PLoS ONE: MicroRNA-137 Trägt zur Gedämpfte Tumorigenesis in menschlichen Magenkrebs durch AKT2

Abstrakt

MiRNAs eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung spielen. Diese Studie konzentrierte sich die Effekte und Regulationsmechanismus der miRNA-137 auf die biologischen Verhalten von Magenkrebs auf zu erkunden. Gesamt-RNA wurde aus Geweben von 100 Patienten mit Magenkrebs und von vier Magenkrebszelllinien extrahiert. Die Expression von miR-137 wurde durch real-time PCR von 100 Patienten nachgewiesen. Die Auswirkungen von miR-137-Überexpression auf die Magenkrebszellen Proliferation, Apoptose, Migration und Invasion Fähigkeit wurden in vitro und in vivo untersucht. Das Zielgen von miR-137 wurde von Targetscan on line Software vorhergesagt, von Dual-Luciferase-Reporter-Assay gescreent und durch Western-Blot nachgewiesen. Als Ergebnis reduziert die Expression von miR-137 wurde als signifikant bei Magenkrebs-Zelllinie HGC-27, HGC-803, SGC-7901 und MKN-45 sowie im Vergleich Magenkrebsgewebe mit GES-1-Zelle oder benachbarten nicht abgestimmt -neoplastic Gewebe ( p
< 0,001). Die Wiedereinführung von miR-137 in Magenkrebszellen konnte die Zellproliferation, Migration und Invasion zu verhindern. Die In-vivo-Experimente zeigten, dass die miR-137-Überexpression die Magenkrebszellproliferation und Metastasierung reduzieren kann. Bioinformatische und Western-Blot-Analyse zeigte, dass die miR-137 als Tumor-Suppressor-Rollen auf die Magenkrebszellen gehandelt AKT2 durch Targeting und weiter die Bad und GSK-3β zu beeinflussen. Abschließend die miR-137, die häufig herunterreguliert bei Magenkrebs ist potenziell bei Magenkrebs Tumorentstehung und Metastasierung durch Regulierung AKT2 bezogenen Signalwege beteiligt ist

Citation:. Wu L, Chen J, Ding C, Wei S, Zhu Y, W Yang, et al. (2015) MicroRNA-137 Trägt zur Gedämpfte Tumorigenesis in menschlichen Magenkrebs durch AKT2 Targeting. PLoS ONE 10 (6): e0130124. doi: 10.1371 /journal.pone.0130124

Academic Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES

Empfangen: 15. August 2014; Akzeptiert: 18. Mai 2015; Veröffentlicht: 23. Juni 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:.. Diese Arbeit wurde von medizinischen Wissenschaft und Technik Forschungsprojekte der Provinz Henan, China (2011030004)

Konkurrierende Interessen unterstützt wurde: die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Einführung

Magenkrebs (GC) ist von Krebs in der Welt die zweithäufigste Todesursache [1]. Bisher ist der Mechanismus der Magen Karzinogenese weitgehend unbekannt. Die Forscher haben versucht, GC aus der Sicht der Biochemie und Molekularbiologie zu studieren, die einige Tumorsuppressorgene und tumorbezogene Gene in GC berichtet. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine endogen nicht-kodierenden RNAs von 18 ~ 22 Nukleotiden, die als posttranskriptionelle Regulatoren der Genexpression identifiziert worden [2, 3]. MiRNAs spielen eine entscheidende Rolle in vielen biologischen Prozessen wie Proliferation, Entwicklung, Differenzierung und Apoptose. Inzwischen wurden miRNAs als Onkogenen oder Tumorsuppressor-Gene während der Tumorgenese wirken validiert. Zum Beispiel wurde miR-31 als Onkogen in Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus [4] und miR-451 wirkt als Tumorsuppressor in humanen, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs [5] identifiziert. Es gibt auch viele microRNAs wurden im Zusammenhang mit Magenkrebs identifiziert geschieht und Entwicklung [6-13]. Es hat sich auch, dass die Überexpression von miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34a und miR-423-5p berichtet wurden, können als diagnostische Kriterien von Magenkrebs verwendet werden [14] .Daher miRNAs sind potentielle Kandidaten neuer diagnostischer Biomarker oder therapeutische Ziele von Magenkrebs.

MicroRNA-137 (miR-137) wurde gemeldet Rollen als Tumorsuppressor zu sein herunterreguliert und spielen bei Darmkrebs und Mundkrebs [15, 16]. Allerdings sind die Funktion von miR-137 und seinen Mechanismus zugrunde liegenden Magen-Krebsentstehung noch nicht ganz klar. Chen et al zeigten, dass die miR-137 kann spielt als Tumorsuppressor durch CDC42 Targeting Zellzyklus bei Magenkrebs [17] zu regulieren. Trotzdem ist es klar für uns, dass die microRNA biologische Verhalten von mehreren Pfad Weise regelt, dass es mehr Regulationsmechanismus von miR-137 in Richtung GC tumorigenesis sein könnte. In dieser Studie maßen wir die Expression von miR-137 in 100 Patienten mit Magenkrebs und untersucht die Rolle von miR-137 in Magenkrebszellen. Wir fanden einige andere Funktionen von miR-137 in der GC sowie einen anderen Weg Weg durch die miR-137 eine Rolle von Tumor-Suppressor in GC tumorigenesis gespielt.

Materialien und Methoden

Ethik-Anweisung

Alle menschlichen Studien wurden von der zuständigen Ethikkommission genehmigt und wurden daher in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt. Alle Personen gaben ihre informierte Zustimmung vor ihrer Aufnahme in die Studie.

Patienten und Proben

Menschliche Magenkrebs Proben aus chirurgischen Proben von 100 Patienten gesammelt wurden (männlich 56, weiblich 44) mit GC am Cancer Institute und Krankenhaus, erste Krankenhaus von Henan University angeschlossen; das zweite Krankenhaus der Befreiungsarmee von Leuten China; Hebei Cancer Hospital. Nicht-Tumorproben aus makroskopischer Tumorrand wurden gleichzeitig und als den angepaßten benachbarten nicht-neoplastischen Geweben isoliert. Alle Proben wurden in zwei Teile geteilt. Gewebeproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren gesammelt und bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion gelagert. Die Verwendung der Gewebeproben für alle Experimente wurde von der Ethikausschuss des Instituts für Medizinische Grundlagenwissenschaften, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften genehmigt. Alle Teilnehmer zur Verfügung gestellt ihrer verbalen informierte Zustimmung in dieser Studie und ihrer verbalen informiert Zustimmungen abgewertet wurden teilzunehmen. Dieser onsent Prozess wurde auch von der Ethikkommission genehmigt. Vier Magenkrebszelllinien (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 und MKN-45) wurden alle in unserem Labor erhalten und in DMEM gehalten oder 1640 mit 10% FBS.

RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und Echtzeit-PCR-Assays

Gesamt-RNA aus Geweben und Zellen wurde durch Trizol-Methode (Ambion, USA) vollständig nach den Anweisungen extrahiert. Verwendung von 2 &mgr; g Gesamt-RNA als Templat-Einzelstrang-cDNA wurde durch M-MLV (Ambion, USA) synthetisiert. Oligo (dT) 18 wurde für mRNA reverse Transkription verwendet, während Stammschleife für miRNA verwendet. Echtzeit-PCR (RT-PCR) wurde von Bio-rad CFX96 (Bio-Rad, USA) unter Verwendung von SYBR-Mix (Tiangen, China) durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren: 95 ° C × 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C × 5 s, 60 ° C × 34S. Für mRNAs wurde GAPDH als normalisierte Kontrolle verwendet. Für miRNAs wurde U6 snRNA für miRNA Kontrolle verwendet. Die relative Expression von miR-137 wurde durch 2-ΔΔCT Methode berechnet. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt

Plasmidkonstruktion

Die miR-137-Vorläufersequenz, die durch Glühen und miR-137-Vorläufer-F und miR-137-Vorläufer-R Erweiterung inzwischen war verdauten durch BamHI und BglII, die Produkte, die Inserts in die BamHI-BglII-Fragment des pcDNA-GW /EmGFP-miR-Vektor (Genepharma, China) war. In der Zwischenzeit wurde Negativkontrolle auch konstruiert.

Zellkultur und miRNA-Transfektion

Die Zelllinien HGC-27, SGC-7901 MKN-45 und GES-1 wurde aus der Zelle Ressource gekauft Zentrum des Instituts für Medizinische Grundlagenwissenschaften, chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College (Beijing, China). Die menschlichen Magenzelllinien HGC-27, SGC-7901 und MKN-45 wurden in RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) Medium mit 10% fötalem Rinderserum und Human Magenepithel Zellinie GES-1 in DMEM gehalten wurde ( Gibco, BRL, UK) Medien. Die miR-137 mimic und die Scramble-Mimetikum, die mit dem menschlichen Genom nicht-homolog ist, wurden von Genepharma (Shanghai, China) synthetisiert und auf eine endgültige Konzentration von Oligonucleotid 10nmol /L in die Zellen transfiziert. Alle Zell Transfektionen wurden durch DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, USA) eingeführt, entsprechend dem verwendeten Anweisungen des Herstellers. Für jede Zelle Transfektion zwei oder drei Replikation Experimente wurden durchgeführt.

Die Zellproliferation und Apoptose-Assay

Zellproliferationstest durch CCK8 Verfahren (DOJINDO, Japan) durchgeführt wurde. Kurz gesagt, die jeweils in 96-Well ausgesät wurden die etwa 5000 miR-137 mimischen transfizierten Zellen und Gerangel Zellen Platten und kultiviert. Proliferationsraten wurden bei 0 bestimmt, 12, 24, 48, 72, 96 Stunden nach der Transfektion von 10 ul CCK8 Regent Zugabe und nach den Manuskripten getestet. Die Apoptose-Assays wurden in HGC-27 und SGC-7901-Zelllinien mit oder ohne miR-137-Überexpression durch Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, USA) und C6 Durchflusszytometer (USA) getestet.

Die Zellmigration und Invasion Assays

Wir führten die Wundheilungs Assay Zellmigration Fähigkeit, mit oder ohne miR-137 Transfektion zu testen. Die künstlichen Wunden wurden auf der konfluenten Zellschicht mit FBS frei erzeugt, eine 200 ul Pipettenspitze bei 24 Stunden miR-137 Transfektion. Die Bilder wurden jeweils nach 0, 12, 24 und 36 Stunden nach der Wunde Schöpfung.

Wir führten dann Transwell-Assays Zellen Invasion Fähigkeit zu bewerten. 5 x 10 ^{4 in 200 ul Medium ohne FBS suspendierten Zellen auf der oberen Kammer jedes Einsatzes mit 430μl von 1 mg /ml Matrigel (Millipore, USA) gelegt wurden. 600 ul Medium mit 10% FBS als Ernährungs Lockstoff wurde in der unteren Kammer gestellt. Nach 24 Stunden werden die auf der unteren Fläche der Kammer anhaftenden Zellen waren fi 20 min um 20% Methanol XED und für 10 Minuten mit 10% maygruwald-Giemsa (MGG) gefärbt. Die Invasion Membranen wurden dann geschnitten und unter Deckgläsern eingebettet. Wir zählten die Zellen in 3 verschiedenen Sichtfelder in Zustand mit 20 × Magni fi kation, die dann als die durchschnittliche Anzahl der Zellen verwendet wurden. Alle Assays wurden in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt.}

Tierexperiment

Die Versuche Tiere beteiligt sind, wurden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die institutionellen ethischen Richtlinien für Tierversuche gemäß dem Leitfaden durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche der CAMS (Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften) (: C72-14-0664 Zulassungsnummer) zugelassen. Alle Operation wurde unter Natriumpentobarbital Betäubung durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, Leiden zu minimieren. Scramble-transfiziert und miR-137-Überexpression HGC-27-Zellen (5 x 10 ^{6 Zellen) wurden geimpft s.c. in die dorsale Flanken von Balb /c Nacktmäuse (weiblich, Nu /Nu, 6 Wochen alt), die alle aus der Tierklinik der Universität Henan und aufgewachsen in erregerfreien Bedingungen erworben wurden. Das Volumen des Tumors wurde für 5 Wochen gemessen. Alle Mäuse wurden getötet und s.c. Tumoren wurden reseziert und das Gewicht der Tumoren getestet. Für in vivo-Metastase Experimenten HGC-27-Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion gesammelt. Die Zelllebensfähigkeitstest wurde unter Verwendung eines XTT-Assay kit24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt, entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Roche, Tokyo, Japan). Dann die Mäuse (weiblich, Nu /Nu, 6 Wochen alt) wurden mit HGC-27-Zellen injiziert, mit oder ohne miR-137-Überexpression durch die Schwanzvene mit 2 x 10 5 Zellen in PBS. Die HGC-27-Zellen wurden modifiziert, die stabil Luciferase (gebaut von GENECHEM, Shanghai, China) zum Ausdruck bringen können. Die Zellen wurden mit dem Mikroskop geprüft, um sicherzustellen, dass die Zellen in einem guten Zustand waren. Nach sechs Wochen wurde Biolumineszenz-Bildgebung durchgeführt hat eine IVIS Spectrum und Bildstrahlungswerte wurden unter Verwendung normalisiert mit Wohn Bild (Caliper Life Science, USA).}

Immunhistochemie

Die Gewebe wurden in Paraffin eingebettet und Abschnitte behandelt 2 Stunden bei 65 ° C und dann deparaffinised. Vor der Anwendung über Nacht die primären Antikörper bei 4 ° C, führten wir das Antigen-Retrieval-Schritt aus. (:; Zhongshanjinqiao, China 100 1) Danach wurden die Objektträger mit sekundärem Antikörper etwa 2 Stunden bei 25 ° C, konjugiert an HRP inkubiert. Das Liquid DAB + Substrat (zsgb-bio, China) wurde zur Detektion der Aktivität HRP verwendet.

Luziferase miRNA Zielreporterassay

Die volle Länge der 3'UTRs menschlicher AKT2 mRNAs waren jeder PCR amplifiziert und in den PMIR-ReportsTM Luziferase-Reporter Vektor (Ambion, USA) kloniert die Reporter zu erzeugen. Mutationen der vorhergesagten Seed-Regionen in der mRNA-Sequenzen wurden erstellt unter Verwendung von Primern, einschließlich der mutierten Seiten. HEK-293T-Zellen wurden auf 24-well Platten ausgesät (1 × 10 ^{5 Zellen pro Vertiefung) am Tag vor Transfektionen wurden durchgeführt. Die Zellen (~ 70% konfluent) wurden mit pRL-TK-Luciferase-Reporter transfiziert (50 ng /Vertiefung) PGL-3firefly Luciferase (10 ng /Vertiefung) und Mimik-137 (50 nmol /L, Genepharma, Shanghai, China) oder scramble (50 nmol /L) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Luciferase Aktivitäten wurden den Dual Luciferase Reporter Assay gemessen (Promega, USA).}

Western Blotting

Proteine ​​auf 10% abgetrennt SDS-PAGE und dann auf 0,45 &mgr; m PVDF-Membranen (Amersham, UK) transferiert. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch über Nacht bei 4 ° C und mit anti-AKT2 monoklonaler Antikörper (Proteintech, USA) bei 1 inkubiert: 1000 Verdünnung; anti-Bad monoklonaler Antikörper (Bioworld, USA) in 1: 500 Verdünnung; Anti-GSK-3B polyklonalen Antikörper (Bioworld, USA) bei 1: 1000 Verdünnung; anti-GAPDH-Antikörper (Proteintech, Chicago, USA) bei 1: 30.000-Verdünnung. Nach zweimaligem Waschen mit TBST wurden die Membranen inkubiert mit Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper (zsgb-bio, China) in 1: 5000 und 1:. 50000 Verdünnungen für 2 h

Statistik

Jeder Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. t-Test Student (two-tailed) und die x ^{2-Test durchgeführt wurden, und statistisch signifikante Niveau wurde auf α = 0,05 zweiseitig eingestellt). Mittelwert ± SD ist in den Figuren dargestellt.}

Ergebnisse |

MiR-137 wird herunterreguliert in Magenkrebszellen und klinischen Proben

Wir untersuchten zunächst die Expression von reifen miR -137 in 4 menschlichen Magenkrebszelllinien (HGC-27, SGC-7901, SGC-7901 und MKN-45) und Magen-epithelialen Zell (GES-1). Diese GC-Zelllinien außerordentlich niedrige Expression von miR-137 zeigte im Vergleich zum GES-1-Zelllinie (1A). Um die Beziehung von miR-137 mit GC Vorkommen untersuchen, entdeckten wir die Expression von miR-137 in 100 klinischen Patienten (männlich 56, weiblich 44, mittleres Alter 53 Jahre) von TaqMan-Sonde-drived Echtzeit-PCR, wie oben beschrieben. Von 100 GC-Proben wurde die Expression von miR-137 in 77 Fällen nach unten geregelt (77%) im Vergleich zu benachbarten Geweben, wenn der Cut-off wurde als 1,5 eingerichtet. Inzwischen wurde miR-137 in 23 Fällen hochreguliert (23%) (1B und 1C). Im Allgemeinen war die Expression von miR-137 in GC Gewebe geringer als die in benachbarten Geweben in statistisch signifikante Unterschiede (p = 0,00079, gepaarter t-Test, zweiseitig, 1C). Außerdem haben wir einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen der Expression von miR-137 und Magenkrebs klinischen Stadium gefunden. Die Patienten, die die unteren Ebenen von miR-137 Expression haben wurden mit hochwertigen und Spätstadium Tumoren (1D) zugeordnet ist. Diese Ergebnisse zeigten, dass Veränderungen von miR-137 in Magenkrebs Progression beteiligt werden könnte.

MiR-137 Zellproliferation in vitro hemmt und in vivo

Wir transfizierten miR-137 nachahmen in GC-Zelllinien HGC-27 und SGC-7901, welche beide große Transfektionseffizienz (2A) gezeigt. Die Ergebnisse der Wachstumstests CCK8 bei 0, 1, 2, 3 und 4 d nach miR-137 und scramble Transfektionsverfahren sind in 2B gezeigt. Im Vergleich zu Gerangel Transfektion miR-137 Transfektion signifikant reduziert die Proliferation von beiden Zelllinien (2B). Dann untersuchten wir die Wirkung von miR-137 auf Zell-Apoptose. Die frühen apoptotischen Zellen in der Scramble-Gruppe war ungefähr 10% in HGC-27 und 2,9% in SGC-7901, während nach miR-137 Transfektion der Prozentsatz der frühen apoptotischen Zellen auf 17,5% in HGC-27 erhöht wurde, und 8,3% SGC-7901, die deutlich Differenz (2C) zeigte. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass miR-137 durch Induktion der Apoptose frühen Lungenkrebs das Überleben der Zellen unterdrücken konnte.

Nach den Feststellungen oben zu überprüfen, ein in vivo-Modell wurde konstruiert. Wir fanden, dass das Tumorwachstum war deutlich langsamer in der miR-137-Überexpression Mäusen als in den Kontrollen (Fig 2D, 2E und 2G). In Übereinstimmung mit der Kurve des Tumorwachstums, die Gewichte von Scramble Zellen induzierten Tumoren waren signifikant höher als die von der miR-137-Überexpression (Abb 2F). Diese Ergebnisse bestätigten ferner, dass die miR-137-Überexpression die Magenkrebszellproliferation in vivo begrenzen könnte.

MiR-137 Zellmigration und Invasion in vitro hemmt und in vivo

Wir untersuchten die Effekte von miR-137 auf die Zellmigration und Invasion, die die wichtigsten Determinanten der malignen Progression und Metastasierung waren. Die Auswirkungen von miR-137 auf die Zellmigration wurden durch eine Wundheilung /Kratztest in HGC-27 und SGC-7901-Zellen nachgewiesen werden. Beide von zwei Zelllinien, behandelt mit miR-137 mimic waren deutlich weniger als wandernde Scramble-Steuerung oder unbehandelten Zellen bei 12, 24 und 36 Stunden nach dem Kratzen (Fig 3A). Darüber hinaus führten wir Zellinvasion Assay die Richtungs Invasion Fähigkeiten der Zellen nach der miR-137-Überexpression zu messen. Als Ergebnis wurde die Invasivität von Zellen, die mit miR-137 mimischen dramatisch verringert mit den Scramble-Zellen in HGC-27 verglichen und SGC-7901 (3B). Dann wurden in vivo Experimenten verwendet, um dieses Ergebnis weiter verifizieren. Wir haben gezeigt, dass zum einen mit miR-137 mimic oder mimic Kontrolle transfizierten Zellen keine signifikante Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigten. Auch gibt es keinen Unterschied in der Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den mit miR-137-transfizierten Zellen im Vergleich zu mimic Negativkontrolle (S2 Bild). Wie in 3C gezeigt, zeigte die Biolumineszenz-Bildgebung von Mäusen in der miR-137-Überexpression Gruppe ein viel kleineres Bild. Auch zeigte die Zahl der Lungenmetastasen pro Mäuse in miR-137-Gruppe einen signifikant niedrigeren Niveau im Vergleich zu Gerangel Gruppe, die zeigten, dass die miR-137 Metastasierung in vivo unterdrücken konnte. Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-137 eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellmigration und Invasivität bei Magenkrebs gespielt und schlug vor, dass die Herunterregulierung von miR-137 kann auf Tumormetastasen in Magen-Krebsentstehung beitragen.

miR-137 zielt AKT2 in GC

MiRNAs ausgeführt biologische Funktionen durch ihre Zielgene negativ regulieren. Wie vorhergesagt, war es die Komplementarität zwischen has-miR-137 und AKT2 3'-UTR (4A).

Um die Hypothese zu testen, dass AKT2 ein Ziel von miR-137 sein könnte, Beherbergung ein Reporter Plasmid, das das Wild -Typ-3'-UTR-Region von AKT2 stromabwärts des Luciferase-Kodierungsregion (4A, AKT2_WT) konstruiert. HEK-293T-Zellen wurden mit Reporterplasmid (AKT2_WT) und Gerangel cotransfiziert. Als Ergebnis zeigte miR-137-transfizierten Zellen eine deutliche Verringerung (≈58%) der Luciferase-Aktivität (4B). Dann wurde der gleiche Test für einen anderen Reporter-Plasmid durchgeführt mutierte enthält AKT2 3'-UTR in miR-137-Bindungsstellen. Wie erwartet, wurde die Inhibition der Luciferase-Aktivität von miR-137 teilweise mit Bindungsstelle entfernt, 1 oder Bindungs ​​zitieren 2 Mutante und fast in der AKT2_MUT Doppelmutante aufgehoben, was darauf hindeutet, dass die konservierte Region für miR-137-Funktion (4B) vollständig verantwortlich die Interaktion zwischen miR-137 und AKT2, HGC-27 und SGC-7901-Zellen.

wurden mit miR-137 transfiziert weiter zu untersuchen. AKT2 mRNA-Expression wurde durch real-time PCR bestimmt. Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen miR-137 behandelten und Scramble-behandelten oder unbehandelten HGC-27 und SGC-7901-Zellen (4C) beobachtet. Dann wurde Western-Blot-Analyse durchgeführt, das Niveau der AKT2 Protein zu messen. Wir fanden, dass die Expression von AKT2 Protein nach unten in miR-137 behandelt HGC-27 und SGC-7901 Zellen reguliert wurde, aber nicht in scramble oder unbehandelten Zellen (Fig 4D). Diese Daten legen nahe, dass miR-137 direkt mit dem 3'-UTR von AKT2 mRNA erkennt und hemmt AKT2 Übersetzung. So herunterreguliert miR-137 in Magenkrebs hemmt die Unterdrückung von AKT2, die wiederum tumorigenesis abzubremsen.

AKT2 ein Mitglied der AKT-Familie. Wir weiter seine Effektoren Bad und GSK-B nachgewiesen. Als Ergebnis reguliert die p-Bad und p-GSK-B war offenbar nach unten in miR-137 behandelt HGC-27 und SGC-7901-Zellen im Vergleich mit Scramble-behandelten oder unbehandelten Zellen. Keine signifikante Veränderung wurde in nicht-phosphoryliert Bad oder GSK (4E) gefunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die beschleunigte Magenkrebs Zellwachstum wurde teilweise durch die Über actived Akt Wege. Neben der Förderung der Zellproliferation, könnte actived Akt auch Bad bei Ser112 und Ser136 phosphoryliert, Sperrung Bad-induzierten Zelltod. In Ermangelung der Phosphorylierung an diesen Stellen ist Bad dachte mit Bcl-XL zu interagieren, Zelltod zu induzieren. Im Gegensatz dazu kann Akt-vermittelte Hyperphosphorylierung von Bad Überleben der Zellen in Krebszellen zu fördern. Unsere Western-Blotting Ergebnisse bestätigten die obigen Spekulationen, dass die Änderung der Magenkrebszellaktivitäten im Zustand von miR-137-transfizierten Zellen könnte ein Ergebnis werden der Phosphorylierung von Bad verringert. Darüber hinaus analysierten wir die Proteinspiegel von AKT2 in 12 GC patientsin dem miR-137 wurde nach unten reguliert. Unter diesen Proben war AKT2 hochreguliert in9patientsin ihre GC Gewebe (4F).

Die Wiederherstellung von AKT2 verbleit zu einer Aktivierung von Invasion und einer Unterdrückung der Apoptose

Um weiter zu demonstrieren, die Rollen von miR-137 und AKT2 während tumorigenesis gespielt, wir die Wirkung der Wiederherstellung von AKT2 in miR-137 transfizierten Zellen untersucht. Der Western-Blot zeigte, dass die AKT2 Proteinebene in AKT2 Expression Probe als die anscheinend höher war der Negativkontrolle auch unter der Unterdrückung von miR-137. Die Wiederherstellung von AKT2 verbleit zu einer Aktivierung von Invasion und einer Unterdrückung der Apoptose (Bild 5).

Diskussion

miRNAs wurden häufig oft in verschiedenen menschlichen Krebsarten dysreguliert angegeben werden und einige miRNAs hat auch verwendet als therapeutische Targets von Krebs eingesetzt werden. Die Untersuchungen der Beziehung zwischen miRNAs und Krebs beziehen uns mit dem Verständnis von Krebs helfen könnte.

Es gibt nur wenige Untersuchungen, die Rolle miR-137 spielte bei Magenkrebs bezieht. Es wurde berichtet, dass die miR-137 ein negativer Regulator von Cdc42 ist und indem sie auf dem zur Induktion von Apoptose und Zellzyklus-G1-Arrest in Magenkrebszellen [17]. Allerdings ist die Regulierung Wirkung der microRNA in der Krebs ziemlich kompliziert. Es scheint unmöglich, dass die miR-137, um die Magenkrebs durch den einzigen Weg reguliert. In dieser Forschung, die Funktion und Mechanismus, der miR-137 Magenkrebs geregelt wurde weiter untersucht.

Zuerst entdeckten wir die Expression von miR-137 in 100 Patienten und stellte fest, dass die Expression von miR-137 deutlich nach unten ist in der Krebsprobe -regulierte. Außerdem haben wir einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen der Expression von miR-137 und Magenkrebs klinischen Stadium gefunden. Diese Ergebnisse zeigten, dass Veränderungen von miR-137 in Magenkrebs Progression beteiligt werden könnten. Wir haben versucht, die Beziehung zwischen miR-137 und Patienten Alter und Geschlecht zu finden, aber keine Statistik Ergebnis gefunden wurde. Da die vorliegende Studie hat gezeigt, dass die Expression von miR-137 wurde in den meisten der GC Gewebe herunterreguliert-Vergleich mit benachbarten Geweben (77%), konnten wir über die Diagnose und prognostische Anwendung von miR-137 in Betracht ziehen. Eine weitere Validierung in prospektiven Studien ist gerechtfertigt und zugänglicher Proben Quellen, wie miR-137 angereicherte tumorabgeleiteten Exosomen aus Blut, sollte untersucht werden. Es sollte auch bemerkt werden, dass der abgeschnittene Wert zu einem gewissen Grad (cut off = 1,5) wählten wir noch willkürlich sein könnten. Wenn es höher eingestellt wurde, könnte es sein, weniger Patienten mit miR-137 in Krebsgewebe heruntergeregelt. Aber selbst in diesem Zustand gab es etwa 23% der Krebserkrankungen hohe miR-137-Expression aufweisen. Dies kann bei Patienten, aufgrund der individuellen Differenz sein, dass einige Individuen verschiedene Genexpressionsmuster während der Tumorgenese oder Progression von Krebs haben kann.

Da die Expression von miR-137 in GC Geweben war niedriger als die in benachbarten Geweben in wir konnten statistisch signifikante Unterschiede (p = 0,00079), spekulieren, dass dieser Ausdruck Merkmal mit der Entwicklung von Krebs assoziiert war. Diese Spekulation wurde durch in-vitro und in-vivo-Studien bestätigt, dass die miR-137 kann die Zellproliferation, Migration und Invasion negativ regulieren. Die miR-137-Expressionsniveau kann über einen langen Zeitraum nach der Transfektion auf einem hohen Niveau zu halten sowohl bei Magenkrebs-Zelllinien, im Endstadium Xenotransplantattumoren und inmetastatic Lage in der Lunge (S1A Fig-S1C Abb). Allerdings führt die Überexpression Verfahren auf sehr hohe Expressionsniveaus von miR-137 (2A). Diese hohe miR-137 können zusätzliche Effekte verursachen. Zum Beispiel ist miR-137 ein negativer Regulator von Cdc42 und durch Targeting die in Magenkrebszellen Apoptose und Zellzyklus-G1-Arrest induzieren [17]. Da die miR-137 in unserer Studie tausende Male nach oben reguliert wurde, kann es auf die Hemmung anderer Ziele führen wie Cdc42. Offensichtlich in dieser Studie können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass die Tumor-Suppressor-Effekte von miR-137 durch die Unterdrückung anderer Zielgene vermittelt wurde.

Dann fanden wir, dass miR-137 wirkt als Tumorsuppressor-Gen durch Targeting AKT2 , das ist ein Mitglied der AKT-Familie. Die Wiederherstellung der AKT2 bewirkt, dass die Hochregulation von AKT2 in miR-137 transfizierten Zellen, die als die viel höher ist in Gerangel. Dies kann zu verdanken, dass die AKT2 Überexpression des Proteinebene miR-137 unterdrückt umgekehrt. Noch wichtiger ist, die Wiederherstellung der AKT2 reguliert die Apoptose und Invasion von Magenkrebszellen, was zu einer Aktivierung der Invasion und einer Unterdrückung von Apoptose (Figur 5). Dieser Rettungs Experiment liefert einen weiteren Beweis, dass die miR-137 aktive Zelle Apoptose und negativ durch gezielte AKT2 Zellinvasion zu regulieren. In-vivo-Versuche zeigten auch, dass die miR-137 Expression auf die AKT2 Ausdruck (S1D Abb und S1E Abb) negativ ist relativ. AKT ist ein entscheidender Faktor der PI3K /AKT Weg Weg. Die Herunterregulierung der AKT2 wirkt weiter seine Down-Stream-Protein Bad und GSK-3B, dass die p-Bad und p-GSK-B wurde offensichtlich nach unten geregelt. Bad kann ihre "Rollen durch Phosphorylierung und weiter reguliert das Zellschicksal [18] spielen. GSK-3B, die auch als GSK-3β in der Regel bekannt ist, steuert die Zellen Einwanderung und Invasion. Zusammenfassend haben wir eine Verbindung zwischen miR-137 und AKT2 identifiziert, die eine neuartige Bestandteil von Magenkrebs tumorigenesis ist. Die miR-137 hat sich gezeigt, zu AKT2 Regelung bezogen werden [19]. In hepatozelluläres Karzinom, hemmt miR-137 Krebszellwachstum und die Metastasierung über direkt Targeting AKT2 [20]. In der Tat haben wir e 8 Gene als potentielle Ziele von miR-137 (S1 Table) gescreent. Allerdings ist die AKT2 die einzige direkte Ziel von miR-137 nach Dual-Luciferase-Reporter-Assay und Western-Blot-Untersuchung. Von 4D können wir thatmiR-137 kann Einfluss auf die AKT2 und p-AKT2in beide HGC-27 und SGC-7901-Zellen zu finden. Aber interessanterweise in SGC-7901 wurde der Phosphorylierungsstatus mehr offenbar betroffen. Dieses Phänomen lässt sich konsequent in den drei wiederholten Blots beobachtet werden wir durchgeführt. Wir abgezogen, dass die spezielle Eigenschaft von verschiedenen Krebszellen zurückzuführen sein könnte. Es könnte spezifische Regulierung Weg Weg von miR-137 in SGC-7901 sein, die die Phosphorylierung von AKT2.However verdrängt, von der gegenwärtigen Forschung, können wir nicht vollständig, diesen Mechanismus zu erklären. Wenn wir die Patienten gewählt, die in ihrem GC Gewebe geringe Expression von miR-137 haben die AKT2 Protein-Expression zu ermitteln, fanden wir die meisten dieser Patienten (9/12) in ihrem GC Gewebe hohe AKT2 Niveau haben. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die miR-137 AKT2 bei Patienten zielen konnten. Es gab auch drei Patienten, die niedrige Expression von AKT2 in GC Gewebe haben, obwohl die Expression von miR-137 niedrig ist. Dieses Ergebnis kann auf die individuellen Unterschied zwischen den Patienten zurückzuführen.

Abschließend unser Ausdruck und funktionelle Studien legten nahe, dass die miR-137 ist häufig herunterreguliert bei Magenkrebs kann als Tumorsuppressor in GC-Zellen wirken, wieder einzuführen Ausdruck von denen auf GC-Zellen Magenkrebszellproliferation, Migration und Invasion durch direktes Targeting AKT2 unterdrückt. Somit ist unser Werk eine gute Ergänzung zu den bisherigen Arbeiten und hilfreich für uns, die miR-137 Regulationsmechanismus in der Krebstherapie zu verstehen.

Grundinformationen
S1 Abb. miR-137 und AKT2 Expression nach der Transfektion.
A. miR-137 Expression in HGC-27-Zellen und SGC-7901-Zellen 72 h nach der Transfektion. B. miR-137 Expression in den Endstadium Xenotransplantattumoren. C. miR-137 Expression in metastatischen Lokalisation von Mäusen Lunge. D. AKT2 Expression in metastatischen Lokalisation von Mäusen Lunge. Wir mischten die fünf Lungen zusammen in der gleichen Gruppe. E. AKT2 Expression in metastatischen Lokalisation von Mäusen Lunge. Wir haben festgestellt, die Akt2 Proteinexpression jeweils in jeder Maus. 30 &mgr; g Gesamtprotein wurde für jede Probe verwendet
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s001
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S2 Abb. Die Lebensfähigkeit der Zellen-Test vor der Metastasierung Experiment
Zelllebensfähigkeitstest 24 Stunden nach der Transfektion wurde durchgeführt,
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0130124.s002
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S3 Abb. Adensitometric Analyse von 4E
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124.s003
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S1 Tabelle. . Potenzielle Zielgene von miR-137, Die potentielle Zielgene von miR-137 wurden von der Linie Software vorhergesagt und durch Dual-Luciferase-Reportergentest und westlichen bloting erkannt
doi:. 10.1371 /journal.pone.0130124. S004
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Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Chengyuan Feng von Krebs Krankenhaus, chinesische Akademie der medizinischen Wissenschaften für die technische Unterstützung und Artikel Revision.

• PLoS ONE: Identifizierung und Charakterisierung von CXCR4-positivem Magenkrebs Stammzellen
• PLoS ONE: Die MicroRNA-217 Funktionen als Potenzial Tumor Suppressor in Magenkrebs durch GPC5 Targeting