://www.microrna.org/microrna/home.do~~pobj. Primeru sekvencie divokého typu 3 'UTR, boli nasledovné: vpred: 5'-CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3' a reverzné 5'-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3 '. Vzhľadom na to, že sú dve väzobné miesta v NRP1 3 'UTR, sme navrhli dve sekvencie primérov pre mutantné 3' UTR. Pre jeden mutantný 3 'UTR sa sekvencie primerov boli nasledovné: vpred: 5'-GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3' a reverznej: 5'-GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3 '. Po druhé mutantný 3 'UTR, že sekvencie primérov boli nasledovné: vpred: 5'GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3' a reverznej: 5'-GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3 '. Pre stanovenie luciferázy, Lipofectamine 2000 bol použitý pre cotransfect MKN45 buniek s HSA-Mir-338 a PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA cieľovej expresné vektory, ktoré obsahujú divokého typu alebo mutantný cieľových sekvencií. Svetlušiek aktivita luciferázy bola meraná s použitím testu Dual luciferázy (Promega, Madison, WI, USA) 18 h po transfekciu, a výsledky boli normalizované proti Renilla luciferázy. Každý reportér bol plazmid transfekován aspoň trikrát (v rôznych dňoch), a každá vzorka bol testovaný trikrát.

Bunková životaschopnosť a Clonability Testy

Transfekované bunky boli schovať do 96-jamkových doštičiek v hustote 1 x 10 ^{4 buniek /jamka. Roztoku MTT (20 ul 5 mg /ml MTT) bol pridaný ku kultúram (na celkový objem 200 ul) a inkubované počas 4 klobúk 37 ° C. Po odstránení kultivačného média, zostávajúce kryštály boli rozpustené v DMSO, a bola meraná absorbancia pri 570 nm. U testu tvorby kolónií, boli bunky schovať v nízkej hustote (1000 buniek /platnička) a nechali sa rásť až sa objavili kolónie viditeľné. Bunky potom boli zafarbené Giemsa a kolónie boli spočítané.}

migrácie a invázie Testy

Pre testy Transwell migračných, 10 x 10 ^{4 bunky boli umiestnené v hornej komore s non-potiahnuté membránou (24-jamkové doštičky; 8 mm veľkosti pórov BD Biosciences). Pre inváziu testoch, 2 x 10 5 boli bunky umiestnené v hornej komore sa Matrigel potiahnuté membrány (24-jamkové doštičky; 8 mm veľkosť pórov, BD Biosciences). Pre oba testy, boli bunky umiestnené v médiu bez séra a doplnenom 10% sérom bol použitý ako chemoatraktantu v dolnej komore. Bunky boli inkubované počas 16 hodín pri 37 ° C a 5% CO2 v inkubátore pre tkanivové kultúry. Po 16 hodinách, non-migrované /non-invading bunky boli odstránené z horných strán transwell membránové filtračné vložky za použitia bavlnené hrotom tampóny. Preneseného /napadnuté bunky na spodných stranách vložky boli zafarbené Giemsa a bunky boli spočítané.}

Protilátky

Protilátky proti fibronektínu, vimentinu, N-cadherinu, E-cadherin, šnek a GAPDH boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Fosfo-Erk1 /2, fosfo-Akt, fosfo-a P38MAPK boli zakúpené od abca (Cambridge, UK), a celková ERK1 /2, Akt a P38MAPK boli od BD Biosciences (USA). Protilátka proti NRP1 bol zakúpený od R &D Systems (Minneapolis, MN, USA), a HRP (chrenová peroxidáza) konjugovaným kozím anti-myším IgG a HRP-konjugovaný kozí anti-králičí IgG boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology

imuno-blottingom

Celkový proteín bol extrahovaný z transfekciou buniek za použitia RIPA Lysis Buffer (Beyotime, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. Po extrakty celých buniek proteín boli kvantifikované pomocou testu BCA proteín, ekvivalentné množstvo bunkových lyzátov boli vyriešené 10% elektroforézou SDS polyakrylamidovom gélu a boli prenesené na Polyvinylidénfluorid membrány, ktorý bol potom blokovaná v 5% netučného mlieka v TBST po dobu 1 hodiny pri 4 ° C. Bloty potom boli inkubované s primárnymi protilátkami. Po inkubácii s HRP-konjugované sekundárne protilátky, proteínové pásy boli vizualizované za použitia rozšírenej chemiluminiscenčného činidla (Millipore, Billerica, MA, USA). Boli použité nasledujúce riedenie protilátka: anti-fibronektín, 1: 200; anti-vimentin, anti-E-cadherinu a anti-N-cadherin, 1: 1200; anti-šnek a anti-GAPDH, 1: 500; anti-fosfo-Erk1 /2, anti-fosfo-Akt, a anti-fosfo-P38MAPK, 1: 2000; anti-NRP1, 1: 600; anti-totálnej Erk1 /2, anti-Akt, a anti-P38MAPK, 1: 500; a HRP-konjugovaná IgG, 1: 7000.

xenograftových Experimenty

Male athymických holých myší 6 až 8 týždňov veku boli získané zo zvierat experimentálnej časti mesta Chongqing lekárskej univerzity a boli aklimatizujú na 2 týždne. Táto štúdia bola vykonaná v prísnom súlade s odporúčaniami príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Chongqing lekárskej univerzity. Protokol bol schválený Výborom pre etiku pokusov na zvieratách Chongqing lekárskej univerzity. Všetky operácie boli vykonávané v pentobarbitalu sodného narkóze, a boli vykonané všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia. Rovnaký počet AGS buniek (10 ^{6) s nútenou expresie Mir-338 alebo cont-mier, s alebo bez NRP1 reštaurovanie, sa pozastavili v 100 ul PBS a podať subkutánne do pravého zadného boku každej myši (10 myší v skupine) rast .Tumor bola denne sledovaná v každej skupine. Objemu nádoru bola vypočítaná podľa vzorca: V = 1/2 x b2, kde je najdlhšia os nádorov, a b je najkratšia os nádoru. Myši boli usmrtené 5 týždňoch a nádory boli rozdelené do dvoch častí. Jedna časť bola stanovená v formalínom pre následnú imunohistochemické analýzou, a druhá časť bola zachovaná v liquidnitrogen pre western blotting alebo QRT-PCR.}

Imunohistochémia

Nádory konzervovaných v formalínu boli umiestnené v parafínové bloky a rozrezané na pozitívne nabitých sklíčka. Rezy boli zbavené parafínu v xyléne, hydratované odstupňované alkoholu, a vopred pre získanie antigénu v citrátovom pufri po dobu 20 minút v 98 ° C parníkom (CD34 a NRP1). Rezy boli inkubované pri teplote 4 ° C cez noc s CD34 (1: 200, Santa Cruz Biotechnology) a NRP1 (1: 100 R &D Systems). Imunologické bola vykonaná s použitím ultrasenzitivní S-P Detection Kit (Kit-9720, Maixin Fuzhou, Čína), a farba bola vyvinutá pomocou DAB kitu (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, Čína) .Subsequently, rezy boli kontrastne hematoxylínom. Sklíčka sa zafarbia H & e. Posúdiť morfológiu

Kvantifikácia imunohistochemické Stain intenzity

Ak chcete zistiť hustotu nádor mikrociev päť náhodne vybraných pre svetlé mikroskopické obrazy (zväčšenie 40 x; area 0,89 mm ^{2) na vzorke boli získané ako je popísané vyššie, a pozitívne zafarbené mikrocievkach boli počítané pomocou programu ImageJ. Červeného kanála, zodpovedajúce CD34 farbenie, sa izoluje a digitalizovaný na binárne obraz, s čiernou uvedením farebného cievy a biele označujúce žiadny obraz. Plavidlá s lúmenov boli digitálne naplnený, a kompozitný D-MVA bola kvantifikovaná. Použitie programu ImageJ, hnedej sfarbené obrazy špecifické pre DAB farbenie sa extrahujú farebné dekonvoluce makro. Všetky hodnoty intenzity v rovnakej skupine boli spriemerované pre výpočet pomerov medzi rôznymi skupinami.}

softvér Štatistická analýza

SPSS 17.0 boli použité pre štatistické analýzy. Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (S.D.). Porovnanie skupiny boli vykonané za použitia Studentovho t-testu. Rozdiely boli považované za významné pri p. ≪ 0,05

Výsledky

MIR Selection

Aby mohla byť zahrnutá v našej následnej analýze proteínové ciele NRP1 muselo byť zhodne predpovedajú najmenej tri z nasledujúcich štyroch predikčných nástrojov: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan index.html) a miRDB (mirdb.org/miRDB/). Na predajnej verzii januára 2012 založený, sme zistili, 11 mikroRNA, ktoré potenciálne cielené NRP1. Mali sme predtým identifikovali niekoľko miRNA abnormálne vyjadrené v karcinómu žalúdka pomocou génového čipu [19] (tabuľka 1). Na základe uvedenej dva, sme predpovedali ťažobné Mirna z NRP1: Mir-338

MIR-338 je down-regulované v rakovina žalúdka tkanivách a bunkových línií

Ak chcete preskúmať role Mir. -338 do rozvoja ľudských žalúdočné rakoviny, sme merali jeho úroveň expresie v 41 ľudských vzoriek žalúdočnej rakovinou a 24 priľahlých vzoriek normálne sliznice. Podľa analýzy QRT-PCR, je úroveň expresie MIR-338 bola významne znížená v nádorových tkanivách v porovnaní so susednými normálne sliznice tkanív (obr. 1A). Okrem toho, mier-338 expresie bol znížený v žalúdočných rakovinových bunkových línií (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 a N87), v porovnaní s normálnou sliznice žalúdka bunkové línie (GES1) (obrázok 1B). Tieto výsledky naznačujú, že mier-338 je down-regulovaná v nádorových bunkách žalúdka, konštatovanie, že by mohli byť relevantné pre vývoj ľudského žalúdka rakoviny.

MIR-338 Priamo Ciele onkogénnych NRP1

NRP1 bolo označená za dôležitý molekula, ktorá poháňa žalúdočné migráciu a inváziu rakovinových buniek. Použitie nástroja pre predpovedanie, sme predpokladali, že cieľ miRNA z NRP1 bol MIR-338. Pre ďalšie potvrdenie, že mier-338 sa priamo zameriava na onkogénu NRP1 sme vykonali luciferázové reportéri testy skúmať, či MIR-338 komunikuje priamo s cieľovou onkogénnym NRP1. Identifikovali sme dve potenciálne miesta viazania Mir-338 na 3 'UTR z NRP1 mRNA. Ak chcete zistiť, či NRP1 je regulované MIR-338 prostredníctvom priamej väzby na 3 'UTR NRP1 sme skonštruovali sériu fragmentov 3'UTR, vrátane plnej dĺžky divokého typu NRP1 3'UTR, väzobné miesto pre 1 mutantom a väzobné miesto 2 mutant (obr. 2A). Tieto fragmenty boli potom vložené do psiCHECK2 luciferázového reportérového plazmidu. Zistili sme, že ko-transfekcia MIR-338 a divokého typu NRP1 3 'UTR spôsobilo významné zníženie luciferázové jednotiek v porovnaní s kontrolami. Avšak, čo-transfekcia MIR-338 a mutantný NRP13'UTR nespôsobila zníženie luciferázové jednotky (viď obr. 2B). Tieto výsledky naznačujú, že mier-338 ciele NRP1 priamo.

MIR-338 inhibuje Žalúdočné Cancer Cell migrácie, invázie a proliferácie a podporuje apoptózu NRP1

Ak chcete skúmať funkčný význam MIR-338 nadmernej expresie u karcinómu žalúdka, sme infikovaných žalúdočné nádorových bunkových línií AGS a MKN45 sa LV-HSA-mir-338. V porovnaní s expresiou cont-pokoj, pokoj-338 sa výrazne nadmerne exprimovaný u AGS a bunkových línií MKN45 po infekcii LV-HSA-MIR-338 (obrázok 3A). Tiež sme zistili, že v porovnaní s cont-MIR expresie NRP1 štatisticky významne down-regulované v AGS a bunkových línií MKN45 po infekcii LV-HSA-MIR-338 (obr 3B). Bunky s núteným expresie Mir-338 vykazoval výrazne znížila proliferácia v porovnaní s bunkami s núteným expresie Mir-cont (obrázok 3C). MIR-338 bunky infikované tiež vykazovali zníženú schopnosť tvorby kolónií: počet ložísk v Mir-338 exprimujúcich buniek bola znížená v porovnaní s pokr-MIR-infikovaných buniek (obrázok 3D). Migrácia Transwell a testy Matrigelové invázie preukázala, že mier-338 významne znížila migrácie a invázie kapacít AGS a MKN45 buniek (obr 3e). Fluorescenčné aktivované triedenie buniek (FACS) analýzy vyplýva, že nútené expresie MIR-338 vedie k žalúdočným nádorových buniek apoptózu. Percento z celkového počtu apoptotických buniek (skorý proapoptotický + neskoré proapoptotický) výrazne zvýšil o 11% v reakcii na Mir-338 v porovnaní s nadmernou expresiou cont-MIR nadmernej expresii v bunkách AGS. Zvýšenie o 10% v počte apoptotických buniek bola pozorovaná v bunkách MKN45 s Mir-338 v porovnaní s nadmernou expresiou cont-MIR (obrázok 3F). MIR-338 by mohla regulovať expresiu NRP1 priamo inhibícia NRP1 prepis alebo iných nepriamych obvodov, takže ďalší zistiť, či je zníženie NRP1 expresie by mohla vysvetliť inhibíciu žalúdočné migrácie nádorových buniek, invázia a proliferácia pozorovaná po násilnom vyjadrení spätných 338. Preto sme nútení expresie Mir-338 v bunkách AGS spolu s konštruktom obsahujúcim NRP1 kódujúci sekvenciu, ale postrádajú 3 'UTR na NRP1 mRNA. V dôsledku toho, a tento konštrukt bol získaný NRP1 mRNA, ktorá bola rezistentné k MIR-338. Zistili sme, že migrácia karcinómu žalúdka buniek, invázia, množenia a apoptóza bola obnovená v bunkovej línii AGS s núteným expresie Mir-338 a NRP1 reštaurovanie (obrázok 3G-3J). Tieto výsledky ukazujú, že mier-338 inhibuje migráciu žalúdka rakovinových buniek, invázia a proliferácia a podporuje apoptózu zacielením NRP1.

Effect of Mir-338 na signálnych dráh v AGS Bunky

Ako non tyrozín-kinázy receptora, NRP1 môže mierne zvýšiť expresiu fosforylácie ERK1 /2, Akt a P38MAPK podporovať proliferáciu nádorových buniek a metastáz, rovnako ako k obmedzeniu apoptózu a imunitnej odpovede. Vzhľadom k tomu, NRP1 je downstream cieľom MIR-338, predpokladali sme, že mier-338 by mohla znížiť expresiu fosforylácie ERK1 /2, Akt a P38MAPK. Zistili sme, že nútené expresie MIR-338 inhibuje fosforyláciu ERK1 /2, ale bez významnej zmeny relatívnej hladina expresie celkovej ERK1 /2. MIR-338 by mohla tiež znížiť fosforyláciu p38 MAPK a Akt (obr 4A). MIR-338 by mohla viazať 3 'UTR na NRP1 mRNA pre reguláciu fosforylácie ERK1 /2, Akt a P38MAPK; Avšak sme nevedeli, či MIR-338 by mohla zviazať 3'UTRs iných génov, aby sa dosiahla rovnaké účinky. Takže záchrannej experiment bol vykonaný, a obnova NRP1 expresie bola potvrdená pomocou imunoblotovou analýzou (obr 4B). Zistili sme, že hladiny fosforylácie ERK1 /2, Akt a P38MAPK neboli podstatne zmenené v AGS bunkách s núteným expresie Mir-338 a NRP1 reštaurovanie (obr 4C). Preto sme došli k záveru, že mier-338 reguluje fosforylácii ERK1 /2, P38 MAPK a Akt cez NRP1.

MIR-338 Určuje epitelu fenotyp rakovina žalúdka

EMT je dôležitým mechanizmom spojená s rakovinou invazívnosti a metastázovaniu. Fenomén EMT je definovaná ako prechod epitelových buniek fibroblastoid- alebo mezenchymálnych bunkách podobných. EMT je charakterizovaná stratou epitelových markerov a získavanie mezenchymálnych komponentov. E-cadherin, occludin a cytokeratin sú downregulated počas EMT, zatiaľ čo N-cadherinu, vimentin, fibronektínu a slimák sú up-regulované. NRP1 zlepšuje signalizáciu prostredníctvom troch hlavných ciest, ktoré boli spojené s EMT, tj, TGF-β, Hh a HGF /cMet. Ak chcete zistiť úlohu NRP1 pri zachovaní mezenchymálnych fenotyp žalúdočných bunkách, sme zrazil expresiu NRP1 RNA interferencia (RNAi) (obr. 5A) a skúmali expresiu mezenchymálnych markerov, ako je fibronektín, vimentin, N-cadherinu a slimák, ako aj as epiteliálne značka E-cadherin, v AGS bunkách. Zistili sme, že expresné hladiny fibronektín, vimentin, N-cadherinu a Slimák boli znížené, ale expresia E-cadherinu bola zvýšená v nádorových buniek NRP1 ochudobnený (obr. 5B). Výsledok ukazuje, že NRP1 môže riadiť proces EMT u karcinómu žalúdka. Vzhľadom k tomu, NRP1 je downstream cieľom MIR-338, predpokladali sme, že mier-338 by mohli stanoviť, epiteliálne fenotyp karcinómu žalúdka. Na určenie, či molekulárne zmeny typické zníženej EMT došlo v Mir-338-exprimujúcich bunkách, sme skúmali expresiu mezenchymálnych a epiteliálnych markerov v AGS bunkách. Analýza imunoblot preukázané, že hladiny expresie fibronektín, vimentin, N-cadherinu a Snail boli v AGS buniek s núteným expresie Mir-338 sa znížil. Okrem toho nútenej expresie MIR-338 k zvýšeniu expresie E-cadherinu v bunkovej línii AGS, zatiaľ čo bunky kontrolných infikovaných zostal E-cadherin negatívne. Zistili sme, že mier-338 reguluje fosforylácii ERK1 /2, P38 MAPK a Akt cez NRP1; Preto bolo potrebné zistiť, či MIR-338 by mohla upravovať EMT cez NRP1. Analýza imunoblot ukázala, že expresia z vyššie uvedených mezenchymálnych markerov v Mir-338 exprimujúcich buniek bola obnovená na normálnu úroveň obnovy NRP1 expresie (obr. 5C). Dohromady tieto výsledky preukázali, že mier-338 môže inhibovať EMT prostredníctvom NRP1 v nádorových bunkách žalúdka.

MIR-338 znižuje rast nádoru a potláča D-MVA zacielením NRP1 In Vivo

na základe pozorovaných poklese migračných, invazívne a proliferatívne správanie v AGS a MKN45 buniek infikovaných LV-HSA-mir-338, sme skúmali ďalšie úlohu Mir-338 v raste in vivo. podkožne vrúbľovať sme nahé myši s rovnakými číslami (1 x 10 ^{6 buniek na myš) z AGS buniek s núteným expresie Mir-338 alebo Pokrač-Mir, s alebo bez NRP1 reštaurovanie. Výskyt nádoru bola hodnotená raz za dva týždne, a nádory sa objavili vo všetkých myší. MIR-338 expresie v nahých myšiach nádorov bola meraná pomocou QRT-PCR, a zistili sme, že mier-338 expresie významne zvýšila v nádoroch, ktoré nadmerne exprimovaný MIR-338 (obrázok 6A). The nútenej expresie MIR-338 významne inhibovala nádorový rast in vivo, ale nadmerná expresia NRP1 by obnovenie rastu nádoru (obrázok 6B). Ďalej sme sa zaoberali NRP1 výraz v nahých myšiach nádorov westernovým prenosom aj imunohistochemicky. Zistili sme, že NRP1 expresiu v nádoroch, ktoré nadmerne exprimovaný MIR-338 významne znížil; Avšak, NRP1 expresie bol obnovený na nádory, ktoré nadmerne exprimovaný NRP1 (obrázok 6C, 4D). Preto sme sa vyvodiť, že mier-338 inhibícia rastu nádoru znižovaní NRP1 expresie in vivo. NRP1 môže zvýšiť tumorangiogenesis; Preto sme predpokladali, že nútené expresie MIR-338 by inhibovať tumorangiogenesis cez NPR1. Imunohistochemické farbenie na CD34 bola použitá pre vyhodnotenie počet a morfologické vlastnosti ciev v každom nádoru. Nádoby bol vypočítaný spočítaním množstva štruktúr s diskrétne farbením v každej oblasti, bez ohľadu na veľkosť plavidla alebo priechodnosti. Plavidlá v nádory, ktoré nadmerne vystavený MIR-338 boli subjektívne menšia ako pokra-MIR-nadmernou expresiou nádorov; Avšak, počet plavidiel bol obnovený na nádory, ktoré nadmerne exprimovaný NRP1 (obrázok 6E). Digitalizovaný mikrovaskulárna plocha (D-MVA) bola analyzovaná, aby sa začlenil veľkosti plavidla a priechodnosti do našej analýzy nádorových ciev tým, že poskytuje odhad integrovaného lumenu oblasti a, pravdepodobne, prietok krvi kolmý k časti nádoru. D-MVA bol redukovaný v Mir-338 nadmerne exprimovaný nádormi. K nášmu prekvapeniu sme zistili, že NRP1-nadmerne exprimovaný nádormi sa významne ukazujú zvýšenú angiogenézu, ale zníženie D-MVA v dôsledku nadmernej expresie MIR-338 bol obnovený na nádory, ktoré nadmerne exprimovaný NRP1 (obrázok 6F a 6G). Domnievame sa, že NRP1 expresie bola up-regulovaná už u karcinómu žalúdka, a tak ďalej nadmerne exprimované NRP1 nemôže významne zvýšiť cievach nádorov, ale môže obnoviť cievach nádorov, ktorá bola znížená o MIR-338. Tieto výsledky naznačili, že mier-338 redukuje nádorový rast a potláča D-MVA zameraním NRP1 in vivo.}

Diskusia

využívaním postupov génového čipy a bioinformatika, sme predpokladali, že cieľ miRNA of NRP1 bol Mir -338. Výskum ukázal, že expresia MIR-338 sa líši v rôznych nádorov. Huang XH et al. ukázal, že mier-338-3p potlačená pečene rakovinových buniek inváziu zacielením vyhladené [20]. Okrem toho, v melanómov, mier-193a, mier-338 a mier-565 bolo preukázané, že underexpressed u pacientov s BRAF mutáciou [21]. Z týchto údajov sme vyvodiť, že mier-338 môže pôsobiť ako nádorový supresor. Neexistuje žiadne publikovanej literatúry o tom, či MIR-338 sa underexpressed u karcinómu žalúdka. V našej štúdii, hladiny expresie MIR-338 sa najprv meria v 41 ľudských vzorkách karcinómu žalúdka a 24 vzoriek susediacich normálnych tkanív sliznice. Potom sme vyhodnotili expresie Mir-338 v piatich bunkových línií karcinómu žalúdka a v normálnych bunkových línií sliznice žalúdka. Zistili sme, že expresia MIR-338 sa down-regulovaný ako v nádorových tkanivách a nádorových bunkových línií. Okrem toho je nadmerne exprimovaný MIR-338 môže inhibovať žalúdočné migráciu nádorových buniek, invázia a šírenie, a podporovať apoptózy. Medzitým tieto vlastnosti tumorigénny efekt môže byť úplne obnovená NRP1 nadmernej expresie. Okrem toho testy luciferázové reportéri naznačujú, že mier-338 ciele NRP1 priamo. Preto sme k záveru, že mier-338 pôsobí ako potenciálny nádorový supresor v karcinómu žalúdka, funkcia, ktorá sa vykonáva znižovanie expresie NRP1.

Ako receptorov non-tyrozín-kinázy, NRP1 môže mierne zvýšiť expresia fosforylácie ERK1 /2, Akt a P38MAPK. M Akagi et al. zistili, že inhibícia NPR-1 znižuje expresiu fosforylácie ERK1 /2, Akt a P38MAPK [22]. Navyše výskumy ukázali, že expresia ERK1 /2 fosforylácie bola up-regulované v NPR-1-exprimujúce bunky [23]. V tejto štúdii sme zistili, že nadmerne exprimovaný MIR-338 by mohla znížiť expresiu fosforylácie ERK1 /2, Akt a P38MAPK, čo je účinok, ktorý bol obrátený na NRP1 obnovy. Aktivácia EKR, Akt a P38MAPK v spojení s prežitím apoptóza odpor /buniek bola preukázaná v rôznych modelových systémoch [24], [25], [26].

• Ploche ONE: Vzťah medzi P53 postavenie a odpovede na chemoterapiu u pacientov s karcinómom žalúdka: metaanalýza
• Ploche ONE: Vyjadrenie rodiny EGF v žalúdočnej rakovine znižujúce množstvo HER4 a jej Aktivácia Ligand NRG4