Ploche ONE: microRNA-137 Prispieva k tlmený nádorového rakoviny žalúdka Human zacielením Akt2

Abstraktné

miRNA zohrávajú dôležitú úlohu pri vzniku nádorov. Táto štúdia sa zamerala na skúmanie účinkov a má regulačný mechanizmus miRNA-137 na biologické správanie rakoviny žalúdka. Celková RNA bola extrahovaná z tkaniva z 100 pacientov s rakovinou žalúdka a zo štyroch žalúdočných nádorových bunkových línií. Expresie MIR-137 bola detekovaná pomocou PCR v reálnom čase od 100 pacientov. Účinky MIR-137 nadmernú expresia na žalúdočné rakovinové bunky "proliferácie, apoptózy, migrácia a invázia schopnosti boli skúmané in vitro a in vivo. Cieľový gén MIR-137 bolo predpovedané Targetscan na trase softvér, tienené dvojitým testom reporterového génu luciferázy a preukázaná westernovým prenosom. V dôsledku toho je expresia MIR-137 bolo významné znížená v žalúdočnej rakovina bunkovej línii HGC-27, HGC-803, SGC-7901 a MKN-45, rovnako ako v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní s GES-1 bunky, alebo uzavreté priľahlé non -neoplastic tkaniva ( p Hotel <0,001). Znovuzavedenie MIR-137 do buniek karcinómu žalúdka bola schopná inhibovať bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu. Pokusy in vivo preukázali, že mier-137 nadmerná expresia môže viesť k zníženiu proliferácie žalúdočnej rakovinových buniek a metastáz. Bioinformatic a western blot analýza ukázala, že mier-137 sa správal ako tumor supresorových rolí na rakovinových bunkách žalúdka cez zacielenie Akt2 a ďalej ovplyvnilo zlé a GSK-3p. Na záver, mier-137, ktorý je často down-regulovaný u rakoviny žalúdka sa potenciálne podieľa na vzniku nádorov žalúdka rakoviny a metastáz regulovaním súvisiacich Akt2 signálnych dráh

Citácia :. Wu L, J Chen, Ding C, Wei S, Zhu Y, Yang W, et al. (2015) microRNA-137 Prispieva k tlmený nádorového rakoviny žalúdka Human zacielením Akt2. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10,1371 /journal.pone.0130124

Akademický Strih: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Spojené štáty

Prijaté: 15. augusta 2014; Prijaté: 18. mája 2015; Uverejnené: 23. júna 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

financovania: .. Táto práca bola podporená lekárskej vedy a techniky výskumných projektov provincie Che-nan, Čína (2011030004)

Konflikt záujmov autori majú vyhlásila, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú.

Úvod
rakovina

žalúdka (GC) je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete [1]. Tak ďaleko, mechanizmus žalúdočné karcinogenézy je do značnej miery neznámy. Vedci sa pokúsili študovať GC z hľadiska biochémie a molekulárnej biológie, že niektoré nádorové supresorové gény a gény nádorové súvisiace boli hlásené v GC. MikroRNA (miRNA) sú endogénne malé nekódujúca RNA o 18 ~ 22 nukleotidov, ktoré boli identifikované ako posttranskripční regulátory génovej expresie [2, 3]. Mierny hrajú kľúčovú úlohu v mnohých biologických procesoch, ako je proliferácia, vývoja, diferenciácie a apoptózy. Medzitým, miRNA boli validované pôsobiť ako onkogény alebo supresorové gény nádoru pri vzniku nádorov. Napríklad, mier-31 bol identifikovaný ako onkogén v pažeráku spinocelulárneho karcinómu [4] a mier-451 funguje ako nádorový supresor do ľudského nemalobunkového karcinómu pľúc [5]. Existujú tiež boli identifikované v súvislosti s rakovinou žalúdka deje a vývoja [6-13] Mnoho microRNA. Bolo tiež zistené, že nadmerné expresie MIR-1, MIR-20a, MIR-27a, mier-34a a mier-423-5p môžu byť použité ako diagnostické kritériá rakoviny žalúdka [14] .Preto, miRNA sú potenciálny kandidáti nových diagnostických biomarkerov alebo terapeutických cieľov rakoviny žalúdka.

microRNA-137 (MIR-137) bolo hlásené, že je down-regulovaná a hrajú úlohu ako nádorový supresor u kolorektálneho karcinómu a rakoviny ústnej [15, 16]. Avšak funkcie Mir-137 a jeho mechanizmus stojaci žalúdočné karcinogenéze stále nie sú celkom jasné. Chen et al ukázala, že mier-137 sa môže hrá ako nádorový supresor zacielením Cdc42 na reguláciu bunkového cyklu u karcinómu žalúdka [17]. Aj tak je to jednoznačne sa nám, že microRNA reguluje biologické správanie viacnásobnú cestu tak, aby tam mohol byť väčší regulácia mechanizmus MIR-137 k GC vzniku nádorov. V tejto štúdii sme merali expresiu MIR-137 v 100 pacientov s rakovinou žalúdka a skúmali úlohu Mir-137 vo buniek karcinómu žalúdka. Zistili sme niektoré ďalšie funkcie Mir-137 v GC, ako aj inou cestou cestu, ktorú MIR-137 hrajú úlohu nádorového supresor v GC vzniku nádorov.

materiáloch a metódach

tvrdenie etika

Všetky ľudské štúdie boli schválené príslušné etické komisie a boli preto vykonané v súlade s etickými normami. Všetky osoby, ktoré dali informovaný súhlas pred ich zaradením do štúdie.

Pacienti a vzorky

vzorky rakovina žalúdka u ľudí boli zhromaždené z chirurgických vzoriek od 100 pacientov (muži 56, žena 44) s GC na Cancer Institute a nemocnice, Prvý pridružená nemocnica v Che-nan univerzity; Druhý nemocnice ľudovej oslobodeneckej armády Číny; Hebei Hospital Cancer. Vzorky nenádorových z makroskopického nádoru rozpätie boli izolované v rovnakom čase a použité ako spárovaných priľahlé non-neoplastických tkanivách. Všetky vzorky boli rozdelené na dve časti. Vzorky tkaniva boli odobraté okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku a skladované pri -80 ° C až do extrakcie RNA. Využitie tkanivových vzoriek pre všetky experimenty bola schválená etickou rady Ústavu základných lekárskych vied, čínskej akadémie lekárskych vied. Všetci účastníci predpokladu, že ich slovná informovaný súhlas k účasti na tejto štúdii a ich verbálny informovaný súhlas boli napísané dole. Tento onsent proces bol tiež schválený etickou doske. Štyri žalúdočné rakovina bunkové línie (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 a MKN-45), boli všetky zachované v našom laboratóriu a udržiavané v DMEM alebo 1640 s 10% FBS.

extrakcie RNA, syntéza cDNA a real-time PCR testy

Celková RNA z tkanív a buniek bola extrahovaná metódou TRIzolu (Ambion, USA) úplne postupujte podľa pokynov. Jednoreťazcový cDNA bol syntetizovaný M-MLV (Ambion, USA) za použitia 2 ug celkovej RNA ako templátu. Oligo (dT) 18 bol použitý pre reverzné transkripciu mRNA, zatiaľ čo driek slučka používa pre miRNA. Real time-PCR (RT-PCR) bola vykonaná pomocou Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) za použitia SYBR mixu (Tiangen, Čína). Tento stav bol PCR: 95 ° C x 30 s, nasleduje 40 cyklov 95 ° C x 5 s, 60 ° C x 34s. Pre mRNA, GAPDH bola použitá ako kontrola normalizované. Pre miRNA, U6 snRNA bol použitý pre kontrolu miRNA. Relatívna expresia MIR-137 bol vypočítaný metódou 2-ΔΔCT. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1.

plazmidovej konštrukcie

prekurzorov sekvencie MIR-137 generované žíhaním a Mir-137-prekurzor-F a mier-137-prekurzor-R predĺženie bolo medzitým štiepený BamHI a BglII, ktorých produkty, ktorý bol vloží do BamHI-BglII fragmentu pcDNA-GW /EmGFP-MIR vektora (GenePharma, Čína). V medziobdobí, negatívna kontrola bola tiež postavená.

Bunková kultúra a transfekcia miRNA

bunkové línie HGC-27, SGC-7901 MKN-45 a GES-1 bol zakúpený od Cell Resource Center of Institute of základných lekárskych vied, čínskej akadémie lekárskych vied a Peking Union Medical College (Peking, Čína). Ľudské žalúdočné bunkové línie HGC-27, SGC-7901 a MKN-45 boli kultivované v médiu RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) doplnené 10% fetálnym hovädzím sérom a ľudskej žalúdočnej epitel bunkové línie GES-1 bola udržiavaná v médiu DMEM ( Gibco, BRL, UK) médiá. MIR-137 napodobňovať a zhon napodobniť, ktorý je non-homológne s ľudským genómom boli syntetizované GenePharma (Shanghai, Čína) a transfekována do buniek do konečnej koncentrácie oligonukleotidy 10nmol /l. Všetky bunkové transfekcia boli zavedené DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, USA) v súlade s použitou pokynov výrobcu. Pre každú transfekciu buniek boli vykonávané dva alebo tri pokusy replikácie.

bunkovej proliferácie a apoptózy test

testu proliferácie buniek bola vykonaná metódou CCK8 (DOJINDO, Japonsko). Stručne povedané, asi 5000 MIR-137 napodobňovať transfekované bunky a bunky boli ťahanice resp vrúbľovať do 96-jamkové doštičky a kultivované. Proliferačnej rýchlosti boli stanovené pri 0, 12, 24, 48, 72, 96 hodín po transfekciu pridaním 10 ul CCK8 regentom a testovaný v súlade s rukopismi. Apoptóza testy boli testované v HGC-27 a SGC-7901 bunkové línie s alebo bez nadmernej expresie MIR-137 sadou apoptóza detekcie I (BD Biosciences, USA) a C6 prietokového cytometra (USA).

Migrácia buniek a invázie testy

Uskutočnili sme test pre hojenie rany otestovať migráciu buniek schopnosť s alebo bez Mir-137 transfekcia. Umelé Rany boli vyrobené na konfluentní monovrstvy buniek s FBS voľné, s použitím 200 ul pipety na 24 hodín po transfekciu MIR-137. Snímky boli príslušne prijatá na 0, 12, 24 a 36 hodín po vytvorení rany.

sme potom vykonáva transjamkových testy na vyhodnotenie schopnosti invázie buniek. 5 x 10 ^{4 buniek suspendovaných v 200 ul média bez FBS boli umiestnené na hornej komory každej vložky sa 430μl 1 mg /ml Matrigelu (Millipore, USA). 600μl médium s 10% FBS ako nutričný atraktantu bol umiestnený do spodnej komory. Po 24 hodinách boli bunky prichytené na dolnej povrch komôrky boli upevnený 20 min 20% metanolu a farbené počas 10 minút s 10% maygruwald-Giemsa (MGG). Invázne Membrány potom boli rúbať a vložené pod krycie sklíčka. počítajú sme bunky v 3 rôznych videnie poliach v stave s 20 x magna fi kácie, ktoré potom boli použité ako priemerný počet buniek. Všetky testy boli vykonané v troch nezávislých experimentoch.}

Experiment

Experimenty zahŕňajúce zvieratami sa vykonávali podľa príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat a inštitucionálnych etických smerníc pre pokusy na zvieratách. Protokol bol schválený Výborom pre etiku pokusov na zvieratách vačiek (Čínskej akadémie lekárskych vied) (Povolenie číslo: C72-14-0664). Všetky operácie sa vykonávajú v pentobarbitalu sodného narkóze, a boli vykonané všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia. Ťahanice transfekciou a mier-137 nadmerná expresia bunky HGC-27 (5 x 10 ^{6 buniek) boli Inokulované S.C. do chrbtových bokov Balb /c nahých myší (samice Nu /Nu, 6 týždňov staré), z ktorých všetky boli zakúpené od Animal centra Henan University a zdvihnutý v podmienkach bez patogénov. Objem nádoru bol meraný počas 5 týždňov. Všetky myši boli usmrtené a S.C. Nádory boli resekovány a bola testovaná hmotnosť nádorov. Pre experimenty metastáz in vivo, HGC-27 bunky boli zbierané 24 hodín po transfekciu. Test životaschopnosti buniek bola vykonaná za použitia XTT testu kit24 hodín po transfekciu v súlade s pokynmi výrobcu (Roche, Tokio, Japonsko). Potom sa myši (samice Nu /Nu, 6 týždňov staré) boli injikované bunkami HGC-27 s alebo bez Mir-137 nadmernou expresiou cez chvostovej žily sa 2 x 10 5 buniek v PBS. Bunky HGC-27 boli upravené, ktorý môže stabilne vyjadriť luciferázy (postavený génoch, Shanghai, Čína). Bunky boli kontrolované mikroskopicky, aby sa ubezpečil, že bunky boli v dobrom stave. Po šiestich týždňoch, Bioluminiscencia imaging bolo vykonané pomocou hodnôt Ivis spektra a imidž žiarivosť boli normalizované pomocou životným obrazom (Caliper Life Science, USA).}

Imunohistochémia

Tkanivá boli vložené do parafínových rezov a spracuje 2 hodiny pri teplote 65 ° C a potom deparaffinised. Pred nanesením primárnych protilátok pri teplote 4 ° C cez noc, sme vykonali krok načítanie antigén. Po ktoré boli rezy inkubované s sekundárnou protilátkou asi 2 hodiny pri teplote 25 ° C, konjugovanej s HRP (1: 100; Zhongshanjinqiao, Čína). Liquid DAB + Substrát (zsgb-bio, Čína) bol použitý na detekciu aktivity HRP.

Luciferase miRNA cieľ reportér test

Plná dĺžka 3'UTRs ľudských Akt2 mRNA boli každý PCR amplifikovaný a klonovaný do pMIR-REPORTTM Luciferase Reporter Vector (Ambion, USA) pre generovanie reportérov. Mutácie predpokladaných oblastiach nukleace vo sekvencií mRNA boli vytvorené s použitím primérov, vrátane mutovaných miest. HEK-293T bunky boli vrúbľovať do 24-jamkových doštičiek (1 x 10 ^{5 buniek na jamku), deň predtým, než boli vykonané transfekcia. Bunky (~ 70% konfluentní) boli transfekovány PRL-TK Luciferase reportérov (50 ng /jamku), PGL-3firefly luciferázy (10 ng /jamku), a napodobňovať-137 (50 nmol /L, GenePharma, Shanghai, Čína), alebo vyškriabať (50 nmol /l), za použitia Lipofectamine 2000 aktivity (Invitrogen) .Luciferase boli merané za použitia duálneho Luciferase Reporter Assay (Promega, USA).}

Western blotting

Proteíny boli separované na 10% SDS-PAGE a prenesené na 0,45 um PVDF membrány (Amersham, UK). Membrány boli inkubované s 5% odtučneným sušeným mliekom cez noc pri teplote 4 ° C a s anti-Akt2 monoklonálne protilátky (Proteintech, USA) v riedení 1: 1000; anti-Bad monoklonálna protilátka (Bioworld, USA) v riedení 1: 500; anti-GSK-3B polyklonálna protilátka (Bioworld, USA) pri zriedení 1: 1000; anti-GAPDH protilátka (Proteintech, Chicago, USA) v pomere 1: 30.000 riedenie. Po dvojitom premytí TBST, boli membrány inkubované s kozie anti-králičie protilátkou (zsgb-bio, Čína) na 1: 5000 a 1 :. 50000 riedenie po dobu 2 hodín

štatistiky

Každá pokus bol opakovaný aspoň trikrát. t testu študenta (dvojstranný) a x ^{2 testy boli vykonané, a štatisticky významná hladina bola stanovená na alfa = 0,05 obojstranne). Priemer ± SD je zobrazený na obrázkoch.}

Výsledky

MIR-137 je down-regulovaný v rakovinových bunkách žalúdočnej a klinických vzoriek

sme prvú skúmali expresiu zrelej Mir -137 do 4 rakovina žalúdka u bunkových línií (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 a MKN-45) a žalúdočného epitelu (GES-1). Tieto GC bunkové línie vystavené mimoriadne nízka expresie MIR-137 v porovnaní s bunkovou líniou GES-1 (obr 1A). Pre ďalšie štúdium vzťah MIR-137 s výskytom GC sme zistili expresiu MIR-137 v 100 klinických pacientov (mužských 56, žena 44, priemerný vek 53 rokov), ktoré TaqMan sondy-poháňané real-time PCR, ako je popísané vyššie. 100 vzoriek GC, expresie MIR-137 sa down-regulované v 77 prípadoch (77%) v porovnaní s okolité tkanivá, kedy sa hraničná hodnota stanovená ako 1,5. Medzitým, mier-137 bol up-regulované v 23 prípadoch (23%) (obr 1B a 1C). Všeobecne platí, že expresia Mir-137 v GC tkanivách bola nižšia ako v okolitých tkanív v štatisticky významné rozdiely (p = 0,00079, párový t-test, dvojstranný, obr 1C). Tiež sme našli štatisticky významnú súvislosť medzi expresiou Mir-137 a rakoviny žalúdka klinického štádia. Pacienti, ktorí majú nižšiu hladinu MIR-137 expresia boli spojené s high-grade a neskoré-predstaviť nádorov (obr 1D). Tieto výsledky ukazujú, že zmeny v Mir-137 by mohli byť zapojené do progresie rakoviny žalúdka.

MIR-137 inhibuje proliferáciu buniek in vitro a in vivo

transfekovány sme MIR-137 napodobňujú do bunkových línií GC HGC-27 a SGC-7901, obaja ktorý preukazuje svoju účinnosť transfekcia (obr 2A). Výsledky testov rastu CCK8 na 0, 1, 2, 3 a 4 dni po Mir-137 a šifrovacím transfekciu sú znázornené na Obr 2B. V porovnaní s šifrovacím transfekciu, MIR-137 transfekcia výrazne znižuje proliferáciu oboch bunkových línií (obr 2B). Potom sme skúmali vplyv Mir-137 na bunkovej apoptózy. Skoré apoptotické bunky v skupine s šifrovacím bolo asi 10% do HGC-27 a 2,9% v SGC-7901, zatiaľ čo po MIR-137 transfekcia, percento skorých apoptotických buniek bola zvýšená na 17,5% v HGC-27 a 8,3% v roku SGC-7901, čo výrazne ukázal rozdiel (obr 2C). Z týchto výsledkov možno vyvodiť záver, že mier-137 by mohla potlačiť prežitie rakoviny pľúc buniek indukciou skoré apoptózy.

Pre ďalšie overenie zistení vyššie uvedeného modelu in vivo bola postavená. Zistili sme, že rast nádoru v myšiach nadmerná expresia MIR-137 výrazne pomalší ako u kontroly (obr 2D, 2E a 2G). V súlade s krivkou rastu nádoru, závažia nádorov vyvolaných zakódovanie bunky boli významne vyššie ako u MIR-137 nadmernej expresie (obrázok 2F). Tieto výsledky ďalej potvrdili, že mier-137 nadmerná expresia by mohla obmedziť šírenie žalúdočné rakovinových buniek in vivo.

MIR-137 inhibuje migráciu a inváziu buniek in vitro a in vivo

ďalej vyhodnocujú efekty mir-137 o migrácii buniek a invázie, ktoré boli kľúčové determinanty malígny progresie a metastáz. Účinky Mir-137 na migráciu buniek bola preukázaná testom hojenie rán /scratch v HGC-27 a SGC-7901 buniek. Obe z dvoch bunkových línií liečených MIR-137 mimických boli výrazne nižšie ako sťahovavé šifrovacím ovládanie alebo neošetrených buniek na 12, 24 a 36 hodín po poškriabaniu (obr 3A). Ďalej sme vykonali test invázie buniek pre meranie smerových invázie schopnosti buniek po MIR-137 nadmernej expresie. V dôsledku toho sa invasiveness buniek transfektovaných s Mir-137 Mimic sa dramaticky znížila v porovnaní s bunkami v zakódovanie HGC-27 a SGC-7901 (obr 3B). Potom, experimenty in vivo boli použité k ďalšiemu overenie tohto výsledku. Po prvé sme preukázali, že bunky transfekované s Mir-137 napodobovať alebo napodobňovať ovládanie nevykazovali významný pokles životaschopnosti buniek v porovnaní s neošetrenými bunkami. Tiež neexistuje žiadny rozdiel v životaschopnosti buniek medzi bunkách transfekciou MIR-137 mimických v porovnaní s negatívnou kontrolou (obr S2). Ako je znázornené na obr 3C je bioluminiscenční zobrazovanie myší v skupine nadmerná expresia MIR-137 vykazovali oveľa menšie obrázok. Tiež počet pľúcnych metastáz na myší v skupine Mir-137 vykazovali podstatne nižšiu úroveň v porovnaní s šifrovacím skupinu, ktorá naznačila, že mier-137 by mohol potlačiť metastáz in vivo. Tieto výsledky ukázali, že mier-137 hrá dôležitú úlohu v regulácii migrácie buniek a invazívnosť u karcinómu žalúdka a navrhol, že down-regulácia MIR-137 by mohli prispieť k nádorových metastáz v žalúdočnej rakoviny.

MIR-137 sa zameriava na Akt2 v GC

miRNA vykonané biologické funkcie cez negatívne regulovať svoje cieľové gény. Ako bolo predpovedané, tam bol komplementarita medzi moje-MIR-137 a Akt2 3'-UTR (obr 4A).

Ak chcete testovať hypotézu, že Akt2 by mohol byť terčom Mir-137, reportér plazmid nesúci divý -typ 3'-UTR oblasť Akt2 prúdu luciferázy kódujúce oblasti (obr 4A, AKT2_WT) bol postavený. HEK-293T bunky boli kotransfekovány s reportérovým plazmidom (AKT2_WT) a súperenie. Výsledkom je, že mier-137 transfekované bunky vykazovali výrazné zníženie (≈58% teórie) luciferázové aktivity (obrázok 4B). Potom sa rovnaký test bol vykonaný na ďalší reportérovým plazmidom, ktorý obsahuje mutovaný Akt2 3'-UTR vo väzobných miest Mir-137. Ako sa dalo očakávať, inhibíciu luciferázové aktivity pomocou MIR-137 sa čiastočne odstráni väzobné miesto 1 alebo väzba citovať 2 mutant a takmer zrušený v AKT2_MUT dvojitého mutanta, čo naznačuje, že konzervovaný región bol plne zodpovedný za mier-137 funkcia (obr 4B) .

Ak chcete ďalej skúmať interakciu medzi Mir-137 a Akt2, HGC-27 a SGC-7901 bunky boli transfekovány MIR-137. Expresia Akt2 mRNA bola stanovená pomocou PCR v reálnom čase. Žiadny významný rozdiel bol pozorovaný medzi MIR-137 liečených a zhonu liečených alebo neliečených HGC-27 a SGC-7901 buniek (obr 4C). Potom, western blot analýza bola vykonaná na meranie úrovne Akt2 proteínu. Zistili sme, že expresia Akt2 proteínu bola dole upravená v Mir-137 ošetrených HGC-27 a SGC-7901 bunkách, ale nie v vyškriabať či neošetrených buniek (obr 4D). Tieto údaje naznačujú, že mier-137 priamo uznáva, že 3'-UTR Akt2 mRNA a inhibuje Akt2 preklad. Tak sa regulované Mir-137 v karcinómu žalúdka inhibuje potlačenie Akt2, čo spomalí tumorigeneze.

Akt2 je členom rodiny AKT. Ďalej sme zistili jej následné efektory Bad a GSK-B. V dôsledku toho p-Bad a p-GSK-B zrejme dole regulované MIR-137 ošetrených HGC-27 a SGC-7901 bunky v porovnaní s zakódovanie ošetrených alebo neošetrených buniek. Žiadna významná zmena bola nájdená v non-fosforylovaného zlý alebo GSK (obr 4E). Tieto nálezy naznačujú, že zrýchlený rast rakovinových buniek žalúdka bolo čiastočne kvôli nadmernému actived Akt dráh. Okrem podpory proliferáciu buniek, actived Akt by tiež fosforylovať zlé Ser112 a Ser136, že blokuje bunkovú smrť Bad indukovanej. Pri absencii fosforylácie v týchto miestach, Bad je myšlienka k interakcii s Bcl-XL vyvolať bunkovú smrť. Na rozdiel od toho Akt sprostredkovaná hyperfosforylace Bad môžu podporovať prežívanie buniek v rakovinové bunky. Naše westernový prenos výsledky potvrdili vyššie špekulácie, že zmena nádorových bunkových aktivít žalúdočných v stave Mir-137-transfekciou buniek by mohla byť dôsledkom zníženej fosforyláciu Bad. Ďalej sme analyzovali hladiny proteínové Akt2 v 12 GC patientsin ktorých MIR-137 sa down-regulované. Z týchto vzoriek, Akt2 bola up-regulovaná in9patientsin ich GC tkanivách (obr 4F).

Obnova Akt2 priviedlo k aktivácii invázie a potlačenie apoptózy

Aby sa ďalej preukázať role Mir-137 a Akt2 hrá pri vzniku nádorov, sme skúmali účinok obnovenie Akt2 v Mir-137 transfektovaných buniek. Western blot ukázala, že hladina proteínu v Akt2 Akt2 nadmerná expresia vzorky bola zrejme vyššia ako u negatívnej kontroly aj za potlačenie MIR-137. Obnova Akt2 priviedlo k aktivácii invázie a potlačenie apoptózy (obrázok 5).

Diskusia

miRNA sú často uvádzané ako často ich poškodenia v rôznych ľudských nádorov a niektoré miRNA má i boli použité použité ako terapeutické ciele rakoviny. Tieto výskumy týkajúce sa vzťahu medzi miRNA a rakoviny by nám mohla pomôcť s pochopením rakoviny.

Existuje len málo výskumov poukazujúce úlohu MIR-137 hrali v karcinómu žalúdka. Bolo oznámené, že mier-137 je negatívny regulátor Cdc42 a zameraním, ktoré indukciu apoptózy a bunkového cyklu G1 zástavu vo buniek karcinómu žalúdka [17]. Nariadenie však vplyv microRNA u rakoviny je pomerne zložitá. Zdá sa nemožné, že mier-137 reguluje žalúdočné rakovinu pri jednotnom dráhy. V tomto výskume, funkcie a mechanizmu, ktorý MIR-137 regulovaným rakovinu žalúdka bola ďalej skúmaná.

Po prvé, sme zistili expresiu MIR-137 zo 100 pacientov a zistili, že expresia MIR-137 je výrazne dole -regulated vo vzorke rakoviny. Tiež sme našli štatisticky významnú súvislosť medzi expresiou Mir-137 a rakoviny žalúdka klinického štádia. Tieto výsledky ukazujú, že zmeny v Mir-137 by mohli byť zapojené do progresie rakoviny žalúdka. Snažili sme sa nájsť vzťah medzi Mir-137 a pacienti 'veku a pohlavia, ale nebol nájdený žiadny štatistický výsledok. Vzhľadom k tomu, táto štúdia ukázala, že expresia MIR-137 sa down-regulované vo väčšine tkanív GC v porovnaní s okolitého tkaniva (77%), môžeme uvažovať o diagnostike a prognostické využívanie MIR-137. Ďalej validácia v prospektívnych štúdiách je oprávnená a prístupnejšie vzorky zdrojov, napríklad MIR-137-obohatené exosomy nádor odvodený z krvi, by mali byť vyšetrené. Rovnako je potrebné poznamenať, že do istej miery odrezaní hodnota (cut off = 1,5), rozhodli sme mohli byť ešte ľubovoľná. Keď to bolo nastavené vyššie, tam mohol byť menej pacientov s Mir-137 sa regulovaná v nádorových tkanivách. Avšak aj v tomto stave, došlo k asi 23% z rakoviny majú vysokú expresiu MIR-137. To môže byť v dôsledku individuálne rozdiely medzi pacientmi, že niektoré z osôb môžu mať iný vzor génovej expresie pri vzniku nádorov alebo rakoviny progresie.

Keďže expresie Mir-137 v GC tkanivách bola nižšia ako v susedných tkanív štatisticky významné rozdiely (p = 0,00079), mohli by sme špekulovať, že tento výraz vlastnosť bola spojená s vývojom rakoviny. Tento špekulácie bolo potvrdené in vitro a in vivo štúdií, že mier-137 môže negatívne regulujú bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu. Úroveň expresie MIR-137 môže udržiavať na vysokej úrovni po dlhú dobu po transfekciu a to ako v žalúdku nádorových bunkových línií, štepov tumorov konečnom štádiu a inmetastatic mieste v pľúcach (S1A Fig-S1C Obr). Metóda však nadmerná expresia vedie k veľmi vysokej hladiny expresie MIR-137 (obr 2A). Táto vysoká úroveň MIR-137 môže spôsobiť ďalšie efekty. Napríklad, mier-137 je negatívny regulátor Cdc42 a zacielenie, ktorá indukciu apoptózy a bunkového cyklu G1 zástavu vo buniek karcinómu žalúdka [17]. Vzhľadom k tomu, Mir-137 v našej štúdii bola up-regulovaná tisíckrát, môže to viesť k inhibícii iných cieľov, ako sú Cdc42. Je zrejmé, že v tejto štúdii nemožno vylúčiť možnosť, že nádorového supresor účinky MIR-137 sa sprostredkovaného potlačenia iných cieľových génov.

Potom sme zistili, že mier-137 pôsobí ako supresorového génu nádoru prostredníctvom zacielenia Akt2 , ktorý je členom rodiny AKT. Obnova Akt2 spôsobuje až regulácia Akt2 v Mir-137 buniek po transfekciu, čo je oveľa vyššia ako v súperení. To môže vzhľadom k tomu, že nadmerná expresia Akt2 obrátil hladinu MIR-137 proteínu potlačená. Dôležitejšie je, že obnova Akt2 reguluje apoptózu a invázii buniek karcinómu žalúdka, čo vedie k aktivácii invázie a potlačenie apoptózy (obrázok 5). Tento záchranný pokus poskytuje ďalší dôkaz, že aktívne bunky apoptózy Mir-137 a negatívne regulovať invázie buniek zacielením Akt2. In vivo pokusy tiež ukázali, že expresia MIR-137 je negatívny vo vzťahu k výrazu Akt2 (S1D obr S1E a Obr). AKT je kľúčovým faktorom PI3K /Akt spôsobom cesty. Nadol regulácia Akt2 ďalej ovplyvňuje jeho dole-stream proteín Bad a GSK-3B, že p-Bad a p-GSK-B bol zrejme dole regulovaná. Bad môžu hrať svoje "role fosforyláciou a ďalej reguluje bunkový osud [18]. GSK-3B, ktorý je tiež známy ako GSK-3p sa obvykle reguluje migráciu buniek a inváziu. Na záver, sme identifikovali spojenie medzi Mir-137 a Akt2, ktorý je nová zložka žalúdočné rakoviny vzniku nádorov. MIR-137 bolo preukázané, že súvisí s reguláciou Akt2 [19]. V hepatocelulárneho karcinómu, MIR-137 inhibuje rast rakovinových buniek a metastáz cez priamo cieľovaniu Akt2 [20]. V skutočnosti sme e boli premietané 8 gény ako potenciálnych cieľov MIR-137 (S1 tabuľka). Avšak, Akt2 je jediným priamym cieľom MIR-137 po dvojaký luciferázového reportérového génu testu a western blot vyšetrovanie. Z obr 4D nájdeme thatmiR-137 môže mať vplyv na Akt2 a p-AKT2in obaja HGC-27 a SGC-7901 bunky. Ale zaujímavé, že v SGC-7901 je stav fosforylácie bola zrejme ovplyvnená viac. Tento jav možno pozorovať trvalo v troch opakovaných škvrny sme vykonaných. odpočíta sme, že by mohol byť vzhľadom na špecifické vlastnosti rôznych nádorových buniek. Tam by mohlo byť špecifická regulácia cesta spôsob, Mir-137 v SGC-7901, ktorý potlačil fosforylačných štatút AKT2.However, zo súčasného výskumu, nemôžeme plne vysvetliť tento mechanizmus. Keď sme vybrali pacientov, ktorí majú nízky počet expresie MIR-137 vo svojom GC tkanive pre detekciu expresie proteínu Akt2, sme zistili, väčšina z týchto pacientov (9/12), majú vysokú úroveň Akt2 vo svojom GC tkaniva. Tento výsledok ukazuje, že mier-137 by sa mohli zamerať Akt2 u pacientov. Tam boli tiež traja pacienti, ktorí majú nízku expresiu v Akt2 GC tkanive aj keď je expresia MIR-137 je nízka. Tento výsledok sa môže vzhľadom k individuálne rozdiely medzi pacientmi.

Na záver, naše expresie a funkčné štúdie naznačujú, že mier-137 je často down-regulovaný u karcinómu žalúdka môže pôsobiť ako nádorový supresor v GC buniek, znovu zaviesť expresie na GC buniek potlačená proliferácie žalúdka rakovinových buniek, migráciu a inváziu priamo cielenie Akt2. Tak, naša práca je dobrým doplnkom k predchádzajúcej práci a je užitočné pre nás pochopiť MIR-137 regulačný mechanizmus rakoviny.

Podporné informácie
S1 Obr. Mir-137 a Akt2 expresie po transfekciu.
A. MIR-137 expresie v HGC-27 buniek a SGC-7901 buniek 72 hodín po transfekciu. B. MIR-137 expresie v xenografe tumorov konečnom štádiu. C. MIR-137 expresie v metastatické lokalizácii myšiach pľúc. D. Akt2 vyjadrenie v metastatické lokalizácii myšiach pľúc. zmiešané sme päť pľúca spoločne v rovnakej skupine. E. Akt2 vyjadrenie v metastatické lokalizácii myšiach pľúc. Zistili sme expresiu Akt2 proteínu v každej myši, resp. 30 ug celkového proteínu bolo použité pre každú vzorku
doi :. 10,1371 /journal.pone.0130124.s001
(TIF)
S2 Obr. Bunková životaschopnosť test pred metastáz experimentom
Životaschopnosť buniek Test bol vykonaný 24 hodín po transfekciu
doi: .. 10,1371 /journal.pone.0130124.s002
(TIF)
S3 Obr. Adensitometric analýza Obr 4E
doi :. 10,1371 /journal.pone.0130124.s003
(TIF)
S1 Tab. . Možné cieľové gény pre mier-137
potenciálne cieľové gény MIR-137 bolo predpovedané na linke softvér a detekované duálny luciferázového reportérového génu testom a západnej bloting
doi :. 10,1371 /journal.pone.0130124. S004
(DOCX)

poďakovanie

autori ďakujú Dr. Chengyuan Feng z rakoviny nemocnice, čínskej akadémie lekárskych vied pre technickú pomoc a revíziu článku.

• Ploche ONE: Identifikácia a charakterizácia CXCR4-pozitívnej rakoviny žalúdka Stem Cells
• Ploche ONE: Na mikroRNA-217 Funkcie ako potenciálny Suppressor nádoru u rakoviny žalúdka zacielením GPC5