PLOS ONE: Inhibition de la JAK2 /STAT3 Pathway Réduit gastrique croissance du cancer in vitro et in Vivo

Résumé

Signal Transducer et activateur de la transcription-3 (STAT3) est constitutivement activée dans de nombreux cancers où il favorise la croissance , l'inflammation, l'angiogenèse et inhibe l'apoptose. Nous avons montré que STAT3 est activé constitutivement dans le cancer gastrique humain et que l'activité de transcription STAT3 IL-11-driven chronique induit tumorigenèse gastrique dans l'gp130 ^{modèle de souris 757FF du développement du cancer gastrique. Nous montrons ici que le traitement de cellules humaines cancéreuses gastriques AGS avec la Janus Kinase (JAK) inhibiteur WP1066 et inhibe la dose en fonction du temps de la phosphorylation de STAT3, en liaison avec la réduction de la phosphorylation de JAK2, de la prolifération et augmentation de l'apoptose réduite. En outre, l'application de WP1066 intraperitoneale pendant 2 semaines, a réduit le volume de la tumeur gastrique de 50% dans la gp130 757FF coïncidant avec la souris réduit l'activation de JAK2 et STAT3 par rapport aux contrôles, de la même portée traités avec le véhicule. Les tumeurs gastriques des souris traitées WP1066- ont réduit l'inflammation de granulocytes, coïncidant avec l'inhibition de nombreuses cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-11, IL-6 et IL-1β, ainsi que les facteurs de croissance et Reg1 amphiréguline. Ces résultats indiquent que WP1066 peut bloquer la prolifération, réduire l'inflammation et induire l'apoptose dans les cellules tumorales gastriques en inhibant la phosphorylation de STAT3, et que de nombreuses cytokines et de facteurs de croissance qui favorisent la croissance de la tumeur gastrique sont régulés par des mécanismes dépendant de STAT3. WP1066 peut constituer la base pour de futures thérapies contre le cancer gastrique}

Citation:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) L'inhibition de la JAK2 /STAT3 Pathway Réduit gastrique croissance du cancer In Vitro
et In Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993

Editeur: Rupesh Chaturvedi, École de médecine de l'Université Vanderbilt, États-Unis d'Amérique

Reçu le 21 Janvier 2014; Accepté: 1 Avril 2014; Publié: 7 mai 2014

Droit d'auteur: © 2014 Judd et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce projet a été soutenue par des fonds provenant; NHMRC projet Australie (de www.nhmrc.gov.au) subventionǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) mélanome SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) cerveau SPORE 2 P50 CA127001-06. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:. Waldemar Priebe détenir des brevets et a un intérêt financier dans le développement du composé WP1066 comme suit; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki composés pour le traitement de maladies prolifératives cellulaires. Unites States Patent WO /2005/058829 12/01/2004. Notez également que les auteurs ont fourni une déclaration modifiée des intérêts divergents en ce qui concerne un brevet sur WP1066 détenu par W. Priebe. Les auteurs déclarent également que «cela ne modifie pas notre adhésion à PLOS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage".

Introduction

Sur les sept Signal Transducer et activateur de la transcription (STAT) membres de la famille , STAT3 a été le plus régulièrement impliqué dans une gamme de cancers courants chez les humains, y compris; poumon, du sein, de l'ovaire, de la prostate et du côlon [1], [2], [3], [4]. Ceci est également vrai dans le cancer gastrique humain [5], [6], [7] dans lequel STAT3 activation par phosphorylation chronique à tyrosine (Y) résident 705 a été liée à une augmentation de la croissance, l'angiogenèse, l'invasion et les métastases du cancer primaire [ ,,,0],6], [7], [8]. Ainsi, l'inhibition de STAT3 activité transcriptionnelle dans le cancer gastrique humain peut fournir un moyen possible de réduire le taux élevé de morbidité et de prolonger la vie chez les patients atteints de cancer gastrique dans le monde
.

En l'absence de mutations fonctionnelles dans le gène STAT3, l'activité de STAT3 aberrante est induite par l'activité persistante de tyrosine kinases en amont, et /ou par unscheduled- ou surexpression des ligands stimulatrices [9], [10], [11]. Ceci est clairement illustré dans la gp130 ^{757F modèle de souris /F du développement d'un cancer gastrique, dans lequel une Phe à la substitution de Tyr à la position 757 sur le bras intracellulaire de la famille de signalisation de la gp130 du récepteur de l'IL-6 empêche simultanément SHP2 et SOCS3 de liaison , entraînant l'inhibition de ras /MAP kinase signal de transduction, et hyperactivation de STAT3 par phosphorylation constitutive [23], [24], [26]. Récemment, nous et d'autres ont montré que dans les tumeurs gastriques, des augmentations significatives de la transcription coïncident avec l'expression accrue de la gp130 du ligand IL-11 dans des modèles de cancer et de souris gastriques humaines de cette maladie [5], [12], [13]. Dans ce dernier IL-6 est dispensable, mais IL-11 est absolument nécessaire pour la tumorigenèse [12], [13]. En outre, l'IL-11 /STAT3 a été montré pour être un moteur important de la gastrite atrophique, la première lésion précancéreuse de l'estomac après une infection chronique par la bactérie Helicobacter pylori
[14].}

a ce jour, de nombreuses kinases ont été rapportés pour induire une activité de STAT3 suivant ligand /liaison au récepteur, mais seulement compte JAK2 pour STAT3 phosphorylation sur amarrage avec l'IL-11 /récepteur gp130 complexe JAK1 et [15] et de ceux-IL-11 /gp130 se fixe préférentiellement JAK2 [16]. Ces observations suggèrent que des cibles prometteuses actuelles JAK2 et STAT3 pour concevoir des antagonistes thérapeutiques pour supprimer l'IL-11 /signalisation dans le cancer gastrique humain STAT3.

Récemment, l'acide caféique dérivé WP1066, structurellement lié à l'inhibiteur faible activité tyrosine kinase AG490 , a été montré comme étant un inhibiteur très puissant de la voie JAK2 /STAT3 dans le cerveau gliome transformée [17] et un carcinome rénal [18] lignées cellulaires, conduisant à une inhibition de la croissance et de l'induction de voies pro-apoptotiques classiques. En outre, WP1066 est efficace in vivo
contre les mélanomes très malignes et de leucémies qui sont positifs pour la mutation JAK2-V617F +, ce qui favorise l'activation constitutive JAK2 kinase [19], [20], [21], [22 ]. Les études non publiées indiquent que WP1066 est pas un inhibiteur de l'ATP-compétitif, et peut bloquer l'expression de JAK2 phosphorylée et STAT3; En outre, le p-STAT3-Y705 peut être inhibée indépendamment de l'état de JAK2. Ainsi, WP1066 présente une occasion unique d'inhiber à la fois p-JAK et p-STAT3, et ensuite bloquer puissamment JAK2 /STAT3 voie de signalisation et STAT3 activité transcriptionnelle.

Pour tester l'idée de la double blocus de JAK2 et de l'activation de STAT3 dans l'estomac et le développement du cancer gastrique subséquente, nous avons utilisé à la fois in vitro
et in vivo
approches pour évaluer si WP1066 peut ralentir ou bloquer la croissance tumorale gastrique par inhibition de JAK2 activité /STAT3, et d'autres voies de signalisation oncogènes étroitement liés. Ici, nous montrons que WP1066 inhibe efficacement STAT3 phosphorylation, et induit l'apoptose dans une lignée cellulaire de cancer gastrique, et qu'il peut inhiber la croissance tumorale gastrique in vivo
en bloquant l'induction des gènes de STAT3 régulés clés.

Préparation
Matériels et Méthodes et stockage des Kinase Inhibitors

Inhibitor WP1066 a été développé et synthétisé par Waldemar Priebe et ses collègues à l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center, et le stock actuel a été fourni courtoisie de Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, États-Unis. Les stocks ont été remises en suspension dans Hybri-Max DMSO et conservés à -20 ° C. Les stocks étaient à un usage unique, et non recongelés lors de la décongélation.

In vitro Culture

cellules AGS (ATCC, Manassas VA, USA) cellules ont été maintenues dans des milieux complets contenant RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen, USA) médias supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin, 50 UI de pénicilline à 37 ° C dans 5% de CO _{2-95% d'air.}

Western blot

des extraits protéiques ont été préparés soit avec un réactif Trizol (Life Technologies, Vic, Australie) selon les instructions du fabricant et les pastilles de protéines ont été remises en suspension dans 1% de dodécylsulfate de sodium contenant 2 mmol /l de Na _{3VO 4 ou RIPA tampon. Des aliquotes (30 ug) ont été soumises à une électrophorèse sur gel de sulfate de polyacrylamide /dodécylsulfate de sodium. Membranes ont été bloquées et incubées à 4 ° C pendant une nuit dans du lait écrémé avec les anticorps suivants: STAT3, pY (705) STAT3, ERK1 /2, pT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, pS (473) AKT, JAK2, pY (1007), Y (1008) JAK2 (signalisation cellulaire,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à du peroxyde (Dako, polyclonal anti-lapin du porc, conjuguée à la HRP, # P0399) et visualisées par chimioluminescence amplifiée (Amersham, Buckinghamshire, UK). Pour l'analyse des bandes ont été quantifiées en utilisant le système logiciel Quantity One (Biorad) et les protéines phosphorylées exprimées en pourcentage de GAPDH à partir d'une membrane double. Au moins n = 8 échantillons ont été évalués soit par traitement.}

Comptage des cellules par Haemocytometry

Les cellules ont été ensemencées à 5 x 10 ^{4 cellules /ml en format 24 puits dans un milieu complet et on laisse croître sans perturbation pendant 24 heures. Les cellules ont été traitées avec la concentration appropriée de DMSO WP1066 ou en tant que témoin pour 0-360 min. Après que les cellules de traitement ont été délogés par traitement à la trypsine-EDTA à 0,25% (Sigma), colorées avec le bleu trypan à 0,4% (Sigma) à une dilution de 1:01 pendant 5 minutes à 4 ° C et comptées sur un hémocytomètre.}

diacétate de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) coloration

Pour marquer les cellules AGS avec CFSE, les cellules ont été délogés par traitement à la trypsine-EDTA à 0,25% (Sigma) et remises en suspension dans préchauffée du PBS /BSA à 0,1% à une densité de 1 x 10 ^{6 cellules /ml. 10 mM CFSE colorant (Invitrogen) a été préparé selon le protocole du fabricant, puis 5 ul /ml a été ajouté et soigneusement mélangé par inversion pour assurer un étiquetage homogène de cellules. Les échantillons ont été mis à incuber à 37 ° C pendant 10 minutes, désactivé par addition de 5 volumes de milieu de glace froide et mis en incubation pendant 5 minutes sur de la glace. Les échantillons ont ensuite été lavées 5 fois dans les médias et étalées à 2 × 10 5 cellules /puits (plats à 6 puits). Un échantillon de cellules a été prise après le placage et marqué avec 100 pg /ml d'iodure de propidium (PI) et analysée par cytométrie en flux pour l'uniformité et l'intensité de marquage. Les cellules ont ensuite été cultivées dans un milieu complet pendant 48 heures, après quoi elles ont été traitées avec ou sans WP1066 approprié (5 du uM) à 37 ° C avec 5% de CO _{2 95% d'air pendant 18 heures. Les cellules ont ensuite été trypsinisées et remises en suspension comme ci-dessus dans un milieu complet, marqué avec 100 pg /ml de PI et analysées par cytométrie en flux à 488 ηM. Les données ont été enregistrées en utilisant la diva BD FACS (BD Biosiences) logiciel et analysé par logiciel Modfit LT (VSH).}}

cellules AGS de Annexin V Coloration ont été cultivées dans un milieu complet à 2 × 10 ^{5 cellules /puits dans des plaques 6 puits avec du DMSO (contrôle de support), ou WP1066 (5 uM), ou étoposide (200 uM; contrôle positif) à 37 ° C avec 5% de CO _{2 95% air non perturbé pendant 24 heures. Les cellules ont ensuite été traitées comme suit: lavés dans du PBS glacé, trypsinées comme ci-dessus, et la densité cellulaire déterminée par haemocytometry avant remise en suspension dans du tampon de liaison Annexine à 1 x 10 6 cellules /ml. 100 pi de cette préparation a été prise et mises en incubation avec 5 ul de composant A (Annexine Fluor 488 constituant l'annexine V, 25 mM de HEPES, 140 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, pH 7,4, 0,1% de sérum-albumine bovine) et 1 pg /ml du PI pendant 15 minutes à température ambiante dans l'obscurité. Les échantillons ont ensuite été mélangés avec 400 pi de tampon de liaison annexine et analysées par cytométrie en flux. Des contrôles appropriés de composants de réaction étaient prêts à ajuster les biais dans gating. Les données ont été enregistrées en utilisant la diva BD FACS (BD Biosiences) progiciel.}}

Ethique Déclaration

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec le Code australien pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques (7 ^{e édition), et après approbation du Comité Murdoch Childrens Research Institute animal éthique (demande # de A583). Tous les efforts ont été faits pour minimiser l'inconfort dans ces procédures minimalement invasives.}

In vivo
expériences

gp130 ^{souris 757F /F ont été décrits précédemment [23]. En bref, les tumeurs antraux discrètes se développent en 4 semaines d'âge et de croître rapidement jusqu'à environ 12 semaines. Ils récapitulent les caractéristiques de développement de type intestinal adénocarcinome gastrique, y compris l'invasion de la sous-muqueuse, mais ne métastasent pas [24]. Les animaux ont été logés dans un établissement SPF à l'Institut de recherche de la Murdoch Enfants et confirmés pour être libre de Helicobacter pylori
. Trois groupes de souris ont été évalués pour le développement de tumeurs: 1), âgées de 8 semaines gp130 souris 757F /F qui ont reçu aucun traitement (n = 10); 2) gp130 souris 757F /F qui ont reçu WP1066 de 8 à 10 semaines d'âge (n = 10); et 3) gp130 souris 757F /F qui ont reçu un véhicule de DMSO de 8 à 10 semaines d'âge (n = 8). Avant l'expérimentation, tous les animaux ont été évalués pour le bien-être, pesé et les volumes de traitement calculé en conséquence. Les animaux témoins ont reçu un volume équivalent de véhicule DMSO pour les animaux traités avec WP1066. Les souris ont reçu 2 premières injections intra-péritonéales de WP1066 à 10 mg /kg toutes les 48 heures pour les acclimater aux effets du traitement, puis a reçu 5 injections de WP1066 à 20 mg /kg toutes les 48 heures pour terminer le schéma 2 semaines. les sites d'injection intra-péritonéales ont été alternées par quatre quarts de cercle de l'abdomen des souris. A l'issue de l'expérience, les souris ont été euthanasiés, et les estomacs réséqués pour la photographie et de tissus collection.}

macroscopique et évaluation histologique

Estomacs ont été rapidement disséqué le long de la petite courbure, épinglé sur, photographié et fixé à 4% de paraformaldehyde tamponné avant de traiter. des sections de paraffine (4 um) ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E). L'analyse morphométrique a été réalisée en utilisant le logiciel ImageJ open-source (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Pour les mesures de surface, des images de la muqueuse gastrique ont été décrites manuellement avec l'outil de dessin du logiciel et le programme de quantification utilisé pour générer des mesures

In vivo
immunohistochimie &. Quantification

L'analyse immunohistochimique a été réalisée avec des anticorps pour Ki-67 (PharmingenȦ609) et activé caspase 3 (Cell Signalling TechnologyϤ1). La récupération d'antigène a été effectuée par des sections d'ébullition pendant 30 minutes en mM d'acide citrique 10 (pH 6,0). La coloration a été complétée par des anticorps appropriés espèces spécifiques biotinylés secondaires (Dako, Danemark), l'avidine et la peroxydase de raifort biotinylé complexe macromoléculaire (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobenzidine (Sigma, St Louis, MI) et de contraste avec hématoxyline. Pour Ki-67 quantification, un observateur nombre compté aveuglé de cellules colorées par la glande dans plusieurs sections par animal en utilisant ImageJ comme avant. Les données ont été exprimées en nombre Ki-67 cellules positives par la glande. Pour activer la caspase 3 quantification, un observateur impartial a compté le nombre de cellules colorées par zone de la muqueuse en 4 zones aléatoires de antrum bien orientée par animal en utilisant ImageJ comme avant. Les données ont été exprimée par le nombre actif caspase 3 cellules positives par surface de la muqueuse

Semi-quantitative Analyse morphométrique de l'inflammation

L'inflammation a été évaluée en utilisant la microscopie en aveugle sur H &. E-tachée sections. les tissus tumoraux antraux ont été analysés et un minimum de 3 bandes par animal (n = 7) ont reçu un score semi-quantitative en fonction du degré de cellules inflammatoires du minimum = 0 à infiltrat maximale = 3. lymphoplasmocytaire et polynucléaires ont été évalués indépendamment. Les valeurs moyennes ont ensuite été comparés pour l'analyse statistique.

Real-Time (Q) -PCR Analyse

L'ARN a été extrait avec le réactif Trizol (Life Technologies, Vic, Australie) selon les instructions du fabricant. L'ARN total (3 pg) a été transcrit de manière inverse en ADNc en utilisant le virus de la leucémie murine de Moloney transcriptase inverse (Promega, Madison, WI) apprêté avec 0,3 pg d'oligo (dT). amorces Q-PCR ont été conçues en utilisant Primer Express (Applied Biosystems) (tableau 1). SYBR chimie verte (Applied Biosystems) a été utilisé avec L32 comme le normalisateur. Les conditions de PCR étaient 95 ° C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 15 secondes; les réactions ont été effectuées sur une machine Applied Biosystems AB7500 RT PCR. Les résultats ont été analysés en utilisant un logiciel de détection de séquence, et les différences de pliage relatives ont été déterminées en utilisant la méthode ΔΔCt tel que décrit par le fabricant.

Analyse statistique

Les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne . Les valeurs obtenues à partir d'une analyse quantitative de l'expression génique ou le nombre de cellules colorées ont été comparées entre les échantillons par analyse de variance, et où une différence statistiquement significative n'a été observée des groupes individuels ont été analysés à la statistique paramétrique ou non paramétrique approprié en utilisant le progiciel statistique SigmaStat. La signification statistique a été définie comme p≤0.05.

Résultats

WP1066 Empêche rapidement phosphorylée Y (705) STAT3 et Induit Phosphorylation de ERK1 /2

Le JAK- de cellules AGS STAT voie et la voie ERK1 /2 sont les deux principales voies de transduction du signal en aval de gp130. Ces deux voies ont des effets réglementaires réciproques et inverse sur l'autre, le mieux démontré par la régulation négative de pSTAT3 après ERK1 2 activation /[47].

expériences dose-réponse WP1066 ont été effectuées par le traitement des cellules AGS avec 0 , 1, 2 ou 5 uM pendant 60 min WP1066 et de la phosphorylation de JAK2 à mesurer, STAT3, ERK1 /2 et de SHP-2. Comme prévu, pJAK2 a été fortement inhibée par WP1066 à toutes les concentrations testées et par > 80% à 5 uM. 5 uM WP1066 a également donné une inhibition maximale de pSTAT3 et l'activation réciproque des pERK1 /2 (Fig. 1A), avec une réduction totale de STAT3 à 5 um, ou des concentrations plus élevées (données non présentées). Coïncidant avec l'augmentation de pERK, activation pSHP2 a été fonction de la dose augmentée après administration WP1066 (Fig. 1A).

Pour les études de temps-cours, les cellules AGS ont été traités pendant 0-360 min avec 5 uM WP1066 et phosphorylation de JAK2, STAT3, ERK1 /2 et SHP-2 ont été analysés par transfert de Western (Fig. 1B). traitement WP1066 a entraîné une inhibition rapide de la pJAK2, avec 75% de baisse de 30 min et un maximum de 90% chute de 60 min. Ensuite, les cellules récupérées et retournées à JAK2 basale phosphorylation de 360 ​​min. Le motif de diminution de l'activation de STAT3 reflète celle de JAK2 phosphorylation. En revanche, ERK1 /2 phosphorylation a été augmenté de façon marquée en réponse à un traitement WP1066, avec une augmentation de 250% en 15 min, et une augmentation maximale de 460% en 60 minutes, avant de revenir à des niveaux de base de 360 ​​min. activation de SHP2 suivi de près les changements dans l'expression des ERK avec induction maximale à 60 min.

WP1066 inhibitions AGS Croissance par suppression de la prolifération et l'induction de l'apoptose

STAT3 Activé est un pilote établi des cellules de cancer de l'estomac humain l'activation de ERK1 /2 croissance et la prolifération [5], et prolongée induit l'apoptose des cellules épithéliales gastriques [25]. Ayant démontré que WP1066 régule STAT3 et la signalisation ERK1 /2 d'une manière réciproque, nous avons testé si elle peut perturber la croissance des cellules et induire l'apoptose de cellules AGS.

Traitement des cellules AGS avec 5 uM WP1066 (Fig. 2A ) a entraîné une réduction substantielle du nombre de cellules par rapport aux contrôles DMSO (DMSO, 100% ± 3,14 vs WP1066, 36,02% ± 3,18, p < 0,05). Pour déterminer si cette réduction du nombre de cellules était due à une prolifération altérée cellulaire ou l'apoptose, ou une combinaison des deux, CFSE et la coloration de l'annexine V a été réalisée sur des cellules traitées. les cellules AGS traitées avec WP1066 sont plus fortement marqués par CFSE que celles traitées avec du DMSO, la preuve de la réduction du nombre de divisions cellulaires et donc la prolifération (Fig. 2B). En outre, une plus grande proportion de cellules AGS traitées avec WP1066 ont été marquées avec de l'annexine V (figure 2C) par rapport aux cellules traitées avec du DMSO, démontrant que la WP1066 apoptose également induite dans les cellules AGS (WP1066, 1,3 fois plus élevé; p = 0,049).

WP1066 Blocks gastrique croissance tumorale dans gp130 ^{757FF souris par suppression de tumeurs prolifération cellulaire et mise en valeur de}

la gp130 de apoptose ^{souris 757FF développent des tumeurs de l'estomac distales caractérisées par l'IL-11 gastrique élevée activation entraînée STAT3 [12], [13]. Depuis pJAK2 et p-STAT3 sont bloqués par WP1066 in vitro
, nous avons testé si WP1066 serait également bloquer le développement de tumeur gastrique in vivo
. Traitement de gp130 757FF souris 3 fois par semaine pendant 2 semaines avec /kg WP1066 la croissance de tumeur gastrique significativement réduite 10-20 mg par 47% de 42.11 ± 3.21 mm 2 à 22.36 ± 3.64 mm 2 ( p. < 0,05) (figure 3A-D). les tumeurs traitées DMSO ne sont pas différents de tumeurs observées chez les souris âgées de 8 semaines, l'âge auquel le traitement WP1066 a commencé, ce qui confirme que la croissance de la tumeur gastrique est relativement stable de 8-10 semaines [27], et que le traitement WP1066 provoque effectivement la régression de la tumeur plutôt que stase (Fig. 3A-D).}

Pour déterminer si la prolifération a été altérée dans les tumeurs gastriques, Ki-67 cellules positives /de la glande ont été quantifiés dans la cohorte traitée. traitement WP1066 a réduit significativement gastrique prolifération des cellules épithéliales (DMSO 62 ± 7,7 vs WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 cellules colorées /glande, p < 0,05; fig. 3E-G), ce qui démontre que WP1066 peut inhiber la croissance des tumeurs par inhibition de la prolifération cellulaire. Pour évaluer les effets de WP1066 sur l'apoptose des cellules tumorales, des sections de la WP1066 ou les cohortes de DMSO traitées ont été colorées avec un anticorps dirigé contre la caspase 3 clivée, un marqueur de mort cellulaire par apoptose (fig. 3 H, I). Il y avait des profils beaucoup plus apoptotiques dans les tumeurs WP1066 traités que chez les témoins, ce qui démontre un effet pro-apoptotique claire de WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 cellules colorées /mm ^{2 muqueuse, p < 0,05;. Fig 3J ).}

WP1066 cible spécifiquement JAK2 et STAT3 phosphorylation à réprimer gastrique tumorigenèse dans gp130 ^souris
757FF

Parce que gp130 ^{souris 757FF développent des tumeurs en réponse à l'activation de la gp130 constitutive [20] , nous avons testé si WP1066 a supprimé les voies de signalisation en aval in vivo.
traitement WP1066 pendant 2 semaines a entraîné une diminution de 25% de la quantité relative de STAT3 totale dans la muqueuse antrale par rapport aux groupes traités avec du DMSO (Fig. 4A) . La quantité de JAK2 totale, AKT et ERK1 /2 n'a pas été modifiée par le traitement WP1066. Ceci suggère que le traitement chronique de gp130 souris 757FF avec WP1066 supprime l'expression de STAT3.}

Analyse immunoblot de l'activation de signalisation a démontré une réduction significative de pJAK2 (80.12% de ± 5,70 du contrôle de DMSO), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7,2 du contrôle DMSO;. la figure 4B) et pERK1 /2 (72,66% de contrôle ± 5.23.of de DMSO;. la figure 4B). Phosphorylation d'AKT n'a pas été modifiée par le traitement WP1066. activation réduite de JAK2 et STAT3 est compatible avec le in vitro
données et actions connues de WP1066.

WP1066 Supprimée la réponse inflammatoire dans le Antral Muqueuse de gp130 ^{757FF Souris}

Etant donné qu'une réaction inflammatoire chronique de l'estomac, une tumeur est essentiel pour le développement [27], nous avons testé si une partie du mode d'action de WP1066 est de supprimer la réponse inflammatoire à médiation par STAT3, ce qui contribue habituellement à la progression tumorale. L'analyse histologique a révélé que l'infiltration des polynucléaires dans l'antre des souris traitées WP1066 était significativement inférieur à celui des souris témoins (figure 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p < 0,05), alors que infiltrat lymphoplasmocytaire ne différait pas entre les deux groupes (Fig. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p > 0,05).

Depuis l'inflammation gastrique est généralement médiée par un petit nombre de cytokines et d'enzymes pro-inflammatoires clés, nous avons mesuré l'expression d'un groupe sélect de ceux-ci par Q-PCR dans le DMSO et les estomacs de WP1066 traités. L'expression de tous les médiateurs pro-inflammatoires à l'exception de l'IFNy, TNFa et iNOS a été inhibée de manière significative par le traitement WP1066 comme suit: IL-6 (Fig. 5C, 6,0 ± 2,6 fois), IL-11 (5D Fig;. 8,7 ± 3,4 fois), IL-1α (figure 5E;. 10,9 ± 4,3) fois), IL-1β (Fig 5F.; 3 ± 0,9 fois) et COX2 (figure 5G;. 2,94 ± 1,05). Par conséquent WP1066 inhibition de l'activité de STAT3 et la progression de la tumeur est due en partie à la réduction de l'infiltration de l'polymophonuclear et réduit STAT3 transcription dépendante de l'IL-6 pro-inflammatoire, IL-11, IL-1alpha, IL-1ß et COX2 gènes.

WP1066 inhibait l'expression de Amphiregulin dans le Antral Muqueuse de gp130 ^Souris
757FF

l'effet du traitement WP1066 sur l'expression des ligands du facteur de croissance connus pour jouer un rôle dans la croissance et la différenciation de l'estomac et dans le développement de gp130 ^{tumeurs 757FF a également été évalué. WP1066 a inhibé l'expression d'amphiréguline (1,85 ± 0,60 fois, p < 0,05), mais pas HB-EGF (Fig. 6) dans la muqueuse antrale des souris traitées. En outre, l'estomac proliférative ligand et le gène STAT3 régulé Reg1 a montré une forte tendance inhibitrice après le traitement WP1066 par rapport à l'antre de contrôle de DMSO (figure 6;. P = 0,069).}

Discussion

dans cette étude, nous démontrons que WP1066 inhibe dose-dépendante de la voie de signalisation JAK2 /STAT3 dans les cellules humaines du cancer gastrique (AGS), avec pour conséquence une réduction de 60% de la prolifération cellulaire, et une augmentation plus faible de l'apoptose. Le mécanisme de ceci est probablement dû à l'inhibition double des formes phosphorylées de JAK2 et STAT3, réduisant ainsi STAT3 activité transcriptionnelle, comme cela a été démontré pour plusieurs lignées cellulaires cancéreuses, y compris gliome [17], [28], [29], la leucémie myéloïde [ ,,,0],30], et le mélanome [20]. D'autre part, l'application WP1066 a entraîné une augmentation réciproque ERK1 /2 qui coïncide avec une activation accrue pSHP2, la phosphatase responsable de l'activation de la voie de signalisation de la kinase ras /MAP. Une observation similaire en ce qui concerne l'activation de ERK a été faite pour d'autres lignées de cellules cancéreuses dérivées de carcinome rénal [18], et le gliome [28]. Par conséquent, la régulation croisée de STAT3 et ERK médiée par la signalisation en aval des cytokines IL-6, la famille semble se produire fréquemment dans une des gammes de tissus et de lignées cellulaires [31].

WP1066 est également efficace lorsqu'il est administré in vivo
, où il bloque l'activation de STAT3 (75%) dans la gp130 ^{tumeurs antraux 757FF souris, et a également réduit la protéine STAT3 totale, ce qui suggère qu'il peut diminuer l'expression du Stat3 du gène dans le estomacs des souris traitées. Ceci est soutenu par l'existence de sites de consensus pour activé STAT3 lie le promoteur
Stat3, avec activation de la Stat3 de gène comme l'a démontré en utilisant mutant promoteur-reporter
Stat3 constructions et EMSA [48] ou ChIP-seq [49], et suggère que WP1066 peut inhiber l'activation autocrine de STAT3 après l'inhibition de JAK2 /STAT3 phosphorylation.}

Comme prévu, les niveaux pJAK2 ont également été réduits en présence de WP1066 dans l'estomac. Contrairement à l'effet de WP1066 in vitro,
ERK1 2 activation /dans les estomacs de WP1066 souris traitées a été légèrement diminué. La raison de cet écart peut être deux fois plus; tout d'abord, la vivo
exposition pour WP1066 a été chronique par rapport à l'exposition aiguë in vitro
; d'autre part, l'exposition in vivo
est plus complexe avec de multiples voies de signalisation potentielles en utilisant des molécules de transduction de signal commun. Néanmoins, la diminution de l'activation de JAK2 et STAT3 est en accord avec le rôle établi de ces facteurs cytokine /croissance composants dans la progression du cancer gastrique [5], [27] de signalisation et démontre que in vivo,
et quand isolé de les effets de la H.pylori de l'infection, il est principalement activation altérée de STAT3, et non ERK1 /2 qui est crucial pour le développement de la tumeur.

Coïncidant avec inhibition de l'activité de STAT3, l'application de WP1066 pendant seulement 2 semaines in vivo
entraîné une diminution de 50% de la surface de la tumeur accompagnée d'une réduction similaire de la prolifération, tel que mesuré par Ki-67 coloration et une augmentation concomitante de l'apoptose des cellules tumorales, telle que mesurée par la caspase 3 activée immunocoloration. Cette inhibition de la croissance tumorale a été parallèle à a > diminution de 40% du nombre de cellules polynucléaires, et la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires associés, y compris l'IL-1α, IL-1 ß, ainsi que la COX-2, qui promouvoir la tumorigenèse gastrique. D'autre part WP1066 n'a eu aucun effet sur l'expression IFNy, TNFa et iNOS en rapport avec l'absence de réduction des lymphocytes et les macrophages (infiltration lymphoplasmocytaire) sur le traitement du temps bien sûr. L'inhibition de l'IL-1β après pSTAT3 l'inhibition par WP1066 est particulièrement importante, car l'IL-1β est un régulateur important de la sécrétion d'acide gastrique, un promoteur puissant de la croissance tumorale dans un modèle de souris transgénique de cancer gastrique [33], et une partie intégrale de l'inflammasome NLRP3 [32]. IL-11 est connue pour être un stimulateur endogène de antrale expression de l'IL-1β par l'intermédiaire STAT3 [13], et nous avons démontré ici que l'IL-11 est inhibée par WP1066. Depuis l'IL-11 semble être en amont de l'IL-1β dans l'estomac, alors ceci est une voie plausible pour l'inhibition après le blocage de l'activation de STAT3 de ce dernier.

Les effets inhibiteurs de WP1066 dans la gp130 ^{757FF modèle murin de cancer gastrique, récapituler et prolonger les résultats de STAT3 haploinsuffisance générés génétiquement dans le modèle de souris même [26], ainsi que l'utilisation d'oligonucléotides systémiques anti-sens contre STAT3 [12], ce qui souligne l'importance de la signalisation STAT3 activée pour faciliter tumorigenèse gastrique. Étant donné l'importance de l'IL-11 dans la promotion de l'initiation et le développement [12] tumeur, [13], et l'IL-6 en facilitant l'infiltration de polynucléaires locale [34] dans le gp130 757FF souris, il est significatif que WP1066 réduit efficacement la les niveaux d'expression des deux cytokines qui coïncident avec l'inversion de la croissance tumorale. Cela soutient l'idée que STAT3 régule la transcription de l'IL-11 et IL-6, peut-être entraîné par rétroaction autocrine boucles, puisque les deux cytokines utilisent préférentiellement STAT3 la transcription dans l'estomac [23].}

Reg1 est largement distribué membre de la famille du gène Reg et un facteur de croissance gastrique connu, qui joue un rôle important en tant que régulateur prolifératives et anti-apoptotique dans l'estomac des souris [26], [35] et les humains [36]. Nous avons précédemment montré que Reg1 est fortement induite dans des tumeurs antraux de gp130 ^{757FF souris coïncidant avec l'IL-6 et IL-11 expression et que haploinsuffisance des résultats STAT3 dans une expression réduite de Reg1, ce qui suggère qu'il est réglée STAT3- gène [26]. Cela a été confirmé dans des lignées de cellules gastriques, où l'IL-11 [37] et l'IL-6 [36] de la phosphorylation de STAT3 stimulés qui à son tour active la transcription Reg1.}

• PLOS ONE: CD147 Expression dans Human Gastric cancer est associé à la tumeur Récurrence et pronostic
• PLOS ONE: Un MAP3K1 SNP prédit la survie du cancer gastrique dans une population chinoise