PLoS ONE: ингибирование JAK2 /STAT3 Pathway уменьшает рост рака желудка в пробирке и в Vivo

Абстрактный
<р> Сигнал датчика и Активатор Транскрипция-3 (STAT3) конститутивно активируется во многих видов рака, где она способствует росту , воспаление, ангиогенез и ингибирует апоптоз. Мы показали, что STAT3 конститутивно активируется при раке желудка человека, и что хронический ИЛ-11-управляемый STAT3 транскрипционной активности индуцирует желудочное tumourigenesis в gp130 ^{757FF мышиную модель развития рака желудка. Здесь показано, что лечение AGS клеток рака желудка человека с Janus киназы (JAK) ингибитор WP1066 дозо и времени зависимым от ингибирует фосфорилирование STAT3, в сочетании с пониженным JAK2 фосфорилирования, уменьшение пролиферации и повышенным апоптозом. Кроме того, применение внутрибрюшинного WP1066 в течение 2 недель, уменьшение объема опухоли желудка на 50% в gp130 757FF мышь совпадающей с уменьшенным JAK2 и STAT3 активации по сравнению с обработанных носителем, управления однопометница. Опухоли желудка от WP1066- обработанных мышей уменьшило полиморфонуклеарный воспаление, совпадающую с торможением многочисленных провоспалительных цитокинов, включая IL-11, IL-6 и IL-1, а также факторы роста REG1 и амфирегулином. Эти результаты показывают, что WP1066 могут блокировать пролиферацию, снижают воспаление и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках желудка путем ингибирования STAT3 фосфорилирования, и что многие цитокины и факторы роста, которые способствуют росту опухоли желудка регулируются STAT3-зависимыми механизмами. WP1066 может служить основой для будущих терапевтических средств против рака желудка
<р> Образец цитирования:. Judd Л.М., Menheniott TR, Линг H, Джексон CB, Хоулетт M, Kalantzis A, и др. (2014) Ингибирование JAK2 /STAT3 Тропинка уменьшает рост рака желудка In Vitro
и В Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. DOI: 10.1371 /journal.pone.0095993
<р> Редактор: Rupesh Chaturvedi, Университет Вандербильта школа медицины, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 21 января, 2014 года; Принято: 1 апреля 2014 года; Опубликовано: 7 мая 2014
<р> Copyright: © 2014 Джадд и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются}

Финансирование:. Этот проект была поддержана за счет средств; NHMRC проект Австралия (www.nhmrc.gov.au) грантǽ165 NIH /NCI США (nih.gov; www.cancer.gov) меланома SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI США (nih.gov; www.cancer. гов) мозга SPORE 2 P50 CA127001-06. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:. Waldemar Прибе владеют патентами и имеет финансовую заинтересованность в развитии соединения WP1066 следующим образом; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Шиманьский, И. Fokt, А. Левицкого соединений для лечения клеточных пролиферативных заболеваний. Объединяет Патент WO /2005/058829 12/01/2004. Отметим также, что авторы представили исправленный заявление конкурирующих интересов в отношении патента на WP1066 провел В. Priebe. Авторы также заявляют, что "это не меняет нашу приверженность PLoS ONE политики на данных и материалов о разделе".

Введение
<р> Из семи сигнала преобразователя и активатором (стат) членов семьи транскрипционных , STAT3 был наиболее последовательно участвует в ряде распространенных видов рака у человека, в том числе; легких, молочной железы, яичников, предстательной железы и ободочной кишки [1], [2], [3], [4]. Это также верно в рак желудка человека [5], [6], [7], в которой STAT3 активации хроническим фосфорилирования на тирозин (Y) проживают 705 был связан с увеличением роста, ангиогенез, инвазию и метастазирование первичного рака [ ,,,0],6], [7], [8]. Таким образом, ингибирование STAT3 транскрипционной активности при раке желудка человека может обеспечить возможные способы снижения высокой заболеваемости и продлить жизнь среди больных раком желудка во всем мире
. <Р> При отсутствии функциональных мутаций в гене STAT3, аберрантное STAT3 активность индуцируется постоянной активностью от вверх по течению тирозинкиназ, и /или путем unscheduled- или избыточная экспрессия лигандов стимулирующими [9], [10], [11]. Это ясно видно на примере gp130 757F /F мышиную модель развития рака желудка, в котором Phe для Tyr замещения в 757 положении на внутриклеточном подлокотнике семейства сигнализации gp130 рецептора IL-6 одновременно предотвращает SHP2 и SOCS3 связывания , что приводит к торможению Ras /MAP киназы трансдукции сигнала, и гиперактивации STAT3 учредительными фосфорилирования [23], [24], [26]. В последнее время мы и другие показали, что в опухолях желудка, значительное увеличение транскрипции совпадают с увеличением экспрессии gp130 лиганда IL-11 в рака желудка человека и мыши моделей этого заболевания [5], [12], [13]. В последнем случае IL-6 является необязательной, но IL-11 абсолютно необходим для tumourigenesis [12], [13]. Кроме того, IL-11 /STAT3 Было показано, что является важным фактором атрофический гастрит, первым предраковое поражение желудка после хронического инфекции, вызванной бактерией хеликобактерной
[14].
<Р> на сегодняшний день многочисленные киназ, как сообщалось, вызывают STAT3 деятельность после лиганд /рецепторного связывания, однако только JAK1 и JAK2 счет для STAT3 фосфорилирования при стыковке с IL-11 /gp130 рецепторный комплекс [15] и из них IL-11 /gp130 преимущественно связывается JAK2 [16]. Эти наблюдения указывают на то, что jak2 и STAT3 представляют перспективные цели для разработки терапевтических антагонистов для подавления IL-11 /STAT3 сигнализации при раке желудка человека.
<Р> В последнее время кофейной кислоты производное WP1066, структурно связанные с ингибитором низкой активностью тирозинкиназы AG490 , было показано, является сильнодействующим ингибитором JAK2 /STAT3 пути в трансформированном глиомы головного мозга [17] и рак почки [18] клеточные линии, что приводит к торможению роста и индукции классических про-апоптотических путей. Кроме того, WP1066 эффективен В естественных условиях
против высоко злокачественных меланом и лейкозов, которые являются положительными для мутации JAK2-V617F +, что способствует активации конститутивной JAK2 киназы [19], [20], [21], [22 ]. Неопубликованные исследования показывают, что WP1066 не является ингибитором АТФ-конкурентным, и может блокировать экспрессию фосфорилированного JAK2 и STAT3; Кроме того, п-STAT3-Y705 может быть запрещена независимо от статуса JAK2. Таким образом, WP1066 представляет собой уникальную возможность ингибировать как п-JAK и п-STAT3, а затем эффективно блокируют JAK2 /STAT3 сигнальный путь и STAT3 транскрипционной активности.
<Р> Чтобы проверить идею двойной блокады JAK2 и активации STAT3 в желудке и последующего развития рака желудка, мы использовали как в пробирке
и в естественных условиях
подходы к оценке, может ли WP1066 замедлить или блокировать рост опухоли желудка путем ингибирования /STAT3 активности JAK2, и других тесно связанных с онкогенных сигнальных путей. Здесь показано, что WP1066 эффективно ингибирует фосфорилирование STAT3, и индуцирует апоптоз в желудочном линии раковых клеток, и что он может подавлять рост опухоли желудка <ЕМ> в естественных условиях
блокируя индукцию ключевых генов STAT3-регламентированы.

Материалы и методы

Получение и хранение ингибиторы киназ
<р> Ингибитор WP1066 был разработан и синтезированы Waldemar Priebe и коллегами в университете Техаса MD Anderson Cancer Center, а также текущий запас был поставлен любезность Хьюстон Pharmaceuticals Inc, Хьюстон, штат Техас, США. Запасы ресуспендировали в Hybri-Max ДМСО и хранили при -20 ° С. Акции были только одноразового использования, а не повторно замораживают при оттаивании.

В пробирке культуры
<р> AGS клетки (АТСС, Manassas VA, USA) клетки поддерживали в полных средах, содержащих RPMI + GlutaMAX ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 МЕ пенициллина при температуре 37 ° с в 5% CO <суб> 2-95% воздуха.

вестерн-блоттинга
<р> белковые экстракты получали либо TRIzol реагента (Life Technologies, Вик, Австралия) в соответствии с инструкциями изготовителя и белковых гранул ресуспендировали в 1% додецилсульфата натрия, содержащего 2 ммоль /л Na <суб> 3VO <суб> 4 или Рипа буфер. Аликвоты (30 мкг) подвергали электрофорезу додецилсульфата натрия сульфат /полиакриламидном геле. Мембраны блокировали и инкубировали при 4 ° С в течение ночи в обезжиренном молоке со следующими антителами; STAT3, Py (705) STAT3, ERK1 /2, рТ (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, пС (473) AKT, JAK2, Py (1007), Y (1008) JAK2 (Cell Signaling,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Мембраны инкубировали с перекисью-конъюгированные вторичным антителом (Dako, поликлональные анти свиной кролика, конъюгируют с HRP, # P0399) и визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции (Amersham, Buckinghamshire, UK). Для анализа полосы были определены количественно с использованием системы Количество одного программного обеспечения (Biorad) и фосфорилированные белки, выраженные в виде доли от GAPDH дубликата мембраны. По крайней мере, п = 8 образцов оценивали с помощью либо обработки.

Cell Counting по Haemocytometry
<р> Клетки высевают в количестве 5 × 10 4 клеток /мл в 24-луночного в полной среде и оставляли расти в покое в течение 24 часов. Клетки обрабатывали соответствующей концентрацией WP1066 или ДМСО в качестве контроля за 0-360 мин. После того, как клетки лечения были вытеснены путем обработки трипсин-ЭДТА 0,25% (Sigma), окрашивали трипановым-синий 0,4% (Sigma) при 1:1 разведении в течение 5 минут при 4 ° C, и рассчитывали на гемоцитометра.

карбоксифлуоресцеин Diacetate сукцинимидил Ester (CFSE) Окрашивание
<р> Чтобы пометить AGS клетки с CFSE, клетки были выбиты обработкой трипсин-ЭДТА 0,25% (Sigma) и ресуспендировали в подогретую PBS /0,1% BSA при плотности 1 × 10 ^{6 клеток /мл. 10 мМ CFSE краситель (Invitrogen), был подготовлен в соответствии с протоколом производителя, а затем мл добавляли 5 мкл /и тщательно перемешивали путем инверсии для обеспечения однородной маркировки клеток. Образцы инкубировали при 37 ° С в течение 10 минут, гасили путем добавления 5 объемов охлажденного льдом сред и инкубировали в течение 5 минут на льду. Образцы затем промывали 5 раз в средствах массовой информации и высевали при 2 × 10 5 клеток /лунку (6-луночных планшетах). Образец клеток принимают после металлизации и метили с помощью 100 мкг /мл пропидий йодида (PI) и анализировали с помощью проточной цитометрии для равномерности и интенсивности маркировки. Затем клетки выращивали в полной среде в течение 48 часов, после чего они были обработаны с использованием или без соответствующего WP1066 (5 мкМ) при 37 ° С с 5% CO <суб> 2 и 95% воздуха в течение 18 часов. Затем клетки обрабатывали трипсином, как указано выше, и ресуспендировали в полной среде, меченный 100 мкг /мл PI, и анализировали с помощью проточной цитометрии при 488 Нт. Данные были записаны с помощью дива BD FACS (BD Biosiences) пакет программного обеспечения и анализировали с помощью Modfit LT пакета программного обеспечения (ВШ).}

аннексина V окрашиванием
<р> AGS клетки культивировали в полной среде при 2 × 10 5 клеток /лунку в 6-луночные планшеты с ДМСО (контроль несущей) или WP1066 (5 мкМ), или этопозида (200 мкМ; положительный контроль) при 37 ° с с 5% CO <суб> 2 95% воздух без помех в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали следующим образом; промывали в ледяном PBS, трипсином, как описано выше, и плотность клеток определяется haemocytometry ранее ресуспендирования в буфере для связывания аннексина до 1 × 10 6 клеток /мл. 100 мкл этого препарата было принято, и инкубировали с 5 мкл компонента А (488 компонента V аннексина аннексина Fluor, 25 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) и 1 мкг /мл ПИ в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Образцы затем смешивают с 400 мкл буфера для связывания аннексина и анализировали с помощью проточной цитометрии. Соответствующие контроли +/- компоненты реакции были готовы сделать поправку на смещение в стробирования. Данные были записаны с помощью BD FACS дива (BD Biosiences) пакет программного обеспечения.

Этика Заявление
<р> Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с австралийским Кодекса по уходу и использованию животных в научных целях (7 е издание), и после утверждения научно-исследовательский институт Комитета по Murdoch Childrens животных по вопросам этики (приложение # A583). Все усилия были предприняты, чтобы свести к минимуму дискомфорт в этих минимально инвазивных процедур.

В естественных условиях
Эксперименты
<р> gp130 757F /F мышей были описаны ранее [23]. Если коротко, то дискретные антральных опухоли развиваются в 4-недельном возрасте и быстро растут до приблизительно 12 недель. Они Повторим особенности развития кишечных типа аденокарциномы желудка, в том числе подслизистой инвазии, но не метастазированию [24]. Животные были размещены в объекте SPF в научно-исследовательском институте Мердок детской и подтвердил, чтобы быть свободным от хеликобактерной
. были оценены три группы мышей для развития опухоли: 1) 8 недель gp130 757F /F мышей, которые не получали никакого лечения (п = 10); 2) gp130, 757F /F мышей, получавших WP1066 от 8 до 10-недельного возраста (п = 10); и 3) gp130, 757F /F мышей, получавших DMSO транспортное средство от 8 до 10-недельного возраста (n = 8). До экспериментам всех животных были оценены на благополучие, взвешивают и объемы лечения рассчитывали соответственно. Контрольные животные получали эквивалентные объемы ДМСО транспортного средства для WP1066-обработанных животных. Мыши получали 2 начальные внутрибрюшинно инъекции WP1066 в дозе 10 мг /кг каждые 48 часов, чтобы акклиматизироваться их к воздействию обработки, а затем получили 5 инъекций WP1066 в дозе 20 мг /кг каждые 48 часов, чтобы закончить 2 недели режим. Интраперитонеальной инъекции сайты чередовались через четыре квадранта брюшной полости мышей. По завершении эксперимента мышей подвергали эвтаназии, и желудки резекцию для фотографий и ткани коллекции.

макроскопической и гистологических
<р> Желудок быстро рассекают вдоль малой кривизны, возлагали вне, сфотографировали и фиксировали в 4% забуференном параформальдегидом перед обработкой. Парафиновые срезы (4 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином (H &Amp; E). Морфометрическая анализ проводился с использованием открытым исходным кодом ImageJ программного обеспечения (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Для измерений площади, изображения слизистой оболочки желудка были вручную изложены с помощью инструмента программного обеспечения для рисования и программы количественного используемой для генерации измерений

В естественных условиях
Immunohistochemistry и усилитель. Количественное
<р> Иммуногистохимическое анализ проводили с использованием антител для Ki-67 (PharmingenȦ609) и активированного каспазы 3 (Cell Technology # Сигнальный 9961). Антиген поиска проводили кипячением секций в течение 30 мин в 10 мМ лимонной кислотой (рН 6,0). Окрашивание было завершено с использованием соответствующих видов специфических биотинилированные вторичные антитела (DAKO, Дания), авидин и биотинилированного пероксидазой макромолекулярная комплекс (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-диаминобензидин (Sigma, Сент-Луис, Мичиган) и контрастным гематоксилином. Для Ki-67, количественному слепом наблюдателя подсчитанное число окрашенных клеток в железе в нескольких разделах каждого животного с использованием ImageJ, как и раньше. Данные выражали как число Ki-67 позитивных клеток в железе. Для активации каспазы 3 квантификации, ослепший наблюдатель подсчитали количество окрашенных клеток в области слизистой оболочки в 4 случайных областях хорошо ориентированной антральном на животное с помощью ImageJ, как и раньше. Данные выражали как количество активированного каспазы 3 положительных клеток на площади слизистой оболочки

Полуколичественное морфометрического анализа воспалений
<р> Воспаление оценивали с помощью микроскопии в слепом моды на H &усилителя;. E-окрашивали разделов. Антральном опухолевых тканей были проанализированы и менее 3-х полос на одно животное (п = 7) получали полуколичественный балл в зависимости от степени воспалительных клеток от минимального = от 0 до максимального = 3. Lymphoplasmocytic и полиморфно инфильтрата были оценены независимо друг от друга. Затем средние значения сравнивались для статистического анализа.

в режиме реального времени (Q) -PCR анализ
<р> РНК экстрагировали с реагентом TRIzol (Life Technologies, VIC, Австралия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Суммарную РНК (3 мкг) подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием вируса мышиного лейкоза Молони обратной транскриптазы (Promega, Madison, WI), загрунтовать 0,3 мкг олиго (дТ). Q-ПЦР-праймеры были разработаны с использованием PRIMER Express (Applied Biosystems) (таблица 1). SYBR зеленая химия (Applied Biosystems) была использована с L32 в качестве нормализатора. Условия ПЦР были 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 15 сек; реакции проводились на машине Applied Biosystems AB7500 RT PCR. Результаты были проанализированы с помощью программного обеспечения детектора последовательности и относительные различия сгиба были определены с использованием метода ΔΔCt, как описано производителем.

Статистический анализ
<р> Данные выражали в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего значения , Значения, полученные из количественного анализа экспрессии или числа окрашенных клеток гена сравнивали между образцами с помощью ANOVA, и где было обнаружено статистически значимых различий отдельных групп далее анализировали с соответствующим параметрической или непараметрической статистики с использованием статистического пакета SigmaStat. Статистическая значимость была определена как p≤0.05.

Результаты

WP1066 Быстро Подавляет фосфорилированного Y (705) STAT3 и Индуцирует Фосфорилирование ERK1 /2 в AGS Cells
<р> JAK- STAT путь и путь ERK1 /2 являются два основных пути передачи сигналов вниз по течению от gp130. Эти два пути имеют взаимные и обратные регуляторные эффекты друг на друга, лучше всего демонстрируется негативной регуляции pSTAT3 после ERK1 /2 активации [47].
Эксперименты доза-реакция WP1066 <р> проводились путем обработки AGS клеток с 0 , 1, 2 или 5 мкМ WP1066 в течение 60 мин и измерения фосфорилирования JAK2, STAT3, ERK1 /2 и SHP-2. Как и ожидалось, pJAK2 был сильно ингибируется WP1066 при всех испытанных концентрациях и с помощью > 80% при 5 мкМ. 5 мкМ WP1066 также дали максимальное ингибирование pSTAT3 и ответную активацию pERK1 /2 (фиг. 1А) с уменьшением общей STAT3 при 5 мкМ или более высоких концентрациях (данные не показаны). Одновременно с увеличением Perk, активация pSHP2 была дозозависимо повышается после введения WP1066 (рис. 1А).
<Р> Для времени процесса исследований, AGS клетки обрабатывали в течение 0-360 мин с 5 мкМ WP1066 и фосфорилирования из JAK2, STAT3, ERK1 /2 и SHP-2 анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (фиг. 1В). Лечение WP1066 привело к быстрому торможению pJAK2, с 75% падения на 30 мин и не более 90% -ное падение на 60 мин. После этого клетки выздоровел и вернулся к базальной JAK2 фосфорилирования на 360 мин. Узор уменьшилась активация STAT3 зеркальным из JAK2 фосфорилирования. В противоположность этому, ERK1 /2 фосфорилирования значительно увеличивалась в ответ на лечение WP1066, с увеличением 250% на 15 мин, а максимальное увеличение на 460% на 60 мин, перед возвратом к базальных уровней на 360 мин. активация SHP2 внимательно следили за изменения в экспрессии ERK с максимальной индукцией через 60 мин.

WP1066 Тормозит AGS Рост через подавление пролиферации и индукции апоптоза
<р> Активированный STAT3 является признанным фактором желудка человека клетки рака роста и пролиферации [5], и длительная активация ERK1 /2 индуцирует апоптоз эпителиальных клеток желудка [25]. Продемонстрировав, что WP1066 регулирует STAT3 и ERK1 /2 сигнализации в обратной моды, мы проверили, может ли он также возмущают клеточный рост и индуцирует апоптоз клеток AGS.
<Р> Обработка клеток AGS с 5 мкМ WP1066 (рис. 2А ) привело к существенному уменьшению числа клеток по сравнению с контрольной группой (ДМСО ДМСО, 100% ± 3,14 против WP1066; 36,02% ± 3,18, р &ЛТ; 0,05). Для того, чтобы определить, является ли это снижение числа клеток было за счет пролиферации клеток или измененном апоптоза, или комбинации обоих, CFSE и аннексина V проводили окрашивание на обработанных клетках. клетки AGS, обработанные WP1066 были более интенсивно помечены CFSE, чем у пациентов, получавших ДМСО, доказательства сокращения числа клеточных делений и, следовательно, пролиферации (рис. 2В). Кроме того, большая часть клеток AGS, обработанных WP1066 метили аннексина V (фиг.2с) по сравнению с клетками, обработанными ДМСО, демонстрируя, что WP1066 также индуцирует апоптоз в клетках AGS (WP1066; 1,3-кратное увеличение; р = 0,049).

WP1066 блоки желудочный опухоль Рост gp130 ^{757FF Мыши подавлением опухоль пролиферации клеток и усиление апоптоза
<р> gp130 мышей 757FF развиваются дистальные опухоли желудка, характеризующиеся повышенной желудочной IL-11 приводом активации STAT3 [12], [13]. Так как pJAK2 и п-STAT3 блокируются WP1066 в пробирке
, мы проверили, будет ли WP1066 также блокировать развитие опухоли желудка В естественных условиях
. Лечение gp130 757FF мышей 3 раза в неделю в течение 2-х недель с /кг WP1066 значительно сниженным роста опухоли желудка 10-20 мг на 47% от 42.11 ± 3.21 мм 2 до 22,36 ± 3,64 мм 2 ( р ≪. 0,05) (рис 3A-D). ДМСО обработанные опухоли не отличались опухолей, наблюдаемых в 8-недельных мышей, возраст, при котором лечение WP1066 началось, подтвердив, что рост опухоли желудка является относительно стабильным от 8-10 недель [27], и что лечение WP1066 на самом деле вызывает регрессию опухоли, а не стаз (рис. 3А-D).
<р> Чтобы определить, является ли распространение было изменено в опухолях желудка, Ki-67 позитивных клеток /железа были определены количественно в обработанной группе. Лечение WP1066 значительно снижается эпители желудка пролиферацию клеток (ДМСО 62 ± 7,7 по сравнению с WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 окрашенных клеток /железой, р &лт; 0,05;. Рис 3E-G), демонстрируя, что WP1066 может ингибировать рост опухоли путем ингибирования пролиферации клеток. Для того, чтобы оценить влияние WP1066 на апоптоза опухолевых клеток, секции из WP1066 или ДМСО обработанных когорт окрашивали антителами против расщепленной каспазы 3, маркер апоптотической гибели клеток (рис. 3Н, I). Были значительно более апоптотических профили в WP1066 обработанных опухолей, чем в контрольной, демонстрируя четкую проапоптотического эффект WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 против ДМСО 2.65 ± 0.76 окрашенных клеток /мм 2 слизистую оболочку, р &л; 0,05;. Рис 3J ).}

WP1066 частности Цели JAK2 и STAT3 фосфорилирование к подавить Желудочный Tumourigenesis в gp130 ^{757FF Мыши
<р> Поскольку gp130 мышей 757FF развиваются опухоли в ответ на конститутивной активации gp130 [20] , мы тестировали подавлена ​​ли WP1066 вниз по течению сигнальных путей в естественных условиях.
лечение WP1066 в течение 2-х недель привело к уменьшению на 25% от относительного количества общего STAT3 в антральном отделе слизистой оболочки по сравнению с ДМСО обработанных групп (фиг. 4А) , Количество общего JAK2, AKT и ERK1 /2 не был изменен обработкой WP1066. Это говорит о том, что хроническое лечение gp130 757FF мышей с WP1066 подавляет экспрессию STAT3.
<Р> иммуноблот анализ сигналов активации продемонстрировали значительное снижение pJAK2 (80,12% ± 5,70 контроля ДМСО), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7,2 контроля ДМСО;. фиг.4В) и pERK1 /2 (72,66% контроль ± 5.23.of ДМСО;. фиг.4В). AKT фосфорилирования не был изменен обработкой WP1066. Снижение активации JAK2 и STAT3 согласуется с в пробирке
данные и известные действия WP1066.}

WP1066 Подавленные воспалительной реакции в антральном слизистая gp130 757FF Мыши
<р> Так как хронический воспалительный ответ желудка имеет решающее значение для развития опухоли [27], мы тестировали часть способа действия WP1066 ли подавить STAT3-опосредованный воспалительный ответ, который обычно способствует прогрессии опухоли. Гистологический анализ показал, что полиморфно инфильтрации в антральном из WP1066 обработанных мышей было значительно меньше, чем у контрольных мышей (фиг.5А;. ДМСО 2,45 ± 0,24 против WP1066 1,46 ± 0,22, р ≪ 0,05), в то время как lymphoplasmocytic инфильтрат не отличалась между двумя групп (. фиг.5В; ДМСО 1,73 ± 0,16 против WP1066 1,32 ± 0,20, р > 0,05).
<р> Так как воспаление желудка, как правило, опосредуется небольшого числа ключевых провоспалительных цитокинов и ферментов, мы измерили выражение избранной группы из них с помощью Q-ПЦР в ДМСО и WP1066 обработанных желудков. Экспрессия всех провоспалительных медиаторов, за исключением, IFN γ и TNF α иСОА были значительно ингибировалась обработкой WP1066 следующим образом; ИЛ-6 (. Фиг.5С; 6,0 ± 2,6 раза), ИЛ-11 (рис 5D;. 8,7 ± 3,4 раза), IL-1α (рис 5Е;. 10,9 ± 4,3) раза), IL-1β (Рис 5F.; 3 ± 0,9 раза) и СОХ2 (рис 5G;. 2,94 ± 1,05). Поэтому WP1066 ингибирование активности STAT3 и прогрессирования опухоли было связано отчасти с сокращением polymophonuclear инфильтрации и уменьшение STAT3-зависимой транскрипции провоспалительных IL-6, IL-11, IL-1 α, IL-1 и СОХ2 генов.

WP1066 тормозил выражение амфирегулином в антральном слизистая gp130 ^{757FF Мыши
<р> эффект лечения WP1066 на экспрессию фактора роста лигандов известно, играют определенную роль в росте и дифференциации желудка и в развитии gp130 опухоли 757FF также оценивали. WP1066 ингибирует экспрессию амфирегулином (1,85 ± 0,60 раза, р &ЛТ; 0,05), но не HB-EGF (рис 6.) В антральном отделе слизистой обработанных мышей. Кроме того, желудок пролиферативный лиганд и ген STAT3-регулируемых Reg1 показали сильное ингибирующее тенденцию после лечения WP1066 по сравнению с контролем ДМСО антральном (рис 6, стр. = 0,069).}

Обсуждение
<р> в этом исследовании мы показали, что WP1066 дозозависимо ингибирует сигнальный путь JAK2 /STAT3 при раке желудка (AGS) клеток человека, с последующим снижением на 60% в пролиферации клеток, а также меньшим увеличением апоптоза. Механизм для этого, вероятно, из-за двойного ингибирования фосфорилированных форм JAK2 и STAT3, тем самым снижая STAT3 транскрипционной активности, как было показано на нескольких линиях раковых клеток, включая глиомы [17], [28], [29], миелоидный лейкоз [ ,,,0],30], и меланому [20]. С другой стороны, применение WP1066 привело к увеличению взаимного ERK1 /2 активации, совпадающей с повышенной pSHP2, фосфатазы который ответственен за активацию РАС /MAP киназы сигнализации. Аналогичное наблюдение в отношении активации ERK было сделано для других клеточных линий рака, полученных из карциномы почек [18], и глиомы [28]. Таким образом, кросс-регулирование STAT3 и ERK-опосредованный сигнализации на выходе семейства ИЛ-6 цитокинов, как представляется, происходит обычно через диапазонах тканей и клеточных линий [31].
<Р> WP1066 был также эффективен при введении в естественных условиях
, где он блокирует активацию STAT3 (75%) в gp130 757FF мышиные антральных опухоли, а также снижает общий белок STAT3, предполагая, что он может снизить экспрессию STAT3
гена в желудки обработанных мышей. Это подтверждается существованием консенсусных участков для активированных STAT3 связывания на Stat3
промотор, с активацией Stat3
гена, как показано с помощью мутантного Stat3
промотор-репортер конструкции и EMSA [48] или брелка-сл [49], и предполагает, что WP1066 может ингибировать аутокринную активацию STAT3 после ингибирования JAK2 /STAT3 фосфорилирования.
<р> Как и ожидалось, уровни pJAK2 были также уменьшены в присутствии WP1066 в желудке. В отличие от эффекта WP1066 в пробирке,
ERK1 2 активации /в желудках WP1066 обработанных мышей незначительно снизилась. Причиной такого несоответствия может быть в два раза; во-первых, В естественных условиях
воздействие WP1066 был хронический по сравнению с острого воздействия в пробирке
; во-вторых, воздействие В естественных условиях
является более сложным с множеством потенциальных путей передачи сигналов с использованием молекул трансдукции общего сигнала. Тем не менее сниженная активация JAK2 и STAT3 в соответствии с установленной ролью этих фактора цитокин /роста компонентов в прогрессии рака желудка [5], [27] и сигнализации показывает, что в естественных условиях,
и при выделении из эффекты h.pylori
инфекция, это преимущественно измененное активация STAT3, а не ERK1 /2, что имеет решающее значение для развития опухоли.
<р> Совпадение с угнетением активности STAT3, применение WP1066 всего за 2 недели в естественных условиях
привело к снижению на 50% в области опухоли сопровождается аналогичным снижением пролиферации, как измерено с помощью Ki-67 окрашивания, а также сопутствующим увеличением апоптоза опухолевых клеток, как измерено с помощью активированной каспазы 3 иммунное. Это торможение роста опухоли параллельно &ГТ с; 40% -ное снижение полиморфноядерными количества клеток, а также регуляцию ассоциированных провоспалительных цитокинов, включая IL-1 α, IL-1, а также COX2, все, которые способствуют желудочного tumourigenesis. С другой стороны WP1066 не оказывает никакого влияния на IFN &gamma, ФНО, и INOS выражения, соизмеримого с отсутствием снижения лимфоцитов и макрофагов (lymphoplasmocytic инфильтрации) в течение лечения времени конечно. Ингибирование IL-1 β после того, как pSTAT3 ингибирования WP1066 особенно значительна, так как ИЛ-1β является важным регулятором секреции желудочной кислоты, сильного промотора роста опухоли в трансгенной мышиной модели рака желудка [33], и являются неотъемлемой частью из инфламмасома NLRP3 [32]. IL-11, как известно, эндогенный стимулятора антральном экспрессии IL-1 с помощью STAT3 [13], и мы показали здесь, что ИЛ-11 подавляется WP1066. Так как IL-11, как представляется, выше по течению от IL-1 в желудке, то это правдоподобно путь для ингибирования последнего после блокады активации STAT3.
<Р> Ингибирующее действие WP1066 в gp130 757FF мышь модели рака желудка, резюмировать и расширения результатов STAT3 гаплонедостаточности, сгенерированные генетически в той же самой модели мыши [26], а также использование системных антисмысловые олигонуклеотиды против STAT3 [12], что подчеркивает важность активированной сигнализации STAT3 в содействии желудка tumourigenesis. Учитывая важность IL-11 в развитии инициации опухоли и развития [12], [13], и IL-6 в содействии местной полиморфонуклеарный инфильтрации [34] в gp130 757FF мыши, показательно, что WP1066 эффективно снижена уровни экспрессии обоих цитокинов, совпадающей с разворота роста опухоли. Это подтверждает мнение о том, что STAT3 регулирует транскрипцию как IL-11 и IL-6, возможно, движимый аутокринном петли обратной связи, поскольку оба цитокины преимущественно используют STAT3 транскрипцию в желудке [23].
<Р> Reg1 является широко распространен член семейства генов Reg и известный желудочный фактор роста, который играет важную роль в качестве пролиферативного и антиапоптической регулятора в желудке обоих мышей [26], [35] и людей [36]. Ранее мы показали, что Reg1 сильно индуцируется в антральных опухолях gp130 757FF мышей совпадало с IL-6 и экспрессию IL-11, и что гаплонедостаточности результатов STAT3 в уменьшенной экспрессии Reg1, предполагая, что она представляет собой STAT3-регулируемый гена [26]. Это было подтверждено в желудочном клеточных линиях, где IL-11 [37] и IL-6 [36] стимулированных STAT3 фосфорилирования, который, в свою очередь активированного REG1 транскрипции.

• PLoS ONE: CD147 выражение в рака желудка человека связано с опухолью Рекурренции и прогноз
• PLoS One: MAP3k1 SNP Предсказывает Выживание рака желудка в китайской популяции