PLoS ONE: mikrornk-338 inhibira rast, invaziju i metastaziranje želučanog raka ciljajući NRP1 Expression

Sažetak pregled

NRP1 kao multifunkcionalni non-tirozin-kinaze receptora igraju kritičnu ulogu u progresiji tumora. MikroRNA (miRNAs) su bitna klasa pervazivnih gena koji su uključeni u različite biološke funkcije, naročito raka. Ostaje nejasno da li miRNAs može regulirati izražavanje NRP1. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi miRNAs koja bi mogla spriječiti rast, invaziju i metastaziranje raka želuca ciljajući NRP1 izraz. otkrili smo da miR-338 ekspresija je reduciran u želučanim staničnih linija raka i u želučanom tkivu raka. Osim toga, otkrili smo da Mir-338 inhibirana želučane migraciju stanica raka, invazije, proliferaciju i apoptozu promovira ciljajući ekspresiju NRP1. Kao uzvodno regulator NRP1, Mir-338 izravno cilja NRP1. Prisilno izraz Mir-338 inhibira fosforilaciju ERK1 /2, p38 MAPK i Akt; Međutim, izraz fosforiliranog ERK1 /2, p38 MAPK i Akt je obnovljena prekomjernom ekspresijom NRP1. U AGS stanicama inficiranim Mir-338 ili transficiranih SiNRP1, razina proteina fibronektina, vimentin, N-kadherina i puževa su smanjeni, ali je povećana ekspresija E-kadherina. Izraz mezenhimalnih markera u Mir-338-stanica koje eksprimiraju je obnovljena na normalnu razinu od obnove NRP1 izražavanja. In vivo pregled, Mir-338 je također smanjio rast tumora i potisnuta D-MVA ciljajući NRP1. Stoga smo zaključili da se miR-338 djeluje kao novi tumor supresorskog gena u raka želuca. Mir-338 može smanjiti selica, invazivne, proliferacije i apoptoze ponašanja, kao i rak želuca EMT, slabljenjem izražavanje NRP1 pregled

Izvor:. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) mikrornk-338 inhibira rast, invaziju i metastaziranje raka želuca ciljajući NRP1 izraz. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10,1371 /journal.pone.0094422 pregled

Urednik: Chih-Hsin Tang Kina Medicinski fakultet Tajvan pregled

Primljeno: 18. listopada 2013. godine; Prihvaćeno: 16. ožujak 2014; Objavljeno: 15. travanj 2014 pregled

Copyright: © 2014 Peng, et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od projekta za znanost i tehnologiju odbora u Shapingba četvrti Chongqing (201302). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Neuropilins, uključujući neuropilin1 (NRP1) i neuropilin2 (NRP2), su multifunkcionalni non-tirozin-kinaze receptora koji su prvi put identificirati na temelju njihove kritične uloge u razvoju živčanog [1] sustava. Nrp1 i Nrp2 imaju 44% homologije i dijele mnoge strukturalne i biološka svojstva. NRP1 uglavnom postoji u bloodvesselendothelia i NRP2 se uglavnom nalaze u limfne žile [2], [3]. Naknadne istraživanja utvrđeno NRP-1 kao receptor za faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF) -A izoforma VEGF-165 u i endotelne stanice i nekih tumorskih stanica [4], [5]. Istraživanja su pokazala da NRP1 se regulira prema gore u više tipova tumora, a izražava se u različitim tumorskim vasculatures [3], [6], sugerirajući da NRP1 igra ključnu ulogu u progresiji tumora. Rana istraživanja pokazala da NRP1 može utjecati na rast tumora kao koreceptora za VEGFR [5]. Znanstvenici kasnije otkrili da NRP1 mogao potaknuti tumorangiogenesis, ubrzati rast tumora i praznog tumora apoptoze bez VEGFR [7]. NRP1 može biti koreceptore drugih faktora rasta, koji razjašnjava zbog VEGF signaliziraju kroz neuropilins u odsutnosti VEGFR-1or VEGFR-2 [8], [9]. Kao koreceptor od TβRI /TβRII, NRP1 može obuzdati tumora apoptozu i ubrzati rast tumora putem i kanonski i ne-kanonske signalizaciju [10]. NRP1, kao koreceptor PDGFR /cmet, može potaknuti tumorangiogenesis preko p38MAPK i ERK signalizaciju [11]. Pregled

Kao što je uzvodno regulatornim genima NRP1, faktori transkripcije SP1 /3 i AP1 mogu regulirati ekspresiju NRP1 [ ,,,0],12]. Neka istraživanja su pokazala da butirat potiskuje ekspresiju neuropilin I u kolorektalnim staničnim linijama putem inhibicije SP1 transaktivacije [13].

mikroRNA (miRNAs) su NEKODIRAJUĆA RNK molekule oko 21-23 nukleotida koji reguliraju ekspresiju gena na razini nakon transkripcije [14], [15], [16]. Mirna izraz profiliranje analize su pokazale globalno-naniže razinama zrelo Mirne u osnovnim ljudskim tumorima u odnosu na normalna tkiva [17], [18]. Dakle, miRNAs može funkcionirati kao tumora smetnji ili onkogena i nereguliranom Mirna izražavanja mogu doprinijeti tumorskih stanica metastaza. Ostaje nejasno da li miRNAs može regulirati izražavanje NRP1; Stoga, cilj nam je utvrditi ciljne miRNAs od NRP1. Dodatne funkcije NRP1 mogu se otkriti proučavanjem ciljne miRNAs od NRP1. Pregled

Materijali i metode

ljudsko tkivo Uzorci i Stanične linije

Ova studija se koriste svježe tkiva, uključujući 41 ljudska uzorci rak želuca i 24 uzoraka susjednih normalne sluznice dobivenim od 41 bolesnika podvrgnutih operaciji na Drugom SRODNE bolnici Chongqing Medical University između 2012. i 2013. istraživanje je provedeno u skladu s 'biomedicinska istraživanja na ljudima etiku pregled (Prijedlog) 'propisom Ministarstva zdravstva i Izjava Helsinki na etičkim načelima za medicinska istraživanja na ljudima. Svi uzorci su dobiveni uz informirani pristanak bolesnika i eksperimenti su odobreni od strane Institutional Review Board Drugog SRODNE bolnici Chongqing Medical University. Svi sudionici pod uvjetom pismeni informirani pristanak za sudjelovanje u ovom istraživanju pregled

SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 i N87 stanične linije dobivene su od American Type Culture Collection (ATCC;. Manassas, VA , SAD), a stanična linija GES-1 je kupljen od Type Culture Collection kineske akademije znanosti (Shanghai, Kina). Stanična linije su uzgajane u RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i inkubirane su pri 37 ° C s 5% CO2. Pregled

Primeri, RNA i Mirni Detection

Početnici za Mir-338-3p i U6 su proizvedene pomoću testa miScript primer kita (Qiagen Düsseldorf Njemačka). Sekvence miRNAs korištenih u ovom istraživanju bili su kako slijedi: Mir-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG i U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. Reverzna primeri su također korišteni u koraku reverzne transkripcije. Ukupno Mirna je ekstrahiran iz stanica u kulturi i uzoraka ljudskog tkiva koriste RNAiso za male RNA (Takara bio, Otsu, Japan) u skladu s uputama proizvođača. Poli-A repovi su dodani Mir-338 i U6 sa Mirna reakcijskog pufera Mix (Takara Bio), a zatim cDNA je sintetiziran od 5 ng ukupne RNA pomoću Mirna PrimeScript RT enzim Mix (Takara bio). Real-time PCR je izvedena u CFX96 sustava u realnom vremenu PCR za detekciju (Bio-Rad) sa SYBR premiks Ex Taq II (Takara bio). PCR uvjeti su bili 95 ° C za 30 s, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C u trajanju od 5 sekundi i 60 ° C tijekom 30 s. Podaci su normalizirani na U6 snRNA. Nakon pojačavanja, analiza krivulje taljenja je provedena da se potvrdi specifičnost proizvoda. Pregled

pcDNA Ekspresijski plazmidi i plazmida Transfekcija pregled

ORF sekvenca NRP1 je amplificiran iz genomske DNA izolira iz stanice AGS linija i ORF područje NRP1 cDNA je zatim subkloniran u vektor GV230 (GeneChem Corporation, Shanghai, Kina) .The plazmid je unesen u AGS i MKN45 stanice pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-četiri sata nakon transfekcije, stanice su korišteni za eksperiment spašavanja. AGS stanice koje su stabilno transfektirane s NRP1 su izabrani korištenjem 2 ug /ul puromicin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) 48 sata nakon transfekcije. Pregled

Mirni Gene Cloning and ektopijska ekspresija pregled

humani miR-338 gen PCR amplifikaciju od normalnog genomske DNA i kloniran u lentivirusnim vektorom koji. A lentivirusi su generirani od kotransfekcijom HEK293T stanica s plazmidima PGC-NN, pHelper 1.0 i 2.0 pHelper pomoću Lipofectamin 2000 (Invitrogen). Virusi su sakupljene 48 sati nakon transfekcije, te infekcije su provedena u prisutnosti 2 mg /ml polibren (GeneChem Corporation). Kontrola Mirna viruse je kupljen od GeneChem Corporation (Shanghai, Kina). AGS stanice koje su stabilno zaražene s Mir-338 su izabrani korištenjem 2 ug /ul puromicin (Invitrogen) 48 sati nakon infekcije. Pregled

Gene Expression obaranje od RNA interferencije

ekspresije NRP1 od AGS stanice su utihnuli transfekcijom sljedeće ciljane siRNA sekvenci (Sangon Biotech, Šangaj, Kina) s Lipofectamina 2000 (Invitrogen);
: agatcgacgttagctccaa;: aacacctagtggagtgata;: CAATCACGTGCAGGCTCAA (ako nije navedena, siRNAkorištena). Kontrola siRNA (sic) su unošenjem 4 zamjenu baza u NRP1 ciljanje slijed (GATAGGTCATGACTGCCC). Četrdeset osam sati nakon transfekcije, NRP1 ekspresija je pregledao imunoblot. Pregled

luciferaze Test pregled

PsicheckTM-2 Dual-luciferaze Mirna meta Vektor ekspresije je bio korišten za analize luciferaze 3'UTR (Sangon Biotech, Shanghai, Kina). Ciljna onkogena Mirne-338 je odabrana na temelju online mikrornk ciljne baze podataka http://www.microrna.org/microrna/home.do~~pobj. Nizovi primera za divlji tip 3'UTR su kako slijedi: prema naprijed 5'CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG -3 'i 5'-reverse ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3'. Budući da postoje dva vezna mjesta u NRP1 3'UTR, dizajnirali smo dva sekvencijama za mutanta 3'UTR. Za jedan mutant 3'UTR, nizovi primera bile su sljedeće: naprijed 5'GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 'i obrnuto: 5'GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3'. Za drugi mutiranim 3'UTR, nizovi primera su kao što slijedi: naprijed 5'GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 'i reverzno 5'GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3'. Za test luciferaze, LipofectAMINE 2000 je korišten za ko-transfekciju MKN45 stanica s HSA-Mir-338 i PsicheckTM-2 Dual-Luciferase Mirni ciljna ekspresija vektora koji sadrže divlji tip ili mutant ciljne sekvence. Aktivnost luciferaza krijesnice je mjerena pomoću Dual Luciferaze (Promega, Madison, WI, USA) 18 sati nakon transfekcije, a rezultati su normalizirani na Renilla luciferaze. Svaki reporter plazmid je transfektiran najmanje tri puta (u različite dane) i svaki uzorak je analiziran u triplikatu. Pregled

stanične vijabilnosti i Clonability Testovi

Transfektirane stanice su posađene u pločice s 96 jamica pri gustoći od 1 x 10 ^{4 stanica /jažica. Rješenje MTT (20 ul 5 mg /ml MTT) je dodan kulturama (u ukupnom volumenu od 200 ul) i inkubirano 4 kapu 37 ° C. Nakon uklanjanja medija za kulturu, preostale kristali su otopljeni u DMSO, a apsorbancija pri 570 nm. Za testom formiranja kolonije, stanice su nasađene na niske gustoće (1000 stanica /ploča) i ostavljene da rastu do pojave vidljive kolonije. Stanice su zatim obojene s Giemsa te prebrojane su kolonije. Pregled}

migraciju i invaziju Testovi

transjažice migracijske analize, 10 × 10 ^{4 stanice su stavljene u gornjem komori s ne-obložene membranom (24 i umetak; 8 mm veličine pora, BD Biosciences). Za pokusima invazije, 2 × 10 5 stanice su nanesene na ploču u gornjem komoru s Matrigel®-presvučene membranom (24 i umetak; 8 mm veličina pora, BD Biosciences). Za oba ispitivanja, stanice su nasađene u mediju bez seruma i medij, uz dodatak 10% seruma je korišten kao kemoatraktant u donje komore. Stanice su inkubirane kroz 16 h na 37 ° C i 5% CO2 u inkubator tkivne kulture. Nakon 16 h, non-migrirali /ne-napada stanice su uklonjene iz gornjih strane Transwell membranski filter uložaka korištenjem brisevi pamuk vrhom. Su migrirale /izvršile invaziju stanica na donjim stranama insertima su bojene sa Giemsa bojom i stanice su izbrojene. Pregled}

Antitijela

Protutijela fibronektinom, vimentin, N-kadherina, E-kadherina, puž i GAPDH su kupljeni od Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Fosfo-ERK1 /2, fosfo-Akt i fosfo-p38MAPK su kupljeni od Abcam (Cambridge, UK), a ukupni ERK1 /2, Akt, a p38MAPK su iz BD Biosciences (SAD). Antitijelo protiv NRP1 je nabavljen od R &D Systems (Minneapolis, MN, USA) i HRP (peroksidaza iz hrena) konjugirano anti-mišjim IgG i HRP-konjugirani kozji anti-zečji IgG su nabavljeni od Santa Cruz Biotechnology

Imunobloting pregled

Ukupni protein je ekstrahirana iz transfektiranih stanica korištenjem RIPA puferom za analizu (Beyotime Kina) u skladu s uputama proizvođača. Nakon što su proteinski ekstrakti cjelostaničnim kvantificirana pomoću ispitivanja BCA proteina, ekvivalentne količine staničnim lizatima razriješeno s 10% SDS poliakrilamid gel elektroforezom i bili preneseni na membranu poliviniliden-fluorida, koji je tada bio blokiran u 5% bezmasnim mlijekom u TBST 1 sat na 4 ° C. Mrlje su zatim inkubirane s primarnim antitijelima. Nakon inkubacije s HRP-konjugiranih sekundarnih antitijela, proteinske vrpce su vizualizirani pomoću pojačane kemiluminiscencije reagensa (Millipore, Billerica, MA, USA). Korišteni su sljedeći razrjeđenja antitijela: anti-fibronektin, 1:200; anti-vimentin, anti-E-kadherina i protutijela anti-N-kadherina, 1:1200; anti-Puž i anti-GAPDH, 1:500; anti-fosfo-ERK1 /2, anti-fosfo-Akt i anti-fosfo-p38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-ukupni ERK1 /2, anti-Akt i anti-p38MAPK, 1:500; i HRP-konjugirani IgG, 1:7000. pregled

pokuse sa stranim tijelom pregled

Muški atimičnih golih miševa 6 do 8 tjedana starosti su dobiveni od životinja Experimental Centar Chongqing Medical University i se aklimatiziraju 2 Tjedni. Ovo istraživanje provedeno je u skladu sa strogim preporukama Vodiču za njegu i korištenja laboratorijskih životinja Chongqing Medical University. Protokol je odobren od strane Odbora za etiku u životinjama Chongqing Medical University. Sve su operacije izvedene pod natrijev pentobarbitala anestezijom, a učinjeni su svi napori kako bi se smanjili patnju. Jednake skupine AGS stanica (10 ^{6), s prisilnom izrazom Mir-338 ili Cont-Mir, sa ili bez NRP1 obnove, suspendirani su u 100 ul PBS-a ubrizgava supkutano u desni stražnji bok svakog miša (10 miševi po skupini) rasta .Tumor je praćeni dnevno u svakoj skupini. Volumen tumora je izračunat koristeći formulu: V = 1/2 A × b2, gdje je najdulje tumor os, a b je kraća os tumor. Miševi su žrtvovani 5 tjedana kasnije i tumori su bili podijeljeni u dva dijela. Jedan dio bio je fiksiran u formolu za narednu imunohistokemijsku analizu, a drugi dio je sačuvan u tekući dušik za zapadnoj upijajući ili QRT-PCR. Pregled}

Imunohistokem pregled

Tumori sačuvane u formalinu su bili smješteni u parafinske blokove i podijeljeni na pozitivno nabijenih mikroskopiranje. Sekcije su deparafmizirani u ksilolu, hidrirana u ocjenjuju alkohol, i obrađene za dohvat antigena u citratnom puferu 20 minuta na C parenje 98 ° (CD34 i NRP1). Sekcije su inkubirani na 4 ° C tijekom noći s CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) i NRP1 (1:100 R &D Systems). Imunološko izvedena je pomoću ultraosjetljiv Detection Kit S-P (Kit-9720, Maixin, Fuzhou, Kina), a boja je razvijen korištenjem DAB kit (PW017, Sangon Biotech, Shanghai, Kina) .Subsequently, rezovi su negativno hematoksilinom. Rezovi su zatim obojeni s H & e. Procijeniti morfologiju pregled

Kvantifikacija Imunohistokemijska Stain intenziteta pregled

Kako odrediti gustoću tumor mikrožila, pet slučajno odabranih brightfield mikroskopske slike (povećanje od 40 ×; area 0,89 mm ^{2) po uzorku su dobiveni kako je gore opisano, te pozitivno obojene Mikro vaskularne žile su izbrojani pomoću programa ImageJ. Crvena kanala, što odgovara CD34 bojanja, bila izolirana i digitalizirani u binarnom sliku, s crnim ukazuje obojenih žile i bijela tome da nema mrlje. Brodovi s lumena su digitalno ispuni, kompozitni D-MVA se kvantitativno. Korištenje programa ImageJ, smeđe boje slike specifične za DAB bojenje ekstrahira se boji rastavljanje makro a. Sve vrijednosti intenziteta unutar iste skupine su u prosjeku za izračunavanje omjera između različitih skupina. Pregled}

Statistička analiza pregled

SPSS 17,0 softver je korišten za statističku analizu. Podaci su prikazani kao prosjek ± standardna devijacija (CD). Usporedbe skupina izvedena je pomoću Studentovog t-testa. Razlike koje se smatraju značajnim su p. ≪ 0,05 pregled

Rezultati

MIR Izbor pregled

Kako se uključiti u naše naknadne analize, protein mete NRP1 morao biti skladan predvidjeti najmanje tri od četiri predviđanja alata: Miranda (http://www.microrna.org), PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/), TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan /index.html) i miRDB (mirdb.org/miRDB/). Na temelju verzije siječnja 2012. otpuštanja, pronašli smo 11 mikroRNA koje bi ciljane NRP1. Mi ranije identificirali nekoliko miRNAs nenormalno izražene u želučanom karcinomu pomoću genetski čip [19] (Tablica 1). Na temelju gore navedene dvije, predvidio smo nadređenog Mirna od NRP1: Mir-338 pregled

Mir-338 je dolje-regulirana u rak želuca tkiva i staničnih linija

Kako bi istražili ulogu MIR. -338 u ljudskom razvoju raka želuca, mjerili smo na razinu ekspresije u 41 ljudskih uzoraka rak želuca i 24 susjednih normalnih uzoraka sluznice. Prema QRT-PCR analize, razina miR-338 ekspresije se znatno smanjila u tumorskim tkivima u odnosu na susjedne normalnoj sluznici tkivima (Sl. 1). Osim toga, miR-338 ekspresija smanjen na želučane tumorskih staničnih linija (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 i N87) u usporedbi s normalnim želučane sluznice stanične linije (GES1) (slika 1B). Ovi rezultati ukazuju na to da Mir-338 je dolje regulirano u želučanim stanicama raka, što je nalaz koji bi mogli biti relevantni za ljudski razvoj karcinoma želuca. Pregled

Mir-338 izravno cilja onkogenih NRP1 pregled

NRP1 je izvijestio da je važna molekula koja potiče želučane migracije raka i invaziju. Korištenje predviđanja alata, predviđa se da će ciljana Mirna od NRP1 je Mir-338. Kako bi se dodatno potvrdili da je Mir-338 izravno cilja onkogcni NRP1, proveli smo luciferaze analize je ispitati da li Mir-338 komunicira izravno s ciljnom onkogenim NRP1. Identificirali smo dva potencijalna mjesta za vezanje Mir-338 na 3'UTR na NRP1 mRNA. Da bi se utvrdilo da li NRP1 regulirano je Mir-338 dolazi izravno vezanje na 3'UTR NRP1, konstruirali smo niz 3'UTR fragmenata, uključujući full-length divljeg tipa NRP1 3'UTR, mjesto vezivanja 1 mutanta i vezno mjesto 2 mutant (Sl. 2). Ovi ulomci su zatim umetnuta u psiCHECK2 reporterskog plazmida. Otkrili smo da je ko-transfekcija Mir-338 i divljeg tipa NRP1 3'UTR uzrokovao značajan pad luciferaze jedinica u usporedbi s kontrolnom skupinom. Međutim, ko-transfekcija Mir-338 i mutanta NRP13'UTR nije uzrokovao smanjenje luciferaze jedinica (sl. 2b). Ovi rezultati ukazuju na to da Mir-338 meta NRP1 izravno. Pregled

Mir-338 inhibira želučano Cancer Cell migracije, invazije i proliferacije i potiče apoptozu NRP1 pregled

Da se ispita funkcionalna značaj Mir-338 prekomjernom ekspresijom kod raka želuca, zaraženi smo želučanog staničnim linijama karcinoma AGS i MKN45 s LV-HSA-mir-338. U usporedbi s izrazom Cont-Mir, Mir-338 je znatno pojačana ekspresija u AGS i staničnim linijama MKN45 nakon infekcije s LV-HSA-Mir-338 (slika 3A). Također smo otkrili da je, u usporedbi s Cont-Mir, izraz NRP1 bila je značajno dolje regulirano u AGS i staničnim linijama MKN45 nakon infekcije s LV-HSA-Mir-338 (slika 3B). Stanice s prisilnom izražavanja Mir-338 izloženi znatno smanjio širenje u usporedbi sa stanicama s prisilnim izražavanja Cont-MIR (Slika 3C). Mir-338-inficirane stanice su također pokazale smanjenu formiranja kolonija sposobnost: broj žarišta u Mir-338-stanica koje eksprimiraju je smanjen u usporedbi s nast-Mir-inficiranih stanica (Slika 3D). Migracija Transwell® i invaziju u Matrigel testovi pokazali da Mir-338 je značajno smanjio migraciju i invaziju kapacitete AGS i MKN45 stanicama (Slika 3e). Fluorescencija stanica aktivirano sortiranje (FACS) analiza pokazala je da je prisilno ekspresija miR-338, dovodi do želuca stanica karcinoma apoptoze. Postotak ukupnog broja apoptotičnih stanica (rano apoptoze + kasno apoptoze) značajno povećao se za 11%, kao odgovor na Mir-338 pojačane ekspresije u odnosu na nastavak-Mir prekomjernom ekspresijom u AGS stanicama. Povećanje od 10% u broju apoptotičnih stanica uočeno je u MKN45 stanicama s Mir-338 pojačane ekspresije u odnosu na Cont-MIR (Slika 3f). Mir-338 može regulirati izražavanje NRP1 izravno inhibira NRP1 prijepisa ili druge neizravne krugove, pa smo pored utvrditi da li je smanjenje NRP1 izražavanja može objasniti inhibicija želučane migracije stanica karcinoma, invazije i proliferaciju primijećen nakon prisilnog izražavanja miR- 338. Stoga smo prisiljeni ekspresiju Mir-338 u AGS stanica zajedno s konstruktom koji sadrži NRP1 kodiranja slijed, ali nedostaje 3'UTR na NRP1 mRNA. Kao posljedica toga, za ovaj konstrukt je dobiveno NRP1 mRNA koji je otporan na Mir-338. Otkrili smo da je migracija rak želuca stanica, invazije, proliferacija i apoptoza je obnovljena u staničnoj liniji AGS s prisilnom Mir-338 izražavanja i NRP1 obnove (Slika 3G-3J). Ti rezultati pokazuju da je Mir-338 inhibira migraciju rak želuca stanica, invaziju i proliferaciju i potiče apoptozu ciljajući NRP1. Pregled

Utjecaj Mir-338 na signalne putove u AGS Stanice

Kao što je ne- tirozin-kinaze receptora NRP1 umjereno može povećati ekspresiju fosforilacije ERK1 /2, Akt i p38MAPK promovirati proliferacije tumorskih stanica i metastaziranje kao i da se smanji apoptoze i imunoloških odgovora. Zbog NRP1 je nizvodni cilj Mir-338, pretpostavili smo da je Mir-338 može smanjiti ekspresiju fosforilacije ERK1 /2, Akt i p38MAPK. Otkrili smo da je prisiljen izraz Mir-338 inhibira fosforilaciju ERK1 /2, ali je relativna razina ekspresije ukupnog ERK1 /2 nije značajno promijenila. Mir-338 mogu smanjiti fosforilaciju p38 MAPK i Akt (slika 4A). Mir-338 može vezati 3'UTR na NRP1 mRNA regulirati fosforilaciju ERK1 /2, Akt i p38MAPK; Međutim, nismo znali da li Mir-338 mogla vezati 3'UTR drugih gena postići jednak učinak. Dakle spašavanja pokus, a obnova NRP1 izražavanja potvrđeno je kroz analizu imunoblot (slika 4b). Otkrili smo da je razina fosforilacija ERK1 /2, Akt i p38MAPK nisu značajno promijenjeni u AGS stanicama s prisilnom Mir-338 izražavanja i NRP1 obnove (Slika 4c). Dakle, možemo zaključiti da je Mir-338 regulira fosforilaciju ERK1 /2, p38 MAPK i Akt preko NRP1. Pregled

Mir-338 Određuje epitelnih fenotip rak želuca Netlogu

EMT je važan mehanizam karcinoma, invazivnost i metastaziranje. Fenomen EMT definiran kao prijelaz epitelnih stanica u fibroblastoid- ili mezenhimske stanice nalik. EMT karakterizira gubitak epitelnih markera i stjecanja mezenhimalnim komponenti. E-kadherina, okludina i keratin su regulirani u EMT, dok je N-kadherina, vimentin, fibronektina i puževa se regulira prema gore. NRP1 poboljšava signaliziranje putem tri glavna puta koji su povezani sa EMT, tj TGF-β, Hh i HGF /cMet. Da biste pronašli ulogu NRP1 u održavanju mezenhimalne fenotip stanica želuca, ispao mi se izraz NRP1 s RNA interferencije (RNAi) (Sl. 5A) i ispituje izraz mczcnhimnog markera kao što su fibronektina, vimentin, N-kadherina i puž, kao i epitelni marker E-kadherina u AGS stanicama. Otkrili smo da je razina ekspresije fibronektina, vimentin, N-kadherina i puž se smanjio, ali je ekspresija E-kadherina se povećao u NRP1-iscrpljena tumorskih stanica (sl. 5b). Rezultat pokazuje da NRP1 može voziti EMT proces raka želuca. Zbog NRP1 je nizvodni cilj Mir-338, pretpostavili smo da je Mir-338 mogao odrediti epitela fenotip raka želuca. Da bi se odredilo da li su molekularne promjene tipične za smanjenu EMT dogodila u Mir-338-stanica koje eksprimiraju, ispitali smo izraz mczcnhimnog i epitelnih biljega u AGS stanica. Analiza imunoblot pokazala je da je razina ekspresije fibronektina, vimentin, N-kadherina i puž smanjeni su u AGS stanicama s prisilnom izražavanja Mir-338. Nadalje, prisilno ekspresija Mir-338 povećava ekspresiju E-kadherina u staničnoj liniji AGS, dok stanice inficirane kontrolne-ostala E-kadherina negativna. Otkrili smo da je Mir-338 regulira fosforilaciju ERK1 /2, p38 MAPK i Akt preko NRP1; Stoga je bilo potrebno da se utvrdi da li Mir-338 može regulirati EMT putem NRP1. Analiza imunoblot pokazala da je izraz koji od gore navedenih mezenhimalnim biljega u Mir-338-stanica koje eksprimiraju se vratiti na normalnu razinu, obnovu NRP1 izražavanja (sl. 5c). Sve u svemu, ovi rezultati su pokazali da Mir-338 može spriječiti EMT preko NRP1 u želučanim stanicama raka. Pregled

Mir-338 smanjuje rast tumora i smanjuje D-MVA ciljajući NRP1 In vivo

na temelju uočenih smanjenjem selica, invazivnih i proliferacije ponašanja u AGS i MKN45 stanicama inficiranim LV-HSA-Mir-338, mi pored ispitati ulogu Mir-338 u rast in vivo. Mi potkožno inokulirane golim miševima s jednakim brojem (1 × 10 ^{6 stanica po mišu) od AGS stanica s prisilnom izražavanja Mir-338 ili Cont-Mir, sa ili bez NRP1 obnove. incidencija tumora je bila procijenjena dvotjedno i tumora pojavila u svim miševima. Mir-338 izražavanje u gole tumora miševa je mjerena pomoću QRT-PCR, a otkrili smo da je Mir-338 ekspresija značajno povećao u tumorima koji prekomjerno Mir-338 (slika 6a). Prisilno ekspresija Mir-338 značajno inhibira rast tumora in vivo, a prekomjerna ekspresija NRP1 može vratiti na rast tumora (slika 6b). Dalje, ispitali smo izraz NRP1 u gol tumora mišem Western analizom i imunohistokemijski. Otkrili smo da NRP1 izraz značajno se smanjio u tumorima koji prekomjerno Mir-338; Međutim, NRP1 izraz je obnovljen u tumorima koji prekomjerno NRP1 (Slika 6c, 4D). Dakle, zaključiti ćemo da je Mir-338 inhibira rast tumora suzbijanje NRP1 izraz in vivo. NRP1 može potaknuti tumorangiogenesis; dakle, pretpostavili smo da je prisiljen izraz Mir-338 će spriječiti tumorangiogenesis putem NPR1. Imunohistokemijsko bojanje CD34 je korišten za procjenu broj i morfološke karakteristike krvnih žila unutar svakog tumora. Žile su prebrojane računajući broj objekata s diskretnim bojanja u svakom području, bez obzira na veličinu posude ili prohodnosti. Plovila u tumorima koji prekomjerno Mir-338 su subjektivno manje od nast-Mir-ekspresijom tumora; Međutim, broj posuda je obnovljena u tumorima koji prekomjerno NRP1 (slika 6e). Digitalizirani mikrovaskularne površina (D-MVA) je analiziran da se uključi veličini plovila i prohodnost u našu analizu krvnih žila tumora pružajući procjenu integriranog lumena i, pretpostavlja se, protok krvi ortogonalna na dio tumora. D-MVA smanjen u miR-338 prekomjerno tumora. Na naše iznenađenje, otkrili smo da NRP1-pojačana ekspresija tumori nisu značajno pokazuju povećanu angiogenezu, no smanjenje u D-MVA zbog Mir-338 prekomjernom ekspresijom je obnovljena u tumorima koji prekomjerno NRP1 (slika 6f, i 6 g). Mi nagađaju da NRP1 izraz već reguliran u rak želuca, pa nadalje hipereksprimirani NRP1 ne može značajno povećati tumora krvožilje ali može vratiti tumora krvožilje koji je umanjen za Mir-338. Ovi rezultati pokazuju da Mir-338 smanjuje rast tumora i smanjuje D-MVA ciljajući NRP1 in vivo. Pregled}

Rasprava pregled

Korištenje genskih čipova i bioinformatika, predviđa se da će ciljana Mirna od NRP1 je miR -338. Istraživanje je pokazalo da je ekspresija Mir-338 varira u različitim tumorima. Huang XH i sur. pokazala je da Mir-338-3p potisnut invaziju stanica raka jetre ciljajući zaglađena [20]. Osim toga, u melanome, miR-193.a miR-338 i miR-565 da se pokazalo da underexpressed u bolesnika s BRAF mutacija [21]. Iz tih podataka, zaključuje se da je miR-338 mogu djelovati kao tumor-supresor. Nema objavljenih znanstvenih radova u vezi bilo Mir-338 je underexpressed kod raka želuca. U našoj studiji, razina ekspresije Mir-338 prvi je mjerena u 41 ljudskih uzoraka rak želuca i 24 uzoraka susjednih normalnoj sluznici tkiva. Mi smo tada procijenjena na ekspresiju Mir-338 u pet želučanih staničnim linijama karcinoma iu normalnoj sluznici staničnim linijama želuca. Otkrili smo da je ekspresija Mir-338 je dolje regulirano u oba tumorskih tkiva i stanične linije raka. Štoviše, hipereksprimirani miR-338 može inhibirati želučano migraciju stanica raka, invaziju i proliferaciju i promiču apoptozu. U međuvremenu, oni tumorogenih osobine mogu biti potpuno obnovljena od strane NRP1 prekomjernom ekspresijom. Osim toga, reporter analize luciferaze sugerira da miR-338 ciljevi NRP1 izravno. Dakle, možemo zaključiti da je Mir-338 djeluje kao potencijalni supresor tumora kod raka želuca, funkciju koja se postiže suzbijanju izražavanje NRP1.

Kao ne-tirozin-kinaze receptora, NRP1 može umjereno povećanje izraz fosforilaciju ERK1 /2, Akt i p38MAPK. M Akagi et al. nađeno je da inhibicija NRP-1 smanjuje ekspresiju fosforilaciju ERK1 /2, Akt i p38MAPK [22]. Osim toga, istraživanje je pokazalo da je izraz ERK1 /2 fosforilacije viša u NRP-1-s prekomjernom ekspresijom stanice [23]. U ovom istraživanju, otkrili smo da hipereksprimirani Mir-338 može smanjiti ekspresiju fosforilacije ERK1 /2, Akt i p38MAPK, učinak je bio obrnut na NRP1 obnove. Aktivacija ERK, Akt i p38MAPK zajedno s preživljavanje apoptoza rezistencija /stanica je dobro dokumentirano u različitim modelnim sustavima [24], [25], [26].