PLoS ONE: MicroRNA-137 Auttaa Värinävaimennettu tuumorigeneesiä Human Mahalaukun Cancer by Targeting AKT2

tiivistelmä

miRNA tärkeä rooli kasvainten synnyssä. Tässä tutkimuksessa keskityttiin tutkimaan vaikutuksia ja sääntelyn mekanismi miRNA-137 on biologista käyttäytymistä mahasyövän. Kokonais-RNA uutettiin kudoksista 100 potilailla, joilla on mahalaukun syövän ja neljästä mahasyövän solulinjoissa. Expression of miR-137 havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä 100 potilasta. Vaikutukset miR-137 ilmentymisen vaikutus mahalaukun syövän solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike ja invaasio kyky tutkittiin in vitro ja in vivo. Tavoitteena geeni miR-137 ennustettiin Targetscan linjalla ohjelmisto, seulottiin dual lusiferaasireportterigeenillä määritys ja osoitettiin Western blot. Tämän seurauksena, ekspressio miR-137 oli merkittävästi vähentää mahalaukun syövän solulinja HGC-27, HGC-803, SGC-7901 ja MKN-45 sekä mahasyövän kudoksissa verrattuna GES-1 solu tai täsmäsi viereisiin -neoplastic kudokset ( p
< 0,001). Uudelleen käyttöön miR-137 mahalaukun syöpäsoluihin kykeni estävät solujen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja hyökkäystä. In vivo kokeet osoittivat, että miR-137 yliekspressio voi vähentää mahasyövän solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden. Bioinformatiikka ja western blot-analyysi osoitti, että miR-137 toiminut tuumorisuppressoriproteiinia rooleja mahalaukun syöpäsoluihin kohdistamalla AKT2 ja edelleen vaikuttavat Bad ja GSK-3β. Lopuksi miR-137, joka on usein alassäädetty mahasyövän on mahdollisesti mukana mahasyövässä kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden säätelemällä AKT2 liittyvien signaalien kulkureiteillä.

Citation: Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, Yang W, et ai. (2015) MicroRNA-137 Auttaa Värinävaimennettu tuumorigeneesiä Human Mahalaukun syöpää Targeting AKT2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10,1371 /journal.pone.0130124

Academic Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 15 elokuu 2014; Hyväksytty: 18 toukokuu 2015; Julkaistu: 23 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Lääketieteen ja teknologian tutkimushankkeet Henanin maakunnassa Kiinassa (2011030004).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään maailmassa [1]. Toistaiseksi mekanismi mahasyövän ei juuri tunneta. Tutkijat ovat yrittäneet tutkia GC näkymästä biokemian ja molekyylibiologian että jotkut tuumorisuppressorigeeneissä ja kasvaimeen liittyviä geenejä on raportoitu GC. MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisesti pienet ei-koodaavat RNA: t 18 ~ 22 nukleotidin, joka on tunnistettu posttranskriptionaalisella sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen [2, 3]. MiRNA kriittisiä rooleja paljon biologisissa prosesseissa, kuten leviämisen, kehitys, erilaistumista ja apoptoosia. Samalla miRNA on validoitu toimimaan oncogenes tai tuumorisuppressorigeeneille aikana tuumorigeneesin. Esimerkiksi, miR-31 todettiin onkogeenin ruokatorven okasolusyöpä [4] ja miR-451 toimii tuumorisuppressori ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [5]. On myös monia MikroRNA tunnistettiin liittyvät mahasyövän tapahtuu ja kehittämiseen [6-13]. On myös raportoitu, että yli-ilmentyminen miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a ja miR-423-5p voidaan käyttää diagnostiset kriteerit mahasyövän [14] .Siksi miRNA ovat mahdollisia ehdokkaita uusien diagnostisten biomarkkereiden tai hoitotavoitteet mahasyövän.

MicroRNA-137 (miR-137) on raportoitu olevan alassäädetty ja rooleja tuumorisuppressorina kolorektaalisyövässä ja suusyövän [15, 16]. Kuitenkin toiminta miR-137 ja sen mekanismi taustalla mahasyövän eivät vieläkään ole kovin selvä. Chen et al osoitti, että miR-137 voi näytelmiä tuumorisuppressorina kohdistamalla Cdc42 säädellä solusyklin mahasyövän [17]. Silti se on selvästi meille, että microRNA säätelee biologista käyttäytymistä useiden polku tavalla, että voisi olla enemmän sääntelyä mekanismi miR-137 kohti GC kasvaimien syntyyn. Tässä tutkimuksessa mittasimme ilmaus miR-137 100 potilailla, joilla on mahasyövän ja tutki roolit miR-137 mahalaukun syöpäsoluja. Löysimme joitakin muita toimintoja miR-137 GC sekä toinen polku tapa, jolla miR-137 oli rooli on tuumorisuppressori GC kasvaimien syntyyn.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki ihmisen tutkimukset on hyväksynyt asianmukaisen eettisen komitean ja sen vuoksi tehty mukaisesti eettisiä standardeja. Kaikki henkilöt antoivat tietoisen suostumuksen ennen niiden sisällyttämistä tutkimukseen.

Potilaat ja näytteet

Ihmisen mahasyövän kerättiin kirurgisista näytteistä 100 potilasta (mies 56, nainen 44) GC klo Cancer Institute ja sairaalan, ensimmäinen sidoksissa sairaalan Henan University; Toisen sairaalan Kansan vapautusarmeija Kiinan; Hebei Cancer Hospital. Ei-kasvain näytteet makroskooppisen kasvaimen raja eristettiin samaan aikaan ja käytetään sovitetun viereisen ei-neoplastisia kudoksia. Kaikki näytteet jaettiin kahteen osaan. Tissue kerättiin välittömästi jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Käyttö kudosnäytteiden kaikissa kokeissa oli hyväksynyt eettinen hallituksen instituutin Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences. Kaikki osallistujat, jos niiden sanallinen suostumus osallistumaan tähän tutkimukseen, ja niiden sanallinen ilmoittanut suostumuksensa kirjattiin. Tämä onsent prosessi hyväksyi myös eettisen aluksella. Neljä mahasyövän solulinjoissa (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 ja MKN-45) olivat kaikki säilytetty laboratoriossamme ja ylläpidetään DMEM tai 1640 10% FBS.

RNA: n uutto, cDNA-synteesi ja reaaliaikainen PCR-määrityksissä

Yhteensä RNA kudoksia ja soluja uutettiin Trizol menetelmällä (Ambion, USA) täysin ohjeiden mukaan. Yksisäikeinen cDNA syntetisoitiin M-MLV (Ambion, USA) käyttäen 2 ug kokonais-RNA: ta templaattina. Oligo (dT) 18, käytettiin mRNA: n käänteinen transkriptio, kun stem-loop käytetään miRNA. Reaaliaikainen-PCR (RT-PCR) suoritettiin Bio-rad CFX96 (Bio-rad, USA) käyttäen SYBR mix (Tiangen, Kiina). PCR-ehto on: 95 ° C x 30 s, jonka jälkeen 40 sykliä 95 ° C x 5 s, 60 ° C x 34s. Varten mRNA: t, GAPDH käytettiin normalisoitu kontrolli. Sillä miRNA, U6 snRNA käytettiin miRNA valvontaa. Suhteellinen ilmentyminen miR-137 laskettiin 2-ΔΔCT menetelmällä. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.

Plasmidi rakentaminen

miR-137 prekursorin sekvenssi generoidaan hehkutus ja miR-137-esiaste-F ja miR-137-esiaste-R laajennus oli tällä välin pilkottiin BamHI: llä ja BglII: lla, jonka tuotteet oli insertit BamHI-Bglll-fragmentti pcDNA-GW /EmGFP-miR vektori (GenePharma, Kiina). Tällä välin negatiivinen kontrolli rakennettiin myös.

Soluviljely ja miRNA transfektio

solulinjat HGC-27, SGC-7901 MKN-45 ja GES-1 hankittiin Cell Resource center of Institute of Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences ja Pekingin unionin Medical College (Peking, Kiina). Ihmisen mahalaukun solulinjat HGC-27, SGC-7901 ja MKN-45 viljeltiin RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja ihmisen mahalaukun epiteelin solulinja GES-1 pidettiin DMEM: ssä ( Gibco, BRL, UK) tiedotusvälineet. MIR-137 matkivat ja sekoituskoodin matkia, joka on ei-homologinen ihmisen genomin syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina) ja transfektoitiin soluihin lopulliseen oligonukleotidin konsentraatio 10nmol /L. Kaikki solujen transfektiot käyttöön DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, USA) valmistajan käyttää ohjeita. Kunkin solun transfektiota kaksi tai kolme replikaatiota kokeet suoritettiin.

Solujen lisääntyminen ja apoptoosimäärityksessä

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin CCK8 menetelmällä (Dojindo, Japan). Lyhyesti, noin 5000 miR-137 matkivat transfektoiduissa soluissa ja ryntäily solut vastaavasti ympättiin 96-kuoppalevyille ja viljeltiin. Proliferaationopeudet määritettiin 0, 12, 24, 48, 72, 96 tuntia transfektion jälkeen lisäämällä 10 ui CCK8 valtionhoitaja ja testattu käsikirjoituksia. Apoptoosi määritykset testattiin HGC-27 ja SGC-7901-solujen linjat tai ilman miR-137 yliekspressio by Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, USA) ja C6 Flow Cytometer (USA).

Solun muuttoliike ja invaasio määritykset

Suoritimme arpeutumisprosessit määrityksessä testaamaan solujen vaeltamiseen kykyä tai ilman miR-137 transfektiota. Keinotekoinen haavat tuotettiin Konfluenttien yksisolukerros FBS vapaa käyttäen 200 ui pipetin kärki 24 tunnin kuluttua miR-137 transfektiota. Kuvat otettiin vastaavasti otettu 0, 12, 24 ja 36 tunnin kuluttua haavan syntymiseen.

Sitten suoritetaan transwell määrityksiä arvioida solujen invaasiota kyky. 5 x 10 ^{4 solut suspensoitiin 200 ul väliaineessa ilman FBS sijoitettiin ylempään kammioon kunkin insertin kanssa 430μl 1 mg /ml Matrigel (Millipore, USA). 600 ui elatusainetta 10% FBS kuin ravitsemukselliset houkutin pantiin alempaan kammioon. 24 tunnin kuluttua solut kiinnitetään alapintaan kammion olivat kiinteät 20 min 20% metanolia ja värjättiin 10 minuutin ajan 10%: maygruwald-Giemsa (MGG). Invaasio kalvot leikattiin sitten alas ja sulautetut alla peitinlaseja. Laskimme soluja 3 eri näkemys fi elds kunnossa 20 × magni fi kationi, joka sitten käytettiin keskimäärin soluja. Kaikki määritykset suoritettiin kolmen erillisen kokeen.}

eläinkoetta

kokeista, joissa eläimet suoritettiin Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals ja institutionaalisten eettisiä ohjeita eläinkokeita. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden nokat (Kiina Academy of Medical Sciences) (Luvan numero: C72-14-0664). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Scramble-transfektoidut ja miR-137 yli-ilmentymisen HGC-27-solut (5 x 10 ^{6 solua) inokuloitiin s.c. osaksi selkä kylkiin BALB /c-nude-hiiret (naaraita, Nu /Nu 6 viikkoa), jotka kaikki hankittiin eläinkeskus Henan yliopiston ja kasvanut patogeenivapaissa olosuhteissa. Kasvaimen tilavuus mitattiin 5 viikkoa. Kaikki hiiret tapettiin ja s.c. kasvaimia resekoitiin ja paino kasvainten testattiin. In vivo etäpesäkkeitä kokeissa HGC-27 solut kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Solun elinkelpoisuus Testi suoritettiin käyttäen XTT määritystä kit24 tunnin kuluttua transfektion mukaan valmistajan ohjeiden (Roche, Tokio, Japani). Sitten hiiret (naaraita, Nu /Nu, 6 viikkoa vanhat) injektoitiin HGC-27-solujen kanssa tai ilman miR-137 yliekspressio häntälaskimon kautta 2 x 10 5-soluja PBS: ssä. HGC-27-solut muutettu joka voi vakaasti ilmaista lusiferaasin (rakennettu GENECHEM, Shanghai, Kiina). Solut tarkastettava mikroskoopilla varmistaa, että solut olivat hyvässä kunnossa. Kuuden viikon kuluttua Bioluminescence kuvantaminen suoritettiin käyttäen IVIS Spectrum ja kuva säteily arvot normalisoitiin käyttäen Living Image (Caliper Life Science, USA).}

immunohistokemia

Kudokset upottaa parafiinileikkeillä ja käsitelty 2 tuntia 65 ° C: ssa ja sitten deparaffinised. Ennen kuin ensisijaisen vasta 4 ° C: ssa yön, toteutimme antigeenin haku askel. Sen jälkeen, kalvot inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen noin 2 tuntia 25 ° C: ssa konjugoitu HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Kiina). Liquid DAB + Substraatti (zsgb-bio, Kiina) käytettiin havaitsemiseen HRP-aktiivisuus.

Luciferase miRNA tavoite reportterimääritys

koko pituus 3'UTRs ihmisen AKT2 mRNA: iden oli kunkin PCR-monistettiin ja kloonattiin pMIR-REPORTTM Luciferase Reporter Vector (Ambion, USA) tuottaa toimittajille. Mutaatiot ennustetuista siemenen alueita mRNA-sekvenssit luotiin käyttämällä alukkeita lukien mutatoitunut sivustoja. HEK-293T-soluja ympättiin 24-kuoppalevyille (1 x 10 ^{5 solua per kuoppa) päivää ennen transfektiot suoritettiin. Solut (-70% konfluentteja) transfektoitiin PRL-TK lusiferaasi toimittajat (50 ng /kuoppa), pGL-3firefly lusiferaasi (10 ng /kuoppa), ja matkivat-137 (50 nmol /l, GenePharma, Shanghai, Kiina) tai sekoituskoodin (50 nmol /l) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase aktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, USA).}

Western blotting

proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten 0,45 um: n PVDF-membraaneille (Amersham, UK). Membraanit inkuboitiin 5% rasvatonta kuivamaitoa yön yli 4 ° C: ssa ja anti-AKT2 monoklonaalinen vasta-aine (Proteintech, USA) 1: 1000 laimennus; anti-Bad-monoklonaalinen vasta-aine (Bioworld, USA) 1: 500 laimennus; anti-GSK-3B polyklonaalista vasta-ainetta (Bio- world, USA) 1: 1000 laimennus; anti-GAPDH vasta-ainetta (Proteintech, Chicago, USA) 1: 30000 laimennos. Kun oli pesty kaksi kertaa TBST: llä, kalvoja inkuboitiin vuohen anti-kani-vasta-aine (zsgb-bio, Kiina) 1: 5000 ja 1: 50000 laimennoksia 2 h.

Tilastot

Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Studentin t-testiä (kaksisuuntainen) ja x ^{2 testi suoritettiin, ja tilastollisesti merkitsevä asetettiin arvoon α = 0.05 kahden puolen). Keskiarvo ± SD näkyy kuvissa.}

Tulokset

MiR-137 säätyy alas mahalaukun syöpäsoluissa ja kliinisissä näytteissä

Ensin tarkasteltiin ilmentymisen kypsän miR -137 4 ihmisen mahasyövän solulinjoissa (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 ja MKN-45) ja mahalaukun epiteelisolujen (GES-1). Nämä GC solulinjat osoittivat erittäin alhainen ilmentyminen miR-137 verrattuna GES-1-solulinjassa (kuvio 1A). Lisätutkimuksia suhdetta miR-137 GC esiintyminen, havaitsimme ilmaus miR-137 100 kliinisessä potilailla (mies 56, nainen 44, keski-ikä 53 vuotta) by Taqman koetin-drived reaaliaikainen PCR edellä kuvatulla tavalla. Out of 100 GC näytteiden ilmaus miR-137 oli säädellä vähentävästi 77 tapauksessa (77%) verrattuna viereisten kudosten kun katkaisurajasäännöksiä perustettiin 1.5. Samaan aikaan miR-137 oli säädelty 23 tapauksessa (23%) (kuvio 1 B ja 1 C). Yleensä ilmaus miR-137 GC kudoksissa oli pienempi kuin viereisten kudosten tilastollisesti merkitseviä eroja (p = 0,00079, parillista t-testiä, kaksisuuntainen, kuvio 1C). Lisäksi olemme löytäneet tilastollisesti merkitsevästi yhteydessä ilmaisua miR-137 ja mahasyövän kliinisessä vaiheessa. Potilaat, joilla on alhaisempi miR-137 ilmentyminen liittyi korkea-asteen ja myöhäisvaiheen kasvaimet (kuvio 1 D). Nämä tulokset osoittivat, että korjauksilla miR-137 voisi olla mukana mahalaukun syövän etenemisessä.

MiR-137 inhiboi soluproliferaatiota in vitro ja in vivo

Transfektoimme miR-137 matkivat osaksi GC solulinjoihin HGC 27 ja SGC-7901, jotka molemmat osoittivat suurta transfektiotehokkuuden (kuvio 2A). Tulokset CCK8 kasvun määrityksiä 0, 1, 2, 3 ja 4 d jälkeen miR-137 ja sekoituskoodin transfektio on esitetty kuviossa 2B. Verrattuna ryntäily transfektion miR-137 transfektio vähensi lisääntymistä molemmissa solulinjoissa (kuvio 2B). Sitten tutkimme vaikutus miR-137 solujen apoptoosin. Varhainen apoptoottiset solut ryntäily ryhmässä oli noin 10% vuonna HGC-27 ja 2,9% SGC-7901, kun taas jälkeen miR-137 transfektion prosenttiosuus varhaisen apoptoottisten solujen nostettiin 17,5% vuonna HGC-27 ja 8,3% vuonna SGC-7901, joka osoitti merkitsevästi erilainen (kuvio 2C). Näistä tuloksista voidaan päätellä, että miR-137 voi tukahduttaa keuhkosyöpäsolua selviytymisen aiheuttamalla varhaisen apoptoosin.

varmistamiseksi edelleen havainnot edellä, in vivo mallissa rakennettiin. Olemme havainneet, että kasvaimen kasvu oli huomattavasti hitaampaa miR-137 yliekspressio hiiret kuin kontrolleissa (kuvio 2D, 2E ja 2G). Suostumuksella kasvaimen kasvukäyrä, painot kasvainten aiheuttamien scramble solut olivat huomattavasti korkeammat kuin niiden MIR-137 yliekspressio (kuvio 2F). Nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että miR-137 yli-ilmentyminen saattaa rajoittaa mahasyövän solujen lisääntymisen in vivo.

MiR-137 estää solumigraatio ja invaasiota in vitro ja in vivo

lisäksi arvioitiin vaikutuksia Mir-137 solumigraation ja invaasio, jotka olivat keskeisiä tekijöitä pahanlaatuisten etenemisen ja etäpesäkkeiden. Vaikutukset miR-137 solumigraatio kanssa osoitettiin haavan paranemisen /naarmu määritystä HGC-27 ja SGC-7901-soluissa. Molemmat kaksi solulinjaa käsiteltiin miR-137 matkivat olivat selvästi sen vähemmän muuttavia kuin sekoituskoodin valvontaa tai käsittelemättömät solut 12, 24, ja 36 tunnin jälkeen raapiminen (kuvio 3A). Lisäksi teimme solun invaasiomääritys mitata suuntaava hyökkäyksen kyvyt soluissa, sen jälkeen miR-137 yliekspressio. Tämän seurauksena, invasiivisuus transfektoitujen solujen miR-137 matkivat dramaattisesti vähentynyt verrattuna sekoituskoodin solujen HGC-27 ja SGC-7901 (kuvio 3B). Sitten, in vivo kokeissa käytettiin edelleen todentamiseksi tämän tuloksen. Olemme ensinnäkin osoitettu, että transfektoitujen solujen miR-137 matkivat tai matkivat ohjaus ei osoittanut merkittävää vähenemistä solujen elinkelpoisuuden verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Lisäksi, ei ole mitään eroa solujen elinkelpoisuuden solujen välillä, jotka on transfektoitu miR-137 matkivat verrattuna negatiiviseen kontrolliin (S2 kuvassa). Kuten kuviossa 3C, bioluminescent kuvantaminen hiiristä miR-137 yliekspressio ryhmä osoitti paljon pienempi kuva. Myös määrä keuhkometastaasitestissä kohti hiiret miR-137 ryhmä osoitti huomattavasti alhaisempi kuin ryntäily ryhmään, joka osoitti, että miR-137 voi tukahduttaa etäpesäkkeitä in vivo. Nämä tulokset osoittivat, että miR-137 pelataan tärkeä rooli säätelyssä solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus mahasyövän ja ehdotti, että alas-säätely miR-137 saattaa edistää kasvainten etäispesäkkeiden mahasyövän.

miR-137 tavoitteet AKT2 GC

miRNA suoritetaan biologisten toimintojen kautta negatiivisesti säätelevät niiden kohdegeenien. Kuten ennustettiin, oli täydentävät toisiaan on-miR-137 ja AKT2 3'-UTR (kuvio 4A).

Sen hypoteesin testaamiseksi, että AKT2 saattaa olla kohteena miR-137, toimittaja plasmidin luonnossa tyyppinen 3'-UTR alue AKT2 alavirtaan lusiferaasia koodaavan alueen (kuvio 4A, AKT2_WT) rakennettiin. HEK-293T-solut kotransfektoitiin reportteriplasmidilla (AKT2_WT) ja ryntäily. Tämän seurauksena, miR-137 transfektoidut solut pieneni selvästi (≈58%) lusiferaasin aktiivisuuden (kuvio 4B). Sitten sama määritys suoritettiin vielä reportteri sisältävä plasmidi mutatoitunut AKT2 3'-UTR in miR-137 sitoutumiskohtia. Kuten odotettua, esto lusiferaasiaktiivisuutta miR-137 osittain poistettiin sitoutumiskohtaan 1 tai sitova mainitsevat 2 mutantti ja lähes lakkautettiin AKT2_MUT kaksinkertainen mutantti, mikä viittaa siihen, että säilyneen alueen oli täysin vastuussa miR-137 toiminto (kuvio 4B) .

Jotta voitaisiin edelleen tutkia vuorovaikutusta miR-137 ja AKT2, HGC-27 ja SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-137. AKT2 mRNA ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Mitään merkittävää eroa ei havaittu miR-137-käsiteltyjen ja sekoituskoodin-käsitellyt tai käsittelemättömät HGC-27 ja SGC-7901-soluissa (kuvio 4C). Sitten, western blotting-analyysi suoritettiin mittaamiseksi AKT2 proteiinia. Huomasimme, että ilmentyminen AKT2 proteiinin alas säännelty miR-137 käsitellään HGC-27 ja SGC-7901-soluissa, mutta ei ryntäily tai käsittelemättömiä soluja (kuvio 4D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-137 suoraan tunnistaa 3'-UTR AKT2 mRNA: ta ja estää AKT2 käännös. Siten säädeltiin miR-137 mahasyövän estää tukahduttaminen AKT2, mikä puolestaan ​​hidastaa kasvaimien syntyyn.

AKT2 kuuluu AKT perhe. Olemme edelleen havainneet sen loppupään efektoreja Bad ja GSK-B. Tämän seurauksena p-Bad ja p-GSK-B ilmeisesti alas säännelty miR-137 käsitellään HGC-27 ja SGC-7901-soluissa verrattuna scramble-käsiteltyjen tai käsittelemättömien solujen. Mitään merkittävää muutosta havaittiin ei-fosforyloidun Bad tai GSK (kuvio 4E). Nämä havainnot viittaavat siihen, että nopeutettu mahasyövän solujen kasvua johtui osittain yli-actived Akt reittejä. Lisäksi edistää solujen lisääntymistä, actived Akt voitaisiin myös fosforyloida Bad at Ser112 ja Ser136, estää Bad-solukuolema. Koska fosforylaation näissä kohdissa, Bad ajatellaan olevan vuorovaikutuksessa Bcl-xl indusoida solukuolemaa. Sen sijaan, Akt-välitteisen hyperfosforylaatiota Bad saattaa edistää solujen eloonjäämistä syöpäsoluissa. Meidän Western blotting tulokset vahvistivat edellä spekulointia, että muutos mahasyövän solujen toimintaa kunnon miR-137-transfektoiduissa soluissa voi olla seurausta vähentynyt fosforylaation Bad. Lisäksi olemme analysoineet proteiinin tasot AKT2 12 GC patientsin joille miR-137 oli alassäädetty. Näistä näytteistä AKT2 oli säädelty in9patientsin niiden GC kudoksiin (kuvio 4F).

Palauttaminen AKT2 lyijyä käyttöavaimen hyökkäyksen ja tukahduttaminen apoptoosin

Jotta edelleen osoittamiseksi roolit miR-137 ja AKT2 pelataan aikana tuumorigeneesiprosessin tutkimme vaikutus palauttaminen AKT2 in miR-137 transfektoiduissa soluissa. Western blot osoitti, että AKT2 proteiini tasolla AKT2 yli-ilmentyminen näytteessä oli ilmeisesti suurempi kuin negatiivisen kontrollin jopa tukahduttaminen miR-137. Palauttaminen AKT2 lyijyä käyttöavaimen hyökkäyksen ja tukahduttaminen apoptoosin (kuvio 5).

Keskustelu

miRNA on usein osoitettu olevan usein väärin säädellystä erilaisissa ihmisen syövissä ja jotkut miRNA on vaikka käytetty käyttää terapeuttisina kohteina syövän. Tutkijat viittaavat suhdetta miRNA ja syövät voisi auttaa meitä ymmärrystä syöpään.

On olemassa vain muutamia tutkimuksia viitaten rooliin miR-137 pelataan mahasyövässä. On raportoitu, että miR-137 on negatiivinen säätelijä Cdc42 ja kohdentamalla jotka aiheuttamaan apoptoosin ja solukierron G1 pysähtymisen mahasyövässä soluissa [17]. Kuitenkin sääntelyn vaikutus mikroRNA syövässä on melko monimutkainen. Se tuntuu mahdottomalta, että miR-137 säätelee mahasyövän että yhtä oikeaa. Tässä tutkimuksessa, toiminto ja mekanismi, miR-137 säännelty mahasyövän tutkittiin tarkemmin.

Ensinnäkin, havaitsimme ilmaus miR-137 100: sta ja totesi, että ilmentyminen miR-137 on laskenut merkittävästi -regulated syövän näytteessä. Lisäksi olemme löytäneet tilastollisesti merkitsevästi yhteydessä ilmaisua miR-137 ja mahasyövän kliinisessä vaiheessa. Nämä tulokset osoittivat, että korjauksilla miR-137 voisi olla mukana mahalaukun syövän etenemisessä. Olemme yrittäneet löytää suhde miR-137 ja potilaiden ikä, sukupuoli, mutta ei tilastollinen tulos löytynyt. Koska tässä tutkimuksessa paljastui, että ilmentyminen miR-137 oli alassäädetty useimmissa GC kudosten verrattuna viereisten kudosten (77%), voisimme harkita noin diagnosointiin ja ennustetekijöiden käyttö miR-137. Lisävalidointia prospektiivisissa tutkimuksissa on perusteltu ja helpommin saatavilla näytteitä lähteitä, kuten miR-137-rikastettu kasvainperäinen eksosomeiksi verestä, olisi tutkittava. Lisäksi on huomattava, että jossakin määrin raja-arvo (cut off = 1,5) päätimme voisi olla vielä mielivaltainen. Kun se oli asetettu korkeammalle, voisi olla vähemmän potilailla, joilla miR-137 säädeltiin syövän kudoksissa. Kuitenkin myös tämä ehto oli noin 23%: n syövistä on korkea miR-137 ilme. Tämä voi johtua siitä, että yksittäiset ero potilaiden keskuudessa, että jotkut yksilöt voivat olla eri geeniekspressiomalli aikana tuumorigeneesin tai syövän etenemistä.

ilmentymisen miR-137 GC kudoksissa oli pienempi kuin viereisten kudosten tilastollisesti merkitseviä eroja (p = 0,00079), voisimme spekuloida, että tämä ilmaus ominaisuus oli liittyy syövän kehittymisen. Tämä keinottelu vahvistettiin in vitro ja in vivo tutkimuksissa, että miR-137 voi säädellä negatiivisesti solujen lisääntymistä, muuttoliike ja hyökkäystä. MIR-137 ekspressiotaso voi pitää korkealla tasolla pitkän ajanjakson aikana transfektion jälkeen sekä mahasyövän solulinjoissa, loppuvaiheen ksenograftikasvaimissa ja inmetastatic sijainti keuhkoissa (S1A Kuva-S1C Kuva). Kuitenkin yli-ilmentyminen menetelmä johtaa erittäin ekspressiotasot miR-137 (kuvio 2A). Tämä korkea taso miR-137 voivat aiheuttaa ylimääräisiä vaikutuksia. Esimerkiksi miR-137 on negatiivinen säätelijä Cdc42 ja kohdentamalla jotka aiheuttamaan apoptoosin ja solukierron G1 pysähtymisen mahasyövässä soluissa [17]. Koska miR-137 tutkimuksessamme oli voimistunut tuhansia kertoja, se voi johtaa estoon muita tavoitteita kuten Cdc42. On selvää, että tässä tutkimuksessa emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että kasvain vaimennin vaikutuksia miR-137 välitti tukahduttamalla muiden kohdegeeneissä.

Sitten huomasimme, että miR-137 toimii tuumorisuppressorigeeniä kohdistamalla AKT2 , joka on jäsenenä AKT perhe. Palauttaminen AKT2 aiheuttaa säätelyn AKT2 in miR-137 transfektoiduissa soluissa, mikä on huomattavasti korkeampi kuin ryntäily. Tämä saattaa johtua siitä, että AKT2 yli-ilmentyminen päinvastaiseksi proteiinin taso miR-137 tukahdutetaan. Vielä tärkeämpää on, palauttaminen AKT2 säätelee apoptoosia ja invaasion mahalaukun syövän solujen, mikä johtaa aktivoinnin hyökkäyksen ja vaimennusta apoptoosin (kuvio 5). Tämä pelastus koe antaa lisää todisteita siitä, että miR-137 aktiivista apoptoosia ja säädellä negatiivisesti soluinvaasiota kohdistamalla AKT2. In vivo kokeet osoittivat myös, että miR-137 ilmaisu on negatiivisesti suhteessa AKT2 lauseke (S1D Kuva ja S1E Kuva). AKT on ratkaiseva tekijä PI3K /AKT path tavalla. Alas sääntely AKT2 edelleen vaikuttaa sen alavirtaan proteiini Bad ja GSK-3B, että p-Bad ja p-GSK-B oli ilmeisesti alas säännelty. Huono voi täyttää roolit fosforyloimalla ja edelleen säädellä solun kohtalon [18]. GSK-3B, joka tunnetaan myös GSK-3β yleensä, ohjaa solua maahanmuutto ja invaasiota. Yhteenvetona olemme tunnistaneet linkkinä miR-137 ja AKT2 joka on uusi ainesosa mahasyövän kasvaimien syntyyn. MIR-137 on osoitettu liittyvän AKT2 asetuksen [19]. Maksasolukarsinoomassa, miR-137 estää syöpäsolujen kasvua ja etäpesäkkeiden kautta suoraan kohdistaminen AKT2 [20]. Itse asiassa olemme e on seulottu 8 geenejä mahdollisina kohteina miR-137 (S1 taulukko). Kuitenkin AKT2 on ainoa suora kohteena miR-137 jälkeen dual lusiferaasireportterigeenillä määritys ja western blot tutkinta. Kuviosta 4D löydämme thatmiR-137 voi vaikuttaa AKT2 ja p-AKT2in sekä HGC-27 ja SGC-7901-soluissa. Mutta kiinnostavaa, in SGC-7901 fosforylaation tila oli ilmeisesti vaikutti enemmän. Tätä ilmiötä voidaan johdonmukaisesti havaita kolmessa toistuvien blotit teimme. Olemme päätellä, että voisi johtua erityinen ominaisuus eri syöpäsoluja. Saattaa olla erityinen sääntely polku tapa miR-137 SGC-7901, joka tukahdutettu fosforylaatiota tilan AKT2.However, nykyisestä tutkimus, emme voi täysin selittää tätä mekanismia. Kun valitsimme potilaille, joilla on alhainen ilmentyminen miR-137 niiden GC kudoksen havaitsemiseksi AKT2 proteiinin ilmentymistä, löysimme useimmat näistä potilaista (9/12) on korkea AKT2 taso niiden GC kudoksessa. Tämä tulos viittaa siihen, että miR-137 voitaisiin kohdistaa AKT2 potilailla. Oli myös kolme potilasta, joilla on alhainen ilmentyminen AKT2 GC kudoksessa vaikka ilmentymistä miR-137 on alhainen. Tämä tulos saattaa johtua yksittäisten eroa potilailla.

Yhteenvetona meidän ilme ja toiminnallisia tutkimuksia ehdotti, että miR-137 on usein alassäädetty mahasyövän voi toimia tuumorisuppressori GC soluissa, joka palauttaa ilmaus joka GC soluissa vaimennetaan mahasyövässä solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion suoraan kohdistaminen AKT2. Siten meidän teokset on hyvä täydennys aikaisemman työn ja on hyödyllistä meitä ymmärtämään miR-137 sääntelymekanismi syövässä.

tukeminen Information
S1 Kuva. miR-137 ja AKT2 ilmaisun jälkeen transfektion.
A. miR-137 ilmentymisen HGC-27-solujen ja SGC-7901-solujen 72 tunnin kuluttua transfektion. B. miR-137 ilmentymisen loppuvaiheen ksenograftikasvaimissa. C. miR-137 ilmentymisen metastaattisessa lokalisointia hiirten keuhkoihin. D. AKT2 ilmaisu metastaattisessa lokalisointia hiirten keuhkoihin. Me sekoitettu viisi keuhkot samassa ryhmässä. E. AKT2 ilmaisu metastaattisessa lokalisointia hiirten keuhkoihin. Olemme havainneet Akt2 proteiinin ilmentyminen Kunkin hiiren vastaavasti. 30 ug kokonais-proteiinia käytettiin kunkin näytteen.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 kuviossa. Solunelinkykyisyysmääritys ennen etäpesäkkeiden koetta.
Solunelinkykyisyysmäärityksen suoritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0130124.s002
(TIF)
S3 kuviossa. Adensitometric analyysi kuvion 4E.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0130124.s003
(TIF) B S1 Taulukko. Mahdolliset kohdegeenien miR-137.
Potentiaali kohdegeenien miR-137 ennustettiin linjalla ohjelmistojen ja havaita dual lusiferaasireportterigeenillä määritys ja Länsi bloting.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0130124. S004
(DOCX) B

Kiitokset

kirjoittajat kiittää tohtori Chengyuan Feng Cancer sairaala, kiina Academy of Medical Sciences teknistä apua ja artikkeli tarkistamista.

• PLoS ONE: tunnistaminen ja karakterisointi CXCR4-Positive mahasyövän Stem Cells
• PLoS ONE: Tällä MicroRNA-217 toiminnot mahdollisena Kasvain vaimennin mahasyövän by Targeting GPC5