PLOS ONE: Importance Prognostic de miR-181b et miR-21 dans l'estomac des patients cancéreux traités par S-1 /oxaliplatine ou doxifluridine /oxaliplatine

Résumé

Contexte

Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité du S-1 /oxaliplatine vs doxifluridine /oxaliplatine régime et d'identifier les miARN comme biomarqueurs pronostiques potentiels dans le cancer gastrique les patients. L'expression des miARN candidats a été quantifiée 50-5 stade tardif gastriques échantillons FFPE du cancer

patients atteints de cancer gastrique Expérimentale design avec KPS >. 70 ont été recrutés pour l'essai. Le groupe témoin a été traité avec 400 mg /deux fois /jour doxifluridine plus i.v..
Avec oxaliplatine à 130 mg /m ^{2 /premier cycle jour /4 semaines. Le groupe de test a été traité avec S-1 à 40 mg /deux fois /jour /semaine 4 cycles plus i.v..
Avec oxaliplatine à 130 mg /m 2 /premier cycle jour /4 semaines. Les ARN totaux ont été extraits à partir des échantillons normaux et tumoraux gastriques. Les niveaux de miARN ont été quantifiés à l'aide en temps réel qRT-PCR analyse de l'expression.}

Le taux de réponse objectif global (CR + PR) des patients traités par S-1 /oxaliplatine était de 33,3%

Résultats (CR + PR) vs 17,6% de. (CR + PR) avec doxifluridine /oxaliplatine pour les patients atteints de cancer gastrique de stade avancé. La survie globale moyenne pour les patients traités avec S-1 /oxaliplatine était 7,80 mois contre 7,30 mois chez les patients traités avec doxifluridine /oxaliplatine. L'expression de miR-181b ( P
= 0,022) et miR-21 ( P
= 0,0029) a été significativement surexprimée dans les tumeurs gastriques par rapport aux tissus gastriques normaux. Kaplan-Meier analyse de survie a révélé que de faibles niveaux de miR-21 expression (Log rank test, rapport de risque: 0,17, IC = 0,06 à 0,45; P
= 0,0004) et miR-181b (Log rank test, danger rapport:. 0,37, IC = 0,16 à 0,87; P
= 0,018) sont étroitement associés à la survie globale des patients pour mieux les deux schémas S-1 et doxifluridine basé

Conclusion

les patients traités avec S-1 /oxaliplatine avaient une meilleure réponse que ceux traités avec doxifluridine /oxaliplatine. miR-21 et miR-181b ont un grand potentiel en tant que biomarqueurs pronostiques dans le cancer gastrique de stade tardif

Citation:. Jiang J, Zheng X, Xu X, Zhou Q, Yan H, Zhang X, et al. (2011) Importance Prognostic de miR-181b et miR-21 dans l'estomac des patients cancéreux traités par S-1 /oxaliplatine ou doxifluridine /oxaliplatine. PLoS ONE 6 (8): e23271. doi: 10.1371 /journal.pone.0023271

Editeur: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Etats-Unis d'Amérique

Reçu: 19 mai 2011; Accepté 10 Juillet 2011; Publié le 18 Août, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Jiang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette recherche projet a été soutenu par la national science Foundation naturel de Chine (30950022 et 30972703) et les plans de développement de la Société, Département des sciences et de la technologie de Changzhou (BS20092019). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique reste l'une des formes les plus communes de cancer dans le monde avec environ 870.000 nouveaux cas et 650.000 décès par an. Le cancer gastrique est l'une des causes les plus fréquentes de décès par cancer en Chine [1]. La détection clinique précoce du cancer gastrique était inférieur à 15%, et environ 85% des cas de cancer gastrique ont été avancées [2]. Le taux moyen de mortalité du cancer gastrique en Chine est de plus de 26% pour les hommes et 15% pour la femelle. le cancer gastrique est un trouble et de nombreux facteurs conduisent probablement assez complexe et énigmatique au développement de la maladie. Épigénétique joue un rôle clé dans le développement du cancer de l'estomac et des preuves de montage ont montré que miARN non codantes sont l'un des principaux contributeurs au cancer de l'estomac.

miARN sont une classe de petits ARN non codantes de 20-22 nucléotides de long, qui sont traitées de pré-miARN plus grandes par l'enzyme RNase III Dicer (DICER1) en duplex miARN [3]. Un brin de ce duplex associe le complexe de silençage induit par l'ARN (RISC), alors que l'autre brin est généralement dégradé par les nucléases cellulaires [3]. Le complexe miRNA-RISC se lie à des cibles d'ARNm spécifiques, conduisant à la répression traductionnelle ou le clivage de ces ARNm. Ainsi, les miRNAs modulent l'expression protéique en favorisant la dégradation de l'ARN, ce qui inhibe la traduction de l'ARNm, et dans certains cas, ce qui affecte la transcription. Bien que miARN médiée par la dégradation de l'ARNm se produit chez les mammifères, la plupart des miARN de mammifères sont pensés pour réprimer l'expression du gène cible au niveau [4], [5], [6] via imparfait appariement de bases dans les régions non traduites en 3 (3 'translationnelle -UTRs) de leurs ARNm cibles. Cette forme de régulation de la traduction fournit la cellule avec une façon plus précise, immédiate et à faible consommation d'énergie de contrôler l'expression d'une protéine donnée [7], car elle induit des changements rapides dans la synthèse des protéines, sans activation de la transcription en excès et les étapes ultérieures de traitement de l'ARNm. En outre, le contrôle de la traduction de l'expression génique a l'avantage d'être facilement réversible, fournissant la cellule avec une grande souplesse pour répondre aux diverses sollicitations.

Fluoropyrimidine chimiothérapie à base (par exemple, S-1 /oxaliplatine et doxifluridine /oxaliplatine) demeure une option de traitement importante pour les patients atteints de cancer gastrique avancé. Des études antérieures ont découvert un certain nombre de miARN associés à la chimiorésistance au 5-FU et S1 thérapie basée sur le cancer colorectal [8], [9], [10], [11], [12], [13]. S-1 est une nouvelle voie orale dihydropyrimidine déshydrogénase (DPD) fluoropyrimidine inhibiteur (DIF) en se basant sur une modulation biochimique de la 5-fluorouracile (5-FU); S-1 contient du tégafur (FF) et deux types d'inhibiteurs de l'enzyme 5-chloro-2,4-dihydroxypyridine (CDHP) et oxonate de potassium (Oxo) dans un rapport molaire de 1:0.4:1. Doxifluridine est un dérivé de fluoropyrimidine et est activé à 5-fluorouracile par uridine phosphorylase, qui est plus fortement exprimée dans les cellules malignes. Un certain nombre de rapports ont démontré l'importance de miARN dans le cancer gastrique [14], [15], [16], [17]. Cependant, actuellement il n'y a aucune étude sur miARN liés à flupyrimidine traitement à base de chimiothérapie. Il y a un besoin urgent de découvrir des biomarqueurs pronostiques pour aider la prise en charge clinique du cancer gastrique avancé car cela vous aidera à sélectionner les patients qui auront avantage de survie du traitement, d'éviter la toxicité pour les non-répondeurs, et réduire le coût des soins de santé pour les patients.

Bien que plusieurs miARN profilage études ont été rapportées pour révéler l'importance de miARN dans le cancer gastrique avec un impact sur le contrôle du cycle cellulaire, l'apoptose, l'invasion tumorale et les métastases [14], [17], actuellement il n'y a pas de rapport à lien miRNA avec des traitements chimiothérapeutiques avec S-1 /oxaliplatine et doxifluridine /oxaliplatine. Dans cette étude, nous étudions systématiquement la relation des miARN candidats sélectionnés (par exemple, miR-21, miR-181b, miR-192, miR-140, 7g let) en fonction de leur utilité clinique dans le cancer gastrique à l'aide d'archives gastriques échantillons FFPE du cancer . Ces miARN ont été rapportés précédente d'être associé à fluoropyrimidine chimiorésistance basée dans le cancer colorectal [9], [10], [11], [12], [13]. échantillons pré-chimiothérapie ont été choisis dans le S-1 /oxaliplatine et doxifluridine /oxaliplatine dans le cancer gastrique avancé. Nous avons démontré que miARN précédente sont assez stables dans les échantillons FFPE et il est idéal pour la découverte de biomarqueurs [18]. Les patients traités avec S-1 /oxaliplatine avaient une meilleure réponse que doxifluridine /oxaliplatine. Cependant, il n'y a pas de différence dans la survie globale du patient. Nous avons découvert que miR-21 et miR-181b sont significativement associés à l'évolution du cancer gastrique avec S-1 /chimiothérapie à base d'oxaliplatine. À notre connaissance, ce rapport est le premier à démontrer la signification pronostique des miARN dans le cancer gastrique lié à S-1 /oxaliplatine et doxifluridine /oxaliplatine traitement. miR-21 et miR-181b ont un grand potentiel en tant que biomarqueurs pronostiques dans le cancer gastrique à un stade avancé.

Méthodes

Patients et échantillons de

cohortes d'échantillons cliniques utilisées pour cette étude ont été approuvés par le Conseil de Troisième Hôpital affilié de l'Université Soochow Review Institution. blocs de paraffine contenant des échantillons fixés au formol des tissus (FFPE) ont été obtenues à partir des collections d'archives du Département de pathologie, et utilisées pour l'extraction de l'ARN ultérieure. Les caractéristiques de ces patients sont présentés dans le tableau 1.

Isolement de l'ARN

Utilisation de tissus d'archives FFPE, des zones séparées de tumeur solide et de l'épithélium gastrique normale ont été identifiés à l'aide de la hématoxyline correspondante et Eosine coupes colorées et noyaux de mesure 1,5 mm de diamètre et de 2 mm de longueur (environ 0,005 g) ont été extraites. Par la suite, les échantillons ont été traités avec le déparaffinage, l'hydratation, la protéinase K, et, finalement, ARN totaux ont été isolés en utilisant le réactif de TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) [18].

analyse en temps réel qRT-PCR de miRNA expression

le miR-21, miR-140, laissez-7g, miR-181b, miR-200c, miR-192 amorces spécifiques et le gène contrôle RNU44 interne ont été achetés chez Applied Biosystems (CA, USA). la synthèse d'ADNc a été effectuée par la High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems) avec miRNA amorces spécifiques. en temps réel RT-PCR quantitative (qRT-PCR) a été réalisée sur un Applied Biosystems 7500 Système temps réel (instrument ABI 7500HT) avec des amorces spécifiques miARN par TaqMan Gene Expression Assay. Expression des valeurs miARN a été normalisée en fonction de la commande de RNU44 interne, et les valeurs relatives d'expression ont été tracées.

Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques a été réalisée en utilisant le logiciel GraphPad Prism 5.0. Gene expression des valeurs de ACt de miARN de chaque échantillon ont été calculées en normalisant selon l'expression de RNU44 de contrôle interne, et les valeurs relatives de quantification ont été tracées. Les différences entre la tumeur et les tissus normaux ont été analysés par Wilcoxon-paires test. Une courbe de survie de Kaplan-Meier a été générée en effectuant une analyse des risques proportionnels de régression de Cox pour évaluer le niveau d'expression de miR-21 et miR-181b avec un taux de survie. La signification statistique a été mis en place pour P
<. 0,05 dans chaque test

Résultats et discussion

énorme quantité d'efforts ont été axés sur la découverte de biomarqueurs prédictifs et pronostiques pour l'estomac cancer [19]. En raison de la complicité de la maladie du cancer gastrique, il reste un défi majeur pour identifier des biomarqueurs utiles cliniques. Avec la reconnaissance de l'impact global des miARN sur des cibles et des voies multiples, il est de notre intérêt d'identifier une nouvelle classe de biomarqueurs prédictifs et pronostiques dans le cancer gastrique sur la base de miARN. Il y a plusieurs avantages de l'utilisation miARN comme biomarqueur par rapport à l'ARNm comme miARN ont une large fonction de régulation, un nombre relativement faible et une meilleure stabilité dans les échantillons d'archives FFPE [18]. Nous rapportons ici que les niveaux de miR-181b et miR-21 expression constituent de solides facteurs pronostiques chez les patients atteints de cancer gastrique avancé à la fois sur S-1 /oxaliplatine et doxifluridine /oxaliplatine régimes. Les paramètres cliniques et pathologiques des patients atteints de cancer gastrique traités avec doxifluridine /oxaliplatine ou S-1 /oxaliplatine ont été répertoriés dans le tableau 1.

L'expression différentielle des miARN dans le cancer gastrique

Nous avons soigneusement sélectionné un certain nombre des candidats miRNA qui ont été rapportés précédente à être associés à fluoropyrimidine chimiorésistance basée dans le cancer colorectal [9], [10], [11], [12], [13]. Les niveaux d'expression de miARN ont été quantifiés par analyse en temps réel qRT-PCR en utilisant l'ARN total extrait à partir des échantillons gastriques FFPE du cancer et des tissus gastriques normaux en tant que témoins. Les niveaux d'expression de miARN ont encore été normalisées en utilisant RNU44 de contrôle interne. La plupart des miARN (par exemple miR-140, miR-200c), nous avons quantifié montré une expression différentielle entre les tissus normaux et tumoraux (Figure 1). L'expression d'un miARN importante, miR-200c, a été significativement réduite dans le cancer gastrique. miR-200c a été rapporté directement associé à cheomosensitivity et épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT) [20]. L'expression de miR-181b ( P
= 0,022) et miR-21 ( P
= 0,0029) a été significativement plus surexprimé dans les tumeurs gastriques par rapport aux tissus gastriques normaux (figure 2). Nos résultats sont cohérents avec les rapports précédents que ces miARN ont été déréglementés dans le cancer gastrique [21].

Association de miR-21 et miR-181b avec la réponse à S-1 /oxaliplatine et doxifluridine /oxaliplatine régime de traitement

Le taux de réponse objectif global (CR + PR) des patients traités par S-1 /oxaliplatine était de 33,3% (CR + PR) vs 17,6% de. (CR + PR) avec doxifluridine /oxaliplatine pour le stade III et IV patients atteints de cancer gastrique. Nous avons sélectionné plusieurs miARN qui ont été montrés pour être associés à fluoropyrimidine chimiorésistance basée dans le cancer du côlon [9], [10], [11], [12], [13] et une évaluation systématique de leur lien potentiel avec doxifluridine /oxaliplatine et S -1 /oxaliplatine dans le cancer gastrique. La faible expression de miR-21 ( P
= 0,001) et miR-181b ( P
= 0,001) étaient significativement associés avec les intervenants S-1 /oxaliplatine (tableau 2). Ceci est très cohérent avec le rapport précédent que l'expression de miR-181b a été associée à un traitement S1 dans le cancer colorectal [8]. Il a été rapporté que miR-181b a été associée à la multirésistance aux médicaments (MDR) en ciblant BCL2 [22]. En ce qui concerne miR-21, nos résultats étaient cohérents avec un rapport récent que la suppression de miR-21 par anti-miR pancréatiques sensibilise les lignées cellulaires du cancer à la gemcitabine (une fluoropyrimidine analogiques) traitement [23]. Cependant, la réponse favorable n'a pas d'impact de la survie globale du patient que la survie globale moyenne pour les patients traités avec S-1 /oxaliplatine (7,80 par mois) était similaire chez les patients traités avec doxifluridine /oxaliplatine (7,30 mois). Cela ne surprend pas aussi souvent le temps de réponse favorable ne se traduit pas au bénéfice de survie.

miR-21 et miR-181b étaient significativement associés à la survie du patient

Pour déterminer si certains de ces miARN ont un potentiel comme biomarqueur pronostique dans le cancer gastrique, nous avons effectué l'analyse de la survie du patient en utilisant la courbe de survie de Kaplan-Meier par multi variante analyse de régression de Cox. Kaplan-Meier analyse de survie par régression de Cox a révélé que de faibles niveaux de miR-21 expression (test du log rank, hazard ratio: 0,17, IC = de 0,06 à 0,45; P
= 0,0004) et miR-181b (Log rank test, rapport de risque: 0,37, IC = 0,16 à 0,87; P
= 0,018) sont étroitement associés à la survie globale des patients pour mieux les deux S-1 et les traitements à base doxifluridine (Figure 3). L'importance de miR-21 et miR-181b dans le cancer gastrique a été fortement soutenu par un rapport récent que les expressions de miR-21 et miR-181b ont été activés par STAT3 médiée par l'IL-6. miR-21 et miR-181b acte comme un commutateur épigénétique pour inhiber PTEN et CYLD tumorales suppresseurs, conduisant à une augmentation de l'activité de NF-kB nécessaire pour maintenir l'état transformé [24]. Nous avons également révélé que l'expression des deux miR-21 et miR-181b est associée positivement en termes de valeur d'expression basé sur l'analyse statistique (corrélation de Pearson r = 0,38, P
= 0,018; corrélation de Spearman r _{s = 0,38, P
= 0,018). Il est tout à fait concevable que miR-21 et miR-181b agissent comme un commutateur épigénétique dans le développement du cancer de l'estomac et de contribuer à la chimiorésistance en modulant les gènes suppresseurs de tumeur cible clés tels que PDCD4, ANP32A et gènes SMARCA4 [25]. Elevated miR-21 expression a été rapportée dans de nombreux types de tumeurs, ce qui suggère l'importance de miR-21 comme un oncogène bona fide. Il a été rapporté le miR-21 a été associée à H. pylori
infection et le développement du cancer gastrique, ce qui suggère que miR-21 pourrait être le lien épigénétique potentiel d'inflammation de H. l'infection et la tumeur l'initiation pylori du cancer gastrique [26].}

En conclusion, nous rapportons ici pour la première fois que l'expression de miR-181b et miR-21 ont été associés à S-1 /oxaliplatine et doxifluridine /traitement oxaliplatine et la survie des patients. Il soutient en outre l'idée de l'importance potentielle de miR-181b et miR-21 dans le développement de la maladie du cancer gastrique. Il établit une base pour explorer davantage le mécanisme moléculaire sous-jacent de développement du cancer gastrique impliqué avec miR-181b et miR-21, et de valider pleinement nos conclusions à la grande cohorte, multicentrique patients de l'essai clinique. miR-181b et miR-21 peuvent également avoir le potentiel d'être des cibles thérapeutiques nouvelles dans le cancer gastrique.

Haifeng Deng Remerciements, Mingyang Lu, Bin Xu, Min Li, Jian Liu, Zhengguang Li et Hongbing Shi a fourni une excellente assistance technique.

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