PLOS ONE: microARN-137 Contribue à antivibratoires tumorigenèse dans le cancer gastrique humain par ciblage AKT2

Résumé

MiRNAs jouent un rôle important dans la tumorigenèse. Cette étude a porté sur l'exploration des effets et de la réglementation mécanisme de miARN-137 sur les comportements biologiques du cancer gastrique. L'ARN total a été extrait à partir de tissus de 100 patients atteints d'un cancer gastrique à partir de quatre lignées cellulaires de cancer gastrique. L'expression de miR-137 a été détectée par PCR en temps réel à partir de 100 patients. Les effets de la surexpression de miR-137 sur la prolifération, l'apoptose, la migration et l'invasion de la capacité de cellules de cancer gastrique ont été étudiés in vitro et in vivo. Le gène cible de miR-137 a été prédit par Targetscan logiciel en ligne, projeté par une double analyse du gène rapporteur de la luciférase et démontré par Western Blot. Par conséquent, l'expression de miR-137 a été significative réduite dans l'estomac lignée cellulaire de cancer HGC-27, HGC-803, CGS-7901 et MKN-45, ainsi que dans les tissus de cancer gastrique par rapport aux GES-1 cellulaire ou adapté non adjacents tissus -neoplastic ( p
< 0,001). La réintroduction de miR-137 dans des cellules de cancer gastrique est capable d'inhiber la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion. Les expériences in vivo ont démontré que la surexpression de miR-137 peut réduire la prolifération cellulaire du cancer de l'estomac et les métastases. Bioinformatiques et une analyse par transfert Western ont indiqué que le miR-137 a agi comme un rôle suppresseurs de tumeurs sur les cellules cancéreuses gastriques par le ciblage AKT2 et affectant en outre la GSK-3β et Bad. En conclusion, le miR-137 qui est souvent régulé à la baisse dans le cancer gastrique est potentiellement impliqués dans la tumorigenèse du cancer gastrique et la métastase en régulant les voies de signalisation AKT2 liés

Citation:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, Yang W, et al. (2015) microARN-137 Contribue à antivibratoires tumorigenèse dans le cancer gastrique humain par ciblage AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10.1371 /journal.pone.0130124

Academic Editor: Irina V. Lebedeva, Université de Columbia, ÉTATS-UNIS

Reçu 15 Août 2014; Accepté: 18 mai 2015; Publié le 23 Juin, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Wu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:.. Ce travail a été soutenu par des projets de la science médicale et de la technologie de recherche de la province du Henan, en Chine (2011030004)

intérêts concurrents: les auteurs ont a déclaré qu'il n'y a pas des intérêts divergents existent.

le cancer gastrique introduction (GC) est la deuxième cause fréquente de décès par cancer dans le monde [1]. Jusqu'à présent, le mécanisme de la carcinogenèse gastrique est largement inconnue. Les chercheurs ont tenté d'étudier GC du point de vue de la biochimie et la biologie moléculaire que certains gènes suppresseurs de tumeur et des gènes liés à la tumeur ont été rapportés dans GC. Les microARN (miARN) sont de manière endogène petits ARN non codantes de 18 ~ 22 nucléotides qui ont été identifiés en tant que régulateurs post-transcriptionnels de l'expression génique [2, 3]. MiRNAs jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques tels que la prolifération, le développement, la différenciation et l'apoptose. Pendant ce temps, les miARN ont été validés pour agir comme oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs au cours de la tumorigenèse. Par exemple, miR-31 a été identifié comme un oncogène dans l'œsophage épithélioma spinocellulaire [4] et miR-451 fonctionne comme un suppresseur de tumeur non à petites cancer humain du poumon [5]. Il y a aussi beaucoup microARN ont été identifiés en rapport avec le cancer gastrique passe et le développement [6-13]. Il a également été rapporté que la surexpression de miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a et miR-423-5p peuvent être utilisés comme critères de diagnostic du cancer gastrique [14] .Par conséquent, les miRNAs sont des possibilités candidats de biomarqueurs diagnostiques nouveaux ou cibles thérapeutiques du cancer de l'estomac.

microARN-137 (miR-137) a été signalé à être régulé à la baisse et jouer un rôle comme un suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal et le cancer buccal [15, 16]. Cependant, la fonction de miR-137 et son mécanisme carcinogenèse gastrique sous-jacent ne sont pas encore très clair. Chen et al a révélé que le miR-137 peut pièces comme un suppresseur de tumeur en ciblant CDC42 pour réguler le cycle cellulaire dans le cancer gastrique [17]. Même ainsi, il est clair pour nous que la microRNA réglemente les comportements biologiques par voie de chemin multiple qu'il pourrait y avoir plus de mécanisme de régulation de miR-137 en direction de GC tumorigenèse. Dans cette étude, nous avons mesuré l'expression de miR-137 dans 100 patients atteints de cancer gastrique et étudié les rôles de miR-137 dans les cellules de cancer gastrique. Nous avons trouvé d'autres fonctions de miR-137 en GC, ainsi que d'une autre manière de chemin par lequel miR-137 a joué un rôle de suppresseur de tumeur dans GC tumorigenèse.

Déclaration éthique Matériaux et méthodes

Toutes les études humaines ont été approuvés par le comité d'éthique appropriées et ont donc été réalisées en conformité avec les normes éthiques. Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé avant leur inclusion dans l'étude.

Patients et spécimens

échantillons de cancer gastrique humain ont été recueillies à partir de prélèvements chirurgicaux de 100 patients (56 hommes, femmes 44) avec GC à l'Institut et hôpital du cancer, premier hôpital affilié de l'Université du Henan; le deuxième hôpital de l'Armée de libération populaire de Chine; Hôpital Hebei cancer. Les échantillons non tumorales à partir de la marge tumorale macroscopique ont été isolés en même temps et utilisés en tant que tissus non néoplasiques adjacents appariés. Tous les échantillons ont été divisés en deux parties. Des échantillons de tissu ont été prélevés immédiatement congelés rapidement dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN. L'utilisation des échantillons de tissus pour toutes les expériences a été approuvé par le comité d'éthique de l'Institut des sciences médicales de base, l'Académie chinoise des sciences médicales. Tous les participants ont donné leur consentement verbal éclairé à participer à cette étude, et leur consentement verbal informés ont été écrites. Ce processus a également été approuvé e consentement par le comité d'éthique. Quatre lignées cellulaires de cancer gastrique (HGC-27, CGS-7901, CGS-7901 et MKN-45) ont tous été conservés dans notre laboratoire et entretenues dans du milieu DMEM ou 1640 avec 10% de FBS.

Extraction de l'ARN, la synthèse d'ADNc et des essais de PCR en temps réel

ARN total provenant de tissus et de cellules a été extrait par la méthode Trizol (Ambion, Etats-Unis) complètement suivant les instructions. Un seul brin d'ADNc a été synthétisé par M-MLV (Ambion, Etats-Unis) en utilisant 2 ug d'ARN total comme matrice. Oligo (dT) 18 a été utilisé pour l'ARNm de transcription inverse en boucle de la tige utilisée pour miARN. time-PCR réel (RT-PCR) a été réalisée par Bio-rad CFX96 (Bio-rad, USA) en utilisant SYBR mix (Tiangen, Chine). La condition de PCR était: 95 ° C × 30s, suivi de 40 cycles de 95 ° C × 5s, 60 ° C × 34s. Pour ARNm, GAPDH a été utilisé comme témoin normalisé. Pour miARN, U6 snRNA a été utilisé pour le contrôle des miARN. L'expression relative de miR-137 a été calculé par la méthode 2-ΔΔCT. Les séquences des amorces sont présentées dans le tableau 1.

Construction du plasmide

La séquence miR-137 précurseur généré par recuit et miR-137-précurseur-F et miR-137-R-précurseur de l'extension est quant à lui digéré par Bam HI et Bgl II, dont les produits se insère dans le fragment BamHI-BglII du vecteur pcDNA-GW /EmGFP-miR (GenePharma, Chine). En attendant, le contrôle négatif a également été construit.

Culture cellulaire et transfection miRNA

Les lignées cellulaires HGC-27, SGC-7901 MKN-45 et GES-1 a été acheté à partir de la ressource cellulaire Centre de l'Institut des sciences médicales de base, l'Académie chinoise des sciences médicales et de Peking Union Medical College (Beijing, Chine). Les lignées de cellules gastriques humaines HGC-27, SGC-7901 et MKN-45 ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, BRL, Royaume-Uni) des milieux supplémentés avec du sérum 10% fœtal bovin et la lignée cellulaire de l'épithélium gastrique humaine GES-1 a été maintenu en DMEM ( Gibco, BRL, Royaume-Uni) médias. Le miR-137 synoptique et que scramble qui est non homologue au génome humain ont été synthétisés par GenePharma (Shanghai, Chine) et transfectées dans les cellules à une concentration d'oligonucléotide final de 10nmol /L. Toutes les transfections cellulaires ont été introduites par DharmaFECT1 Réactif (Dharmacon, TX, USA) selon les instructions utilisées par le fabricant. Pour chaque transfection cellulaire deux ou trois expériences de replication ont été effectuées.

prolifération cellulaire et l'apoptose dosage

La prolifération cellulaire a été réalisée par dosage CCK8 procédé (DOJINDO, Japon). En bref, les environ 5000 miR-137 cellules transfectées mimiques et les cellules ont été embrouillage respectivement ensemencées dans des plaques à 96 puits et mises en culture. Les taux de prolifération ont été déterminées à 0, 12, 24, 48, 72, 96 heures après la transfection en ajoutant 10 pl CCK8 régente et testé selon les manuscrits. Les analyses de l'apoptose ont été testés dans HGC-27 et SGC-7901 lignées cellulaires avec ou sans miR-137 surexpression par kit de détection Apoptose I (BD Biosciences, USA) et C6 cytomètre de flux (Etats-Unis).

migration cellulaire et essais d'invasion

Nous avons effectué le test de cicatrisation pour tester la capacité de migration des cellules avec ou sans miR-137 transfection. Les plaies artificielles ont été produites sur la monocouche cellulaire confluente avec du FBS libre, en utilisant un embout de pipette de 200 pi à 24 heures après la transfection miR-137. Les images ont été prises respectivement à 0, 12, 24 et 36 heures après la création de la plaie.

Nous avons ensuite effectué Transwell tests pour évaluer la capacité d'invasion des cellules. 5 × 10 ^{4 cellules en suspension dans 200 ul de milieu sans FBS ont été placés sur la chambre supérieure de chaque insert avec 430μl de 1 mg /ml matrigel (Millipore, USA). moyen 600μl avec 10% de FBS comme attractant nutritionnel a été mis dans la chambre inférieure. Au bout de 24 heures, les cellules fixées à la surface inférieure de la chambre étaient fi xé 20 min de 20% de methanol et colorées pendant 10 minutes avec 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Les membranes d'invasion ont ensuite été coupés et noyés sous des lamelles. Nous avons compté les cellules dans 3 domaines différents vision fi en état avec 20 × magni fi cation qui ont ensuite été utilisé comme le nombre moyen de cellules. Tous les essais ont été réalisés dans trois expériences indépendantes.}

expérience
animale

Les expériences impliquant des animaux ont été effectuées selon le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et les directives éthiques institutionnelles pour l'expérimentation animale. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l'éthique de l'expérimentation animale de la CAMS (Académie chinoise des sciences médicales) (numéro de permis: C72-14-0664). Toute chirurgie a été réalisée sous anesthésie pentobarbital de sodium, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Scramble transfectées et miR-137 surexpression HGC-27 cellules (5 x 10 ^{6 cellules) ont été inoculés s.c. dans les flancs dorsaux de souris BALB /c nu (femelle, Nu /Nu, 6 semaines), qui ont tous été achetés auprès du Centre des animaux de l'Université du Henan et a grandi dans des conditions exemptes d'agents pathogènes. Le volume de la tumeur a été mesurée pendant 5 semaines. Toutes les souris ont été tuées et s.c. Les tumeurs ont été réséquées et le poids des tumeurs a été testée. Pour les expériences in vivo de métastases, HGC-27 cellules ont été recueillies 24 heures après transfection. Le dosage de la viabilité des cellules a été réalisée en utilisant un dosage XTT kit24 heure après transfection selon les instructions du fabricant (Roche, Tokyo, Japon). Ensuite, les souris (femelle, Nu /Nu, âgées de 6 semaines) ont été injectées avec des cellules HGC-27, avec ou sans miR-137 surexpression par la veine caudale de 2 x 10 5 cellules dans du PBS. Les cellules HGC-27 ont été modifiés de manière stable qui peut exprimer la luciférase (construit par Genechem, Shanghai, Chine). Les cellules ont été vérifiées par microscope pour faire en sorte que les cellules étaient en bon état. Au bout de six semaines, l'imagerie par bioluminescence a été réalisée en utilisant un spectre IVIS et de l'image radiance valeurs ont été normalisées en utilisant Living image (Caliper Life Science, États-Unis).}

immunohistochimie

tissus ont été intégrés dans des coupes en paraffine et traité 2 heures à 65 ° C puis déparaffinées. Avant d'appliquer les anticorps primaires à 4 ° C pendant une nuit, nous avons procédé à l'étape d'extraction de l'antigène. Après cela, les lames ont été incubées avec un anticorps secondaire d'environ 2 heures à 25 ° C conjugué à la HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Chine). Le Liquid DAB + Substrate (zsgb-bio, Chine) a été utilisé pour la détection de l'activité HRP.

luciférase miRNA cible journaliste test

La longueur des 3'UTRs d'ARNm de Akt2 humains étaient chaque amplifié par PCR et clone dans le PMIR-REPORTTM Luciferase Reporter Vector (Ambion, USA) pour générer les journalistes. Les mutations des régions de germes prédits dans les séquences d'ARNm ont été créées en utilisant des amorces incluant les sites mutés. cellules HEK-293T ont été ensemencées sur des plaques à 24 puits (1 x 10 ^{5 cellules par puits) la veille transfections ont été effectuées. Les cellules (~ 70% confluentes) ont été transfectées avec pRL- TK reporters de luciférase (50 ng /puits), la luciférase PGL-3firefly (10 ng /puits), et synoptique 137 (50 nmol /L, GenePharma, Shanghai, Chine) ou scramble (50 nmol /l) en utilisant Lipofectamine 2000 activités (Invitrogen) .Luciferase ont été mesurés à l'aide du double luciférase Reporter Assay (Promega, USA).}

Western blot

les protéines ont été séparés sur 10% SDS-PAGE et ensuite transférée à 0,45 um membranes de PVDF (Amersham, UK). Les membranes ont été incubées avec 5% de poudre de lait écrémé jusqu'au lendemain à 4 ° C et avec un anticorps monoclonal anti-AKT2 (Proteintech, USA) à dilution 1: 1000; anti-Bad anticorps monoclonal (Bioworld, États-Unis) à 1: 500 dilution; anti-GSK-3B d'anticorps polyclonaux (Bioworld, USA) à dilution 1: 1000; anticorps anti-GAPDH (Proteintech, Chicago, États-Unis) à 1: 30.000 dilution. Après deux lavages avec du TBST, les membranes ont été incubées avec un anticorps de chèvre anti-lapin (zsgb-bio, Chine) à 1: 5000 et 1:. 50000 dilutions pendant 2 h

Statistiques

Chaque expérience a été répétée au moins trois fois. test t de Student (bilatéral) et x ^{Test 2 ont été réalisées, et le niveau statistiquement significatif a été fixé à α = 0,05 à deux faces). Moyenne ± SD est affiché dans les figures.}

Les de

Résultats miR-137 est régulée à la baisse dans les cellules de cancer gastrique et des échantillons cliniques

Nous avons examiné d'abord l'expression de maturité miR -137 en 4 lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 et MKN-45) et gastriques cellules épithéliales (GES-1). Ces lignées cellulaires présentent GC extraordinairement faible expression de miR-137 par rapport à la lignée cellulaire GES-1 (figure 1A). Pour étudier davantage la relation de miR-137 avec GC occurrence, nous avons détecté l'expression de miR-137 dans 100 patients cliniques (mâle 56, femelle 44; âge moyen 53 ans) par Taqman sonde drived PCR en temps réel, comme décrit ci-dessus. Sur 100 échantillons de GC, l'expression de miR-137 a été régulée à la baisse dans 77 cas (77%) par rapport aux tissus adjacents lorsque l'arrêt de coupe a été mis en place 1,5. Pendant ce temps, miR-137 a été régulée à la hausse dans 23 cas (23%) (figure 1B et 1C). En général, l'expression de miR-137 dans les tissus du GC était inférieure à celle dans les tissus adjacents dans des différences statistiquement significatives (p = 0,00079, test t apparié, deux tailed, figure 1C). En outre, nous avons trouvé une association statistiquement significative entre l'expression de miR-137 et le cancer gastrique au stade clinique. Les patients qui ont des niveaux inférieurs d'expression miR-137 ont été associés à de haute qualité et un stade tardif de tumeurs (figure 1D). Ces résultats indiquent que les altérations de miR-137 pourraient être impliqués dans la progression du cancer de l'estomac.

miR-137 inhibe la prolifération cellulaire in vitro et in vivo

Nous transfecté miR-137 imiter dans des lignées cellulaires de GC HGC-27 et SGC-7901, dont les deux ont montré une grande efficacité de transfection (figure 2A). Les résultats des essais de croissance de la CCK8 à 0, 1, 2, 3 et 4 jours après miR-137 et bousculade transfection sont représentés sur la figure 2B. Par rapport à scramble la transfection, miR-137 transfection a considérablement réduit la prolifération de deux lignées cellulaires (figure 2B). Ensuite, nous avons étudié l'effet de miR-137 sur l'apoptose des cellules. Les cellules apoptotiques précoces dans le groupe d'embrouillage était d'environ 10% en HGC-27 et 2,9% SGC-7901, alors qu'après miR-137 transfection, le pourcentage de cellules apoptotiques précoces a été augmentée à 17,5% en HGC-27 et 8,3% en SGC-7901, qui a montré de manière significative la différence (figure 2C). A partir de ces résultats, on peut conclure que miR-137 pourrait supprimer la survie des cellules de cancer du poumon en induisant l'apoptose précoce.

pour vérifier les résultats ci-dessus, un modèle in vivo a été construit. Nous avons constaté que la croissance tumorale a été significativement plus lente chez les souris surexpression de miR-137 par rapport aux témoins (figure 2D, 2E et 2G). En accord avec la courbe de croissance de la tumeur, les poids des tumeurs induites par des cellules de brouillage ont été significativement plus élevée que celle de la surexpression de miR-137 (figure 2F). Ces résultats ont également confirmé que la surexpression de miR-137 pourrait limiter la prolifération gastrique des cellules cancéreuses in vivo.

miR-137 inhibe la migration cellulaire et l'invasion in vitro et in vivo

Nous avons également évalué les effets de de miR-137 sur la migration et l'invasion cellulaire, qui étaient les principaux déterminants de la progression maligne et les métastases. Les effets de miR-137 sur la migration des cellules ont été mises en évidence par une analyse cicatrisation de la plaie /scratch en HGC-27 et les cellules SGC-7901. Les deux de deux lignées de cellules traitées avec miR-137 mimique étaient typiquement moins migratoire que le contrôle scramble ou des cellules non traitées à 12, 24, et 36 heures après grattage (figure 3A). De plus, nous avons mené essai de l'invasion des cellules pour mesurer les capacités d'invasion directionnelles des cellules après miR-137 surexpression. En conséquence, l'invasivité des cellules transfectées avec miR-137 mimique a considérablement diminué par rapport aux cellules de brouillage dans HGC-27 et SGC-7901 (figure 3B). Ensuite, des expériences in vivo ont été utilisées pour vérifier encore ce résultat. Nous avons tout d'abord montré que les cellules transfectées avec miR-137 contrôle mimétique ou imitateur n'a pas montré une diminution significative de la viabilité des cellules par rapport aux cellules non traitées. En outre, il n'y a pas de différence dans la viabilité cellulaire entre les cellules transfectées avec miR-137 mimétique par rapport au contrôle négatif (S2 Fig). Comme cela est représenté sur la figure 3C, l'imagerie bioluminescente de souris dans le groupe surexpression de miR-137 a montré une image beaucoup plus petite. En outre, le nombre de métastases pulmonaires par des souris dans le groupe miR-137 a montré un niveau nettement inférieur par rapport au groupe de brouillage, ce qui indique que le miR-137 pourrait supprimer la métastase in vivo. Ces résultats ont démontré que miR-137 a joué un rôle important dans la régulation de la migration cellulaire et l'invasivité dans le cancer gastrique et a suggéré que la régulation négative de miR-137 pourrait contribuer à la métastase de la tumeur dans la carcinogenèse gastrique.

miR-137 cible les AKT2 GC

MiRNAs effectuées fonctions biologiques en régulant négativement leurs gènes cibles. Comme prévu, il y avait complémentarité entre a-miR-137 et AKT2 3'-UTR (figure 4A).

Pour tester l'hypothèse selon laquelle AKT2 pourrait être une cible de miR-137, un plasmide rapporteur abritait l'état sauvage -type région 3 'UTR de AKT2 en aval de la région codant pour la luciférase (figure 4A, AKT2_WT) a été construit. cellules HEK-293T ont été cotransfectées avec le plasmide rapporteur (AKT2_WT) et bousculade. Par conséquent, miR-137 cellules transfectées ont montré une réduction marquée (≈58%) de l'activité de la luciférase (figure 4B). Puis, le même test a été réalisé pour un autre plasmide rapporteur contenant AKT2 muté 3'-UTR dans des sites de liaison miR-137. Comme prévu, l'inhibition de l'activité de la luciférase par miR-137 a été partiellement enlevé avec un site de liaison 1 ou la liaison cite 2 mutant et presque aboli dans le AKT2_MUT double mutant, ce qui suggère que la région conservée était entièrement responsable de miR-137 fonction (figure 4B) .

Pour approfondir l'interaction entre miR-137 et AKT2, HGC-27 et les cellules SGC-7901 ont été transfectées avec miR-137. l'expression de l'ARNm AKT2 a été déterminée par PCR en temps réel. Aucune différence significative n'a été observée entre miR-137-traité et scramble-traités ou HGC-27 et SGC-7901 cellules non traitées (figure 4C). Ensuite, l'analyse western blot a été réalisée pour mesurer le niveau de la protéine AKT2. Nous avons constaté que l'expression de la protéine AKT2 est en baisse réglementée dans miR-137 traités HGC-27 et SGC-7901 cellules, mais pas dans les cellules non traitées ou scramble (figure 4D). Ces données suggèrent que miR-137 reconnaît directement l'extrémité 3 'UTR de l'ARNm et AKT2 inhibe la traduction de AKT2. Ainsi, régulée vers le bas miR-137 dans le cancer gastrique inhibe la suppression de AKT2, qui à son tour décélérer tumorigenèse.

AKT2 est un membre de la famille AKT. Nous détectons encore ses effecteurs en aval Bad et GSK-B. Par conséquent, le p-Bad et le p-GSK-B était évidemment régulés à la baisse miR-137 dans le traitement HGC-27 et les cellules CGT-7901 par rapport aux cellules de brouillage traitées ou non traitées. Aucun changement significatif n'a été trouvée dans Bad non phosphorylée ou GSK (Fig 4E). Ces résultats suggèrent que la croissance des cellules du cancer gastrique accélérée est due en partie aux voies Akt over-ACTIVÉE. Outre la promotion de la prolifération cellulaire, actived Akt pourrait également phosphoryler Bad à Ser112 et Ser136, bloquant la mort cellulaire induite par Bad-. En l'absence de phosphorylation au niveau de ces sites, Bad est supposé interagir avec Bcl-xl pour induire la mort cellulaire. En revanche, l'hyperphosphorylation de Akt induite par de Bad peut favoriser la survie cellulaire dans les cellules cancéreuses. Nos résultats de Western blot a confirmé la spéculation ci-dessus que le changement des activités cellulaires de cancer gastrique dans un état de cellules miR-137 transfectées pourrait être le résultat d'une diminution de la phosphorylation de Bad. En outre, nous avons analysé les niveaux de protéines de AKT2 dans 12 GC patientsPour qui miR-137 a été régulée à la baisse. Parmi ces échantillons, AKT2 était régulée in9patientsin leurs tissus GC (figure 4F).

La restauration de AKT2 plombée à une activation de l'invasion et une suppression de l'apoptose

Afin de démontrer davantage les rôles de miR-137 et AKT2 joué durant la tumorigenèse, nous avons étudié l'effet de la restauration de AKT2 dans miR-137 cellules transfectées. Le Western Blot a montré que le taux de protéine dans AKT2 AKT2 échantillon de surexpression était apparemment plus élevée que celle du témoin négatif, même dans la suppression de miR-137. La restauration de AKT2 plombée à une activation de l'invasion et une suppression de l'apoptose (figure 5).

Discussion

miARN ont été fréquemment indiqué être souvent dérégulée dans les cancers humains divers et certains miARN a même été utilisé employé en tant que cibles thérapeutiques du cancer. Les recherches se rapportant à la relation entre les miARN et les cancers pourraient nous aider à la compréhension du cancer.

Il n'y a que peu de recherches se rapportant au rôle miR-137 joué dans le cancer gastrique. Il a été rapporté que le miR-137 est un régulateur négatif de Cdc42 et de ciblage qui induisant l'apoptose et le cycle cellulaire G1 arrêt dans les cellules cancéreuses gastriques [17]. Cependant, l'effet de la réglementation des microARN dans le cancer est assez compliqué. Il semble impossible que le miR-137 régule le cancer de l'estomac par la voie unique. Dans cette recherche, la fonction et le mécanisme que miR-137 réglementé cancer gastrique a été étudiée plus.

Tout d'abord, nous avons détecté l'expression de miR-137 dans 100 patients et a constaté que l'expression de miR-137 est en forte baisse régulés dans l'échantillon de cancer. En outre, nous avons trouvé une association statistiquement significative entre l'expression de miR-137 et le cancer gastrique au stade clinique. Ces résultats indiquent que les altérations de miR-137 pourraient être impliqués dans la progression du cancer gastrique. Nous avons essayé de trouver la relation entre miR-137 et patients 'âge et le sexe, mais aucun résultat statistique n'a été trouvée. Comme la présente étude a révélé que l'expression de miR-137 a été régulée à la baisse dans la plupart des tissus du GC par rapport aux tissus adjacents (77%), nous pourrions envisager sur le diagnostic et l'utilisation pronostique de miR-137. En outre la validation dans des études prospectives est justifiée et les sources des échantillons plus accessibles, tels que les exosomes dérivés de tumeur miR-137 enrichi à partir du sang, doit être étudiée. En outre, il convient de noter que dans une certaine mesure la valeur coupé (coupé = 1,5), nous avons choisi pourrait être encore arbitraire. Quand il a été fixé plus haut, il pourrait y avoir moins de patients avec miR-137 réglementés vers le bas dans les tissus cancéreux. Cependant, même dans cet état, il y avait environ 23% des cancers ont une expression élevée miR-137. Cela peut être dû à la différence individuelle chez les patients que certains individus peuvent avoir des motifs d'expression des gènes au cours tumorigenèse ou cancer progression.

Comme l'expression de miR-137 dans les tissus du GC était inférieure à celle dans les tissus adjacents des différences statistiquement significatives (p = 0,00079), on peut supposer que cette caractéristique d'expression a été associée au développement du cancer. Cette spéculation a été confirmé par in vitro et in vivo que le miR-137 peut réguler négativement la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion. Le niveau d'expression de miR-137 peut continuer à un niveau élevé pendant une longue période après la transfection à la fois dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, les tumeurs de xénogreffes en phase terminale et localisation inmetastatic dans les poumons (S1A Fig-S1C Fig). Cependant, le procédé de la surexpression conduit à des niveaux d'expression très élevés de miR-137 (figure 2A). Ce niveau élevé de miR-137 peut entraîner des effets supplémentaires. Par exemple, miR-137 est un régulateur négatif de Cdc42 et de ciblage qui induisant l'apoptose et le cycle cellulaire G1 arrêt dans les cellules cancéreuses gastriques [17]. Comme le miR-137 dans notre étude a été régulée à la hausse des milliers de fois, il peut conduire à l'inhibition d'autres cibles telles que Cdc42. Il est évident que, dans cette étude, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que les effets suppresseurs de tumeur de miR-137 a été véhiculée par la suppression d'autres gènes cibles.

Ensuite, nous avons découvert que miR-137 agit comme un gène suppresseur de tumeur par le biais AKT2 ciblage , qui est un membre de la famille AKT. La restauration de AKT2 provoque la régulation d'AKT2 dans miR-137 cellules transfectées, ce qui est beaucoup plus élevé que dans bousculade. Cela peut être dû à ce que la surexpression de AKT2 inversé le niveau de protéine miR-137 supprimé. Plus important encore, la restauration de l'AKT2 régule l'apoptose et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques, ce qui conduit à une activation d'une invasion et une suppression de l'apoptose (figure 5). Cette expérience de sauvetage fournit une preuve supplémentaire que le miR-137 apoptose cellulaire active et régulent négativement l'invasion cellulaire en ciblant AKT2. Expériences in vivo ont également démontré que l'expression de miR-137 est négative par rapport à l'expression de AKT2 (S1D Fig et S1E Fig). AKT est un facteur crucial de la PI3K /AKT chemin chemin. La régulation à la baisse de AKT2 affecte en outre sa protéine en aval Bad et GSK-3B, que le p-Bad et p-GSK-B était évidemment réglementée vers le bas. Bad peut jouer ses «rôles par phosphorylation et encore réglé le sort des cellules [18]. GSK-3B, qui est également connu sous le nom de GSK-3β habituellement, contrôle l'immigration et l'invasion cellulaire. En conclusion, nous avons identifié un lien entre miR-137 et AKT2 qui est un roman constitutif de la tumorigenèse du cancer gastrique. Le miR-137 a été démontré être liée à la réglementation AKT2 [19]. Dans le carcinome hépatocellulaire, miR-137 inhibe la croissance des cellules cancéreuses et les métastases via le ciblage directement AKT2 [20]. En fait, nous e ont examiné 8 gènes comme cibles potentielles de miR-137 (S1 Table). Cependant, le AKT2 est la seule cible directe de miR-137 après analyse du gène rapporteur double luciférase et enquête western blot. De la figure 4D, nous pouvons trouver thatmiR-137 peut affecter la AKT2 et p-AKT2in deux cellules HGC-27 et SGC-7901. Mais il est intéressant, dans le SGC-7901 l'état de phosphorylation a été apparemment touché plus. Ce phénomène peut être constamment observée dans les trois taches répétées que nous avons effectués. Nous déduit qu'il pourrait y avoir en raison de la propriété particulière des cellules cancéreuses différentes. Il pourrait y avoir moyen de chemin de régulation spécifique de miR-137 dans le SGC-7901 qui réprimait l'état de phosphorylation de AKT2.However, de la présente recherche, nous ne pouvons pas expliquer pleinement ce mécanisme. Lorsque nous avons choisi les patients qui ont une faible expression de miR-137 dans leurs tissus de GC pour détecter l'expression de la protéine AKT2, nous avons trouvé que la plupart de ces patients (9/12) ont un niveau élevé de AKT2 dans leurs tissus de GC. Ce résultat suggère que le miR-137 pourrait cibler AKT2 chez les patients. Il y avait aussi trois patients qui ont une faible expression de AKT2 dans les tissus GC si l'expression de miR-137 est faible. Ce résultat peut être dû à la différence individuelle chez les patients.

En conclusion, notre expression et études fonctionnelles ont suggéré que le miR-137 est souvent régulé à la baisse dans le cancer gastrique peut agir comme un suppresseur de tumeur dans les cellules du GC, réintroduisant dont l'expression sur des cellules GC supprime la prolifération des cellules du cancer de l'estomac, de la migration et de l'invasion, en ciblant directement AKT2. Ainsi, nos œuvres est un bon complément à l'œuvre précédente et est utile pour nous de comprendre le mécanisme de régulation miR-137 dans le cancer.

Informations complémentaires
S1 Fig. miR-137 et de l'expression de AKT2 après transfection.
A. expression miR-137 en HGC-27 et des cellules SGC-7901 72 h après transfection. expression B. miR-137 dans les tumeurs de xénogreffes en phase terminale. expression C. miR-137 dans la localisation métastatique des souris poumons. expression D. AKT2 dans la localisation métastatique des souris poumons. Nous avons mélangé les cinq poumons ensemble dans le même groupe. expression E. AKT2 dans la localisation métastatique des souris poumons. Nous avons détecté respectivement l'expression de la protéine Akt2 dans chaque souris. 30 pg de protéine totale a été utilisée pour chaque échantillon
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 Fig. viabilité cellulaire test avant l'expérience de métastases
test de viabilité cellulaire a été effectuée 24 heures après la transfection
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0130124.s002
(TIF)
S3 Fig. analyse Adensitometric de la figure 4E
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s003
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Tableau S1. . gènes cibles potentielles de miR-137
Les gènes cibles potentielles de miR-137 ont été prédit par le logiciel en ligne et détectée par double luciférase dosage du gène rapporteur et bloting ouest
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124. S004
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Les auteurs remercient le Dr Remerciements Chengyuan Feng de l'hôpital du cancer, académie chinoise des sciences médicales pour l'assistance technique et l'article révision.

• PLOS ONE: Identification et caractérisation de CXCR4-positive cancer gastrique souches Cells
• PLOS ONE: Les microARN-217 Fonctionne comme un suppresseur de tumeur potentielle dans le cancer gastrique par ciblage GPC5