Ploche ONE: Inhibícia JAK2 /STAT3 Pathway Znižuje rakovina žalúdka rast in vitro a in vivo

Abstract

signálov snímača a aktivátor transkripcie-3 (STAT3) je konštitutívne aktivovaný v mnohých druhov rakoviny, kde sa podporuje rast, zápalu, angiogenézy a inhibuje apoptózu. Ukázali sme, že STAT3 je konštitutívne aktivovaný v ľudskom karcinómu žalúdka, a že chronická IL-11 riadený STAT3 transkripčný aktivita vyvoláva žalúdočné tumorogenézy v gp130 ^{757FF myší model vývoja karcinómu žalúdka. Tu sa ukazuje, že ošetrenie ľudských buniek karcinómu žalúdka AGS sa Janus kinázy (AKO) inhibítor WP1066 s dávkou, a v závislosti na čase inhibuje fosforyláciu STAT3, v spojení so zníženou JAK2 fosforylácie, zníženie proliferácie a zvýšenie apoptózy. Okrem toho, použitie intraperitoneálneho WP1066 po dobu 2 týždňov, znižuje žalúdočné objem nádoru o 50% v gp130 757FF myš zhodného so zníženou aktiváciu JAK2 a STAT3 v porovnaní s kontrolami, littermate ošetrenými nosičom. Gastrických nádorov od myší liečených WP1066- znížil polymorfonukle- zápal, totožnú s inhibíciu radu prozápalových cytokínov, vrátane IL-11, IL-6 a IL-1, rovnako ako rastové faktory REG1 a amfiregulin. Tieto výsledky ukazujú, že WP1066 môže blokovať proliferáciu, zmierňovať zápal a indukovať apoptózu v žalúdočnej nádorových buniek tým, že inhibuje fosforyláciu STAT3, a že mnohé cytokíny a rastové faktory, ktoré podporujú rast nádorov žalúdka sú regulované mechanizmy STAT3 závislé. WP1066 môžu tvoriť základ pre budúci liečiv proti rakovine žalúdka}

Citácia :. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) inhibícia JAK2 /STAT3 Pathway Znižuje žalúdočné rakovina Rast In vitro stroje a In Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10,1371 /journal.pone.0095993

Editor: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, United States of America

prijatá: 21.januára 2014; Prijaté: 01.04.2014; Uverejnené: 07.05.2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Tento projekt bol podporený z prostriedkov; NHMRC Austrália projekt (www.nhmrc.gov.au) grantǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanóm Spore P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) mozog Spore 2 P50 CA127001-06. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy :. Waldemar Priebe držať patenty a má finančný záujem na vývoji zloženého WP1066 takto; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki zlúčenín pri liečení bunkových proliferatívnych ochorení. Zjednocuje štáty patent WO /2005/058829 12/01/2004. Všimnite si tiež, že autori majú za predpokladu, pozmenený vyhlásenie o protichodných záujmov, pokiaľ ide o patent na WP1066 držanie W. Priebe. Autori tiež vyhlasujú, že "to nič nemení svoju priľnavosť k PLoS ONE politiky na zdieľanie dát a materiálov".

Úvod

Zo siedmich signál Označenie odmeriavanie a aktivátor transkripcie (STAT) rodinným príslušníkom , STAT3 bol najviac trvalo podieľa na celej rade bežných typov rakoviny u ľudí, vrátane; pľúc, prsníka, vaječníkov, prostaty, hrubého čreva a [1], [2], [3], [4]. To platí aj v ľudskom karcinómu žalúdka [5], [6], [7], v ktorom STAT3 aktivácia chronickým fosforylácie na tyrozínu (Y) sú umiestnené 705 bol spojený s zvýšenému rastu, angiogenézy, invázie a metastáz primárneho karcinómu [ ,,,0],6], [7], [8]. Inhibícia STAT3 transkripčné aktivity v ľudskej rakovine žalúdka môže stanoviť možný spôsob, ako znížiť vysoké chorobnosti a predĺžiť život medzi pacientmi s rakovinou žalúdka po celom svete.

V neprítomnosti funkčných mutácií v géne STAT3, STAT3 aberantne aktivita je vyvolaná trvalú aktivitu proti prúdu od tyrozín kináz, a /alebo unscheduled- alebo nadmernú expresiu stimulačných ligandov [9], [10], [11]. To je jasne ilustrované v gp130 ^{757F /F myší model vývoja rakoviny žalúdka, v ktorom Phe pre substitúciu v polohe 757 na intracelulárne rameno rodinného signalizácia gp130 receptora IL-6, Tyr súčasne zabraňuje SHP2 a SOCS3 väzba , čo vedie k inhibíciu ras /MAP kinázy prenos signálov, a hyperaktivace STAT3 o konštitutívny fosforylácie [23], [24], [26]. V poslednej dobe sme a iní ukázali, že nádorov žalúdka, významné zvýšenie transkripcie zhodujú so zvýšenou expresiou gp130 ligand IL-11 v ľudských rakovinou žalúdka a myšiach modeloch tohto ochorenia [5], [12], [13]. V poslednom menovanom IL-6 je postrádateľný, ale IL-11 je nevyhnutne nutné pre tumorogenézy [12], [13]. Naviac IL-11 /STAT3 bolo preukázané, že je dôležitým faktorom pre atrofickou gastritídou, prvý prekancerózne lézie v žalúdku po chronickej infekcie baktériou Helicobacter pylori
[14].}

k dnešnému dňu boli početné kinázy bola hlásená indukcia STAT3 aktivitu po naviazaní ligand /receptor, avšak iba JAK1 a JAK2 predstavujú STAT3 fosforylácii na dokovacia s IL-11 /gp130 receptora komplexu [15] a tieto IL-11 /gp130 sa prednostne viaže JAK2 [16]. Tieto pozorovania naznačujú, že JAK2 a STAT3 predstavujú sľubné ciele pre vytváranie terapeutické antagonistu k potlačeniu IL-11 /STAT3 signalizáciu v ľudskom karcinómu žalúdka.

V poslednej dobe kyselinu kávovú derivát WP1066, štruktúrne podobnej inhibítora nízka účinnosť tyrozínkinázy AG490 , bolo preukázané, že je veľmi silný inhibítor JAK2 /STAT3 ciest v transformovanej mozgu glióm [17] a renálny karcinóm [18] bunkových línií, čo vedie k inhibícii rastu a indukcie klasických pre-apoptotických dráh. Okrem toho, WP1066 je účinný in vivo
proti vysoko malígnych melanómov a leukémiou, ktoré sú pozitívne pre mutáciu JAK2 V617F- +, ktorý podporuje konštitutívny aktiváciu kinázy JAK2 [19], [20], [21], [22 ]. Nepublikované štúdie ukazujú, že WP1066 nie je inhibítorom ATP-kompetitívne a môže blokovať expresiu fosforylovaného JAK2 a STAT3; Okrem toho, p-STAT3-Y705 môže byť inhibovaná nezávisle na stave JAK2. Tak WP1066 predstavuje jedinečnú príležitosť inhibovať obaja p-AKO a p-STAT3 a následne účinne blokovať JAK2 /STAT3 signálne dráhy a STAT3 transkripčné aktivitu.

Ak chcete vyskúšať myšlienku duálny blokáde JAK2 a aktivácia STAT3 v žalúdku a následného vývoja rakoviny žalúdka, sme použili obaja in vitro stroje a in vivo
prístupy na posúdenie, či WP1066 môže spomaliť alebo blokovať rast nádorov žalúdka cez inhibíciu JAK2 /STAT3 činnosti, a ďalšie úzko súvisiace onkogénne signálne dráhy. Tu ukazujeme, že WP1066 účinne inhibuje fosforyláciu STAT3, a indukuje apoptózu v žalúdočnej rakovina bunkové línie, a že môže inhibovať rast nádoru žalúdka in vivo
tým, že blokuje indukciu kľúčových génov STAT3-regulované.

materiály a metódy

Príprava a skladovanie inhibítory kinázy

inhibítora WP1066 bol vyvinutý a syntetizovaný Waldemar Priebe a spolupracovníci z University of Texas MD Anderson Cancer Center, a prúd akciové bola dodaná zdvorilosť Houston Pharmaceuticals Inc., Houston, Texas, USA. Zásoby boli resuspendované v hybr-Max DMSO a skladované pri -20 ° C. Zásoby boli len na jedno použitie, a nie re-zmrznutý po rozmrazení.

In vitro kultúra

AGS bunky (ATCC, Manassas VA, USA) boli bunky udržiavané v kompletnom médiu obsahujúcom RPMI + Glutamaxem ( Gibco, Life Sciences, Invitrogen OR, USA), doplnenom 10% fetálnom hovädzom sérom, 50 IU penicilínu pri 37 ° C v 5% CO _{2 až 95% vzduchu.}

Western Blotting

proteínové extrakty boli pripravené buď TRIzolu činidla (Life Technologies, Vic, Austrália), v súlade s pokynmi výrobcu a proteínové pelety boli resuspendované v 1% dodecylsulfát sodný, ktorý obsahuje 2 mmol /l na _{3VO 4 alebo RIPA vyrovnávacia pamäť. Alikvótne (30 ug) boli podrobené elektroforéze sodík dodecyl sulfát /polyakrylamidovom gélu. Membrány boli blokované a inkubované pri teplote 4 ° C cez noc v odstredeného mlieka s nasledujúcimi protilátkami; STAT3, Py (705) STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, pS (473) AKT, JAK2, Py (1007), Y (1008) JAK2 (Cell signalizácia,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (abcaδ5). Membrány boli inkubované s peroxidom-konjugovanou sekundárnou protilátkou (Dako, polyklonálne králičie proti moru, HRP konjugovaný, # P0399) a vizualizované zosilnenou chemiluminiscenčnej metódy (Amersham, Buckinghamshire, UK). Pre analýzu pásy boli kvantifikované pomocou systému Množstvo One softvér (BIORADE) a fosforylovanej proteíny exprimované v pomere k GAPDH z duplikátu membrány. Aspoň n = 8 vzoriek boli stanovené buď spracovaním.}

Cell Counting podľa Haemocytometry

Bunky boli nasadené v množstve 5 x 10 ^{4 buniek /ml v 24-jamkovom formáte v kompletnom médiu a nechali sa rásť v pokoji po dobu 24 hodín. Bunky boli ošetrené s príslušnou koncentráciou WP1066 alebo DMSO ako kontrola pre 0-360 min. Potom, čo boli bunky ošetrenie uvolnený pôsobením trypsínu-EDTA 0,25% (Sigma), farebné trypánovej-blue 0,4% (Sigma) v riedení 1: 1 po dobu 5 minút pri teplote 4 ° C, a počítané na hemocytometru.}

karboxyfluorescein diacetát sukcinimidyl ester (CFSE) Farbenie

Pre označenie AGS bunky s CFSE boli bunky uvolnený pôsobením trypsínu-EDTA 0,25% (Sigma) a resuspendované v PBS predhriateho /0,1% BSA pri hustote 1 × 10 ^{6 buniek /ml. 10 mM CFSE farbivo (od firmy Invitrogen) sa pripraví podľa protokolu výrobcu, potom bolo pridané 5 ul /ml a dôkladne premieša prevracaním na zabezpečenie homogénnej označenie buniek. Vzorky boli inkubované pri teplote 37 ° C počas 10 minút, rozloží pridaním 5 objemov média ľadového a inkubované po dobu 5 minút na ľade. Vzorky boli potom premyté 5x v médiu a nanesené na 2 x 10 5 buniek /jamka (6-jamkové misky). Vzorka buniek odfotil po pokovovania a značené 100 ug /ml propidium jodidu (PI) a analyzované prietokovou cytometriou pre jednotnosť a intenzite značenia. Bunky potom boli pestované v kompletnom médiu počas 48 hodín, po ktorej boli ošetrených s alebo bez vhodného WP1066 (5 uM) pri 37 ° C s 5% CO _{2 a 95% vzduchu počas 18 hodín. Potom boli bunky trypsinizovány ako je uvedené vyššie a resuspendované v kompletnom médiu, značené 100 ug /ml PI a analyzované prietokovou cytometriou pri 488 ηM. Dáta bola zaznamenaná pomocou diva BD FACS (BD Biosiences) softvérový balík a analyzované Modfit LT softvérového balíka (VSH).}}

annexinu farbenie

AGS bunky boli pestované v kompletnom médiu na 2 × 10 ^{5 buniek /jamka v 6-jamkových doštičkách s DMSO (kontrolný nosič), alebo WP1066 (5 uM), alebo etopozid (200 uM, pozitívna kontrola) pri teplote 37 ° C s 5% CO _{2 95% vzduch nerušene po dobu 24 hodín. Bunky potom boli ošetrené nasledujúcim spôsobom; premyté v ľadovo chladnom PBS, trypsinizovány ako je uvedené vyššie, a hustota buniek určí haemocytometry pred resuspendováním vo väzobnom pufri annexinu na 1 x 10 6 buniek /ml. 100 ul tohto lieku odfotil, a inkubované s 5 ul zložky A (annexin Fluór 488 annexinu V zložky, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% hovädzí sérový albumín) a 1 ug /ml PI počas 15 minút pri teplote miestnosti v tme. Vzorky potom boli zmiešané so 400 ul annexinu väzbového pufra a analyzované prietokovou cytometriou. Vhodnými kontrolami +/- reakčnej zložky boli pripravené s cieľom prispôsobiť vychýlenia hradlovanie. Dáta bola zaznamenaná pomocou BD FACS diva (BD Biosiences) softvérový balík.}}

Ethics Prehlásenie

Všetky pokusy na zvieratách boli vykonané v súlade s austrálskym kódexom pre starostlivosť a používanie zvierat na vedecké účely (7 ^{ročník), a po schválení Murdoch Childrens Výskumný ústav etickou komisiou zvierat (aplikácia # A583). Bolo vynaložené úsilie, aby sa minimalizovalo nepohodlie v týchto minimálne invazívnych procedúr.}

In vivo
Experimenty

gp130 ^{Myši 757F /F už boli popísané [23]. Stručne povedané, diskrétne antrálnej nádory rozvinúť do 4 týždňov veku a rýchlo rastú, až približne 12 týždňov. Oni rekapitulovať vývojové charakteristiky črevnej typu adenokarcinómom žalúdka, vrátane submukóznu invázie ale nemajú metastasise [24]. Zvieratá boli chované v SPF priestor v Murdoch detskej Výskumného ústavu a potvrdené, že je prosté Helicobacter pylori
. Tri skupiny myší boli hodnotené na vývoj nádoru: 1) vo veku 8 týždňov gp130 757F /F myši, ktoré dostali žiadne ošetrenie (n = 10); 2) gp130 757F /F myší, ktoré dostali WP1066 od 8 do 10 týždňov veku (n = 10); a 3) gp130 757F /F myši, ktoré dostali DMSO vozidlo od 8 do 10 týždňov veku (n = 8). Pred experimentovanie všetky zvieratá bola hodnotená na pohodu, zváži a objemy odpadových vypočítava obdobne. Kontrolné zvieratá dostala ekvivalentných objemov DMSO vozidlá WP1066-ošetrených zvierat. Myši dostali 2 počiatočné intraperitoneálna injekcia WP1066 dávke 10 mg /kg telesnej hmotnosti každých 48 hodín k ich aklimatizácii na účinky liečby, potom sa dostal 5 injekcie WP1066 pri 20 mg /kg každé 48 hodín na dokončenie 2 týždenný režim. Intra-peritoneálnej miesta vpichu sa striedali cez štyri kvadranty brucha myší. Na záver experimentu boli myši usmrtené a žalúdky resekciu pre fotografiu a tkanív kolekcie.}

makroskopické a histologické posúdenie

Žalúdky boli rýchlo vyrezané pozdĺž menšie zakrivenie, pripojené von, vyfotografoval a fixované v 4% paraformaldehydu pufrovanom pred spracovaním. Parafínové rezy (4 um) boli zafarbené hematoxylínom a eosínu (H &E). Morfometrická analýza bola vykonaná za použitia open-source softvér ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Pre meranie plôch, obrazy žalúdočnej sliznice boli ručne načrtol s softvér kresliaci nástroj a kvantifikáciu programu použitého na generovanie merania

In vivo
Imunohistochémia &.; Kvantifikácia

Imunohistochemické analýza bola vykonaná s protilátkami pre Ki-67 (PharmingenȦ609) a aktivovanej kaspázy 3 (Cell Signalling technológieϤ1). Antigén vyhľadávania bola vykonaná varom častiach počas 30 minút v 10 mM kyselinou citrónovou (pH 6,0). Farbenie bola doplnená príslušná druhovo špecifická biotinylizované sekundárnej protilátky (DAKO, Dánsko), avidín a biotínom značenej chrenovou peroxidázou makromolekulárnej komplex (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-Diaminobenzidine (Sigma, St Louis, MI) a kontrastne hematoxylín. Pre Ki-67 kvantifikácie, zaslepeným pozorovateľom počítajú počtu farbených buniek na žľaze v niekoľkých sekciách na jedno zviera pomocou ImageJ ako predtým. Dáta bola vyjadrená ako počet Ki-67 pozitívnych buniek na žľazy. U aktívneho kaspasy 3 kvantifikáciu, je zaslepený pozorovateľ počítal počet zafarbených buniek na ploche sliznice v 4 náhodných oblastiach rovnako orientované dutine jedno zviera pomocou ImageJ ako predtým. Dáta bola vyjadrená ako číslo aktivované kaspázy 3 pozitívnych buniek na ploche sliznice

Semi-kvantitatívna analýza Morfometrická zápalu

Zápal bola hodnotená pomocou mikroskopie v zaslepenej fáze na H &. E-morený profily. Antrálnej nádorové tkanivá boli analyzované a minimálne 3 prúžkov na zviera (n = 7) boli uvedené semikvantitatívny skóre podľa stupňa zápalových buniek z minimálnej na maximálnu = 0 = 3. Lymphoplasmocytic a polymorfonukleárne infiltráciou boli hodnotené nezávisle na sebe. Priemerné hodnoty potom boli porovnané na účely štatistickej analýzy.

Real-Time (Q) -PCR Analýza

RNA bola extrahovaná TRIzolu činidla (Life Technologies, Vic, Austrália) v súlade s pokynmi výrobcu. Celková RNA (3 ug) bola reverzne transkribovaných na cDNA s použitím Moloneyho vírusu myší leukémie reverznej transkriptázy (Promega, Madison, WI) opatrenom základným náterom 0,3 ug oligo (dT). Q-PCR priméry boli navrhnuté s použitím Primer Express (Applied Biosystems) (tabuľka 1). SYBR green chémie (Applied Biosystems) bol použitý ako L32 Normalizer. Podmienky PCR boli 95 ° C počas 10 minút, potom 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C počas 15 sekúnd; Reakcie boli vykonávané na prístroji Applied Biosystems AB7500 RT PCR. Výsledky boli analyzované za použitia detektora sekvencií softvér, a relatívne rozdiely násobné boli stanovené s použitím metódy ΔΔCt, ako je popísané výrobcom.

Štatistická analýza

Dáta bola vyjadrená ako priemer ± štandardná odchýlka priemeru , Hodnoty získané z kvantitatívnej analýzy génovej expresie alebo počtu zafarbených buniek bol v porovnaní medzi vzorkami ANOVA, a tam, kde bol zistený štatisticky významný rozdiel jednotlivé skupiny boli ďalej analyzované s príslušným parametrickým alebo Neparametrické štatistiky za použitia štatistického balíčka SigmaStat. Štatistická významnosť bola definovaná ako p≤0.05.

Výsledky

WP1066 Rýchlo Potláča fosforylovaný Y (705) STAT3 a vyvoláva fosforylácie ERK1 /2 v AGS Cells

Ako- STAT a cesta ERK1 /2, sú dve hlavné cesty prenosu signálu po prúde od gp130. Tieto dve cesty majú podobné a inverzné regulačné účinky na sebe, najlepšie dokazuje negatívne reguláciou pSTAT3 po aktivácii ERK1 /2 [47].

experimentov dávka-odpoveď WP1066 sa vykonáva tak, že AGS buniek 0 , 1, 2 alebo 5 uM WP1066 po dobu 60 minút a meranie fosforylácie JAK2, STAT3, ERK1 /2 a SHP-2. Ako sa dalo očakávať, pJAK2 bola silne inhibovaná WP1066 pri všetkých testovaných koncentráciách a podľa > 80% na 5 um. 5 uM WP1066 tiež dával maximálnu inhibíciu pSTAT3 a vzájomnej aktiváciu pERK1 /2 (obr. 1A), so znížením celkovej STAT3 na 5 uM alebo vyššiu koncentráciu (dáta nie sú uvedené). Zhodný s nárastom perky, aktivácia pSHP2 sa zvyšuje v závislosti od dávky po podaní WP1066 (obr. 1A).

časového priebehu štúdie, AGS bunky boli liečení po dobu 0-360 minút s 5 uM WP1066 a fosforylácie z JAK2, STAT3, ERK1 /2 a SHP-2 boli analyzované metódou Western blot (obr. 1B). Liečba WP1066 za následok rýchle inhibíciu pJAK2, s 75% poklesom o 30 minút a maximálne 90% poklesu o 60 min. Potom sa bunky oddelia a vracia do bazálnej JAK2 fosforylácie 360 ​​min. Vzor sa znížila aktivácia STAT3 odrážal to JAK2 fosforylácie. Naproti tomu, ERK1 /2 fosforylácie bola výrazne zvýšená v reakcii na liečbu WP1066, so zvýšením o 250% u 15 min a maximálne zvýšenie 460% od 60 minút, než sa vráti na bazálnej hladiny o 360 min. Aktivácia SHP2 tesne nasledovaný zmeny v EKR výrazu s maximálnym indukciou na 60 min.

WP1066 inhibuje AGS Rast vďaka potlačeniu proliferácie a indukciu apoptózy

Aktivované STAT3 je zavedený vodič ľudské nádorové bunky žalúdočné rast a proliferácia [5], a predĺžené aktivácia ERK1 /2 indukuje apoptózu u žalúdočných epiteliálnych buniek [25]. Ak preukázali, že WP1066 reguluje STAT3 a ERK1 /2 signalizáciu v recipročným spôsobom, sme testovali, či sa môžu rušiť bunkový rast a indukuje apoptózu buniek AGS.

Čistenie AGS buniek s 5 uM WP1066 (obr. 2A ) malo za následok podstatné zníženie počtu buniek vzhľadom k DMSO ovládacie prvky (DMSO, 100% ± 3,14 vs. WP1066; 36,02% ± 3,18, p 0,05). Na určenie, či toto zníženie počtu buniek bolo v dôsledku zmenené proliferácie buniek alebo apoptózy, alebo kombinácia oboch, CFSE a annexin V sfarbenie bola vykonaná na ošetrených buniek. AGS bunky ošetrené WP1066 boli intenzívnejšie značené pomocou CFSE, než u pacientov liečených DMSO, dôkazy o zníženie počtu bunkových delení a preto proliferáciu (Obr. 2B). Okrem toho, väčší podiel AGS buniek ošetrených WP1066 boli značené annexinu V (2c) v porovnaní s bunkami ošetrenými DMSO, čo ukazuje, že WP1066 tiež spôsobovať apoptózu v AGS bunkách (WP1066 1,3 násobné zvýšenie; p = 0,049).

WP1066 bloky žalúdku nádor Rast gp130 ^{757FF myšou potláčaní nádorovej bunkovej proliferácie a posilnenie apoptózy}

gp130 ^{757FF myšou vyvinúť distálnej žalúdočnej nádory charakterizované zvýšenou žalúdočnej IL-11 riadený STAT3 aktivácia [12], [13]. Vzhľadom k tomu, pJAK2 a p-STAT3 sú blokované WP1066 in vitro
, sme testovali, či WP1066 by tiež blokujú žalúdočné vývoj nádoru in vivo
. Liečba gp130 757FF myši 3krát týždenne po dobu 2 týždňov s 10 až 20 mg /kg WP1066 výrazne zníženú žalúdočnú rastu nádoru o 47% z 42,11 ± 3,21 mm 2 až 22.36 ± 3,64 mm 2 ( p. < 0,05) (obr 3A-D). DMSO ošetrené nádory boli nelíši od nádorov pozorovaných v osem týždňov starých myší, vek, v ktorom sa začala liečba WP1066, čo potvrdzuje, že rast nádoru žalúdka je relatívne stabilný od 8-10 týždňov [27], a že liečba WP1066 vlastne spôsobuje regresiu nádoru namiesto stázy (obr. 3A-D).}

na určenie, či proliferácia bola zmenená nádorov žalúdka, Ki-67 pozitívnych buniek /žľazy boli kvantifikované v ošetrenom kohorte. Liečba WP1066 výrazne znížiť žalúdočnej proliferáciu epiteliálnych buniek (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 Zafarbené bunky /upchávky, p menšie ako 0,05, obr. 3E-G), ktoré preukazujú, že WP1066 môžu inhibovať nádorový rast inhibíciou bunkovej proliferácie. Pre posúdenie účinkov WP1066 na nádorové bunkové apoptózy, profily z WP1066 alebo DMSO-ošetrené kohorty boli zafarbené protilátkou proti rozštiepené kaspázy 3, marker apoptotické smrti buniek (Obr. 3 H, I). tam podstatne apoptotické profily u nádorov WP1066 liečených ako kontroly, čo ukazuje jasnú pre proapoptotický účinok WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 zafarbených buniek /mm ^{2 sliznice, p menšie ako 0,05, obr. 3J ).}

WP1066 cielene JAK2 a STAT3 fosforylácie potlačené žalúdočnej tumorogenézy v gp130 ^{757FF myši}

Pretože gp130 ^{757FF myší vyvinúť nádory v reakcii na aktiváciu konštitutívny gp 130 [20] , sme testovali, či WP1066 potlačené následné signálnej dráhy in vivo.
liečbu WP1066 po dobu 2 týždňov viedlo k poklesu o 25% v relatívnom množstve celkového STAT3 v antrálnej sliznici v porovnaní s DMSO liečených skupín (obr. 4A) , Množstvo celkového JAK2, AKT a ERK1 /2, nebola zmenená pôsobením WP1066. To naznačuje, že chronická liečba gp130 757FF myší s WP1066 potláča expresiu STAT3.}

Imunoblotová analýza signalizáciu aktivácie preukázala významné zníženie pJAK2 (80,12% ± 5,70 kontroly DMSO), pY705 STAT3 (26,84 % ± 7,2 kontroly DMSO; obr. 4B) a pERK1 /2 (72,66% kontrola ± 5.23.of DMSO, obr. 4B). AKT fosforylácie sa nemení pôsobením WP1066. Znížená aktivácia JAK2 a STAT3 je v súlade s in vitro
dáta a známe akcie WP1066.

WP1066 potlačil zápalovej odpovede v antrálnej sliznici gp130 757FF Myši

Vzhľadom k tomu, chronické zápalové reakcie v žalúdku je rozhodujúci pre rozvoj nádoru [27], sme testovali, či časť mechanizmu pôsobenia WP1066 je potlačiť STAT3 sprostredkovaná zápalová reakcia, ktoré sa zvyčajne podieľa na progresiu nádoru. Histologická analýza ukázala, že polymorfonukleárne infiltrácie do antra ošetrených myší WP1066 bola významne nižšia ako u kontrolných myší (obr 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p menšie ako 0,05), zatiaľ čo lymphoplasmocytic infiltrát nelíšil medzi oboma skupiny (viď obr. 5B, DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p 0,05).

Vzhľadom k tomu, žalúdočné zápal je zvyčajne sprostredkovaný malom počte kľúčových pre-zápalových cytokínov a enzýmov, sme merali expresiu z vybranej skupiny týchto Q-PCR v DMSO a WP1066 ošetrené žalúdky. Expresia všetkých prozápalových mediátorov s výnimkou IFNy, TNFa a INOS bola významne inhibovaná ošetrením WP1066 nasledujúcim spôsobom; IL-6 (obr. 5C; 6,0 ± 2,6 krát), IL-11 (obrázok 5D ,. 8,7 ± 3,4 krát), IL-1α (obr 5E;. 10,9 ± 4,3) krát), IL-1β (obr 5F. , 3 ± 0,9 krát) a COX2 (obr 5G ,. 2,94 ± 1,05). Preto WP1066 inhibícia aktivity STAT3 a progresie nádoru bol čiastočne v dôsledku zníženia polymophonuclear infiltráciu a znižuje STAT3 závislú transkripciu prozápalových IL-6, IL-11, IL-1 a, IL-1 a COX2 gény.

WP1066 inhiboval vyjadrenie amfiregulin v antrálnej sliznici gp130 ^{757FF Myši}

vplyv liečby WP1066 na expresiu rastových faktorov ligandov je známe, že hrajú úlohu v raste a diferenciácii žalúdka a vo vývoji gp130 ^{757FF nádory bola tiež hodnotená. WP1066 inhibuje expresiu amfiregulin (1,85 ± 0,60 násobne, p menšie ako 0,05), ale nie HB-EGF (obr. 6) v antrálnej sliznici ošetrených myší. Okrem toho, žalúdok proliferačnej ligand a gén STAT3 regulovaný REG1 vykazovali silný inhibičný trend po liečbe WP1066 v porovnaní s kontrolnou DMSO dutine (Obr 6;. P = 0,069).}

Diskusia

v tejto štúdii sme ukazujú, že WP1066 v závislosti na dávke inhibuje JAK2 /STAT3 signálne dráhu v ľudských rakovina žalúdka (AGS) buniek, čo vedie k zníženiu o 60% bunkovej proliferácie, a menšie zvýšenie apoptózy. Mechanizmus pre toto je pravdepodobne v dôsledku dvojitého inhibíciu fosforylovaných foriem JAK2 a STAT3, čím sa znižuje STAT3 transkripčný aktivitu, ako bolo ukázané na niekoľko nádorových bunkových línií, vrátane gliómov [17], [28], [29], myeloidná leukémia [ ,,,0],30], a melanóm [20]. Na druhej strane, WP1066 aplikácia viedla k nárastu vzájomnej ERK1 /2 aktivácia totožné so zvýšenou pSHP2, fosfatázy zodpovedný za aktiváciu Ras /MAP kinázy signálne dráhu. Podobné pozorovania s ohľadom na aktiváciu EKR bol pre iných nádorových bunkových línií odvodených od karcinómu obličky [18], a glióm [28]. Z tohto dôvodu, cross-regulácia STAT3 a ERK-sprostredkované signalizácia downstream of IL-6 rodinných cytokínov sa zdá, dochádza zvyčajne v niekoľkých rozsahoch tkanív a bunkových línií [31].

WP1066 bol tiež účinný pri podávaní in vivo
, kde je blokovaná aktivácia STAT3 (75%) v gp130 ^{757FF myš antrálnej nádorov, a tiež znížiť celkovú STAT3 proteín, čo naznačuje, že to môže znížiť expresiu STAT3
génu v žalúdky ošetrených myší. To je podporované existencie konsenzuálnych miest pre aktivované STAT3 záväzné na STAT3
promótor, s aktiváciou STAT3
gén ako bolo preukázané pomocou mutantný STAT3
promótor-reportér konštrukty a EMSA [48], alebo na čipovej nasledujúce [49], a navrhuje, že WP1066 môže inhibovať autokrinný aktiváciu STAT3 po inhibícia JAK2 /STAT3 fosforylácie.}

Ako sa dalo očakávať, úroveň pJAK2 bol tiež znížený v prítomnosti WP1066 v žalúdku. Na rozdiel od účinku WP1066 in vitro,
ERK1 /2 v aktivácii žalúdkov WP1066 ošetrených myší bola mierne znížená. Dôvod pre tento rozdiel môže byť dvojaký; Po prvé, in vivo
expozícia WP1066 bola chronická v porovnaní s akútnou expozícii in vitro
; Po druhé, expozícia in vivo
je zložitejšia s niekoľkými potenciálnymi signálnych dráh využívajúcich transdukčných molekúl bežné signálu. Avšak znížená aktivácia JAK2 a STAT3 je v súlade s ustálenou úlohu týchto cytokínov /rastových faktorov signalizačné komponenty v žalúdku progresii rakoviny [5], [27], a ukazuje, že in vivo, stroje a keď izolovaný z účinky H. pylori
infekcie, je prevažne zmenená aktivácia STAT3, a nie ERK1 /2, ktorý je zásadný pre vývoj nádoru.

zhodná s inhibíciou aktivity STAT3, aplikácia WP1066 len 2 týždne in vivo
viedlo k 50% zníženiu v oblasti nádoru sprevádzané podobné zníženie proliferácie, merané Ki-67 farbenie a sprievodným zvýšením apoptózy nádorových buniek, merané aktívnym kaspázy 3 imunologické. Táto inhibícia rastu nádoru bola Paralelizované > pokles 40% počtu polymorfonukleárnych buniek, a up-reguláciu združených prozápalových cytokínov, vrátane IL-1 a, IL-1, ako aj COX2, z ktorých všetky podporovať žalúdočné tumorogenézy. Na druhú stranu WP1066 nemal žiadny vplyv na IFNy, TNFa, a INOS expresie úmerne s nedostatkom zníženie lymfocytov a makrofágov (lymphoplasmocytic infiltrácie) v priebehu spracovania časového priebehu. Inhibícia IL-1 po pSTAT3 inhibíciu WP1066 je zvlášť významné, pretože IL-1β je dôležitým regulátorom sekrécie žalúdočnej kyseliny, silný promótor rastu nádoru v transgénnym myšiam modeli karcinómu žalúdka [33], a je neoddeliteľnou súčasťou z inflamazóm NLRP3 [32]. IL-11 je známe, že je endogénna stimulátor antrálnej IL-1 expresie pomocou STAT3 [13], a my sme tu ukázané, že IL-11 je inhibovaná WP1066. Vzhľadom k tomu, IL-11 sa zdá byť pred IL-1 v žalúdku, potom je to vierohodný cesta pre tohto orgánu inhibícia po blokáde aktivácie STAT3.

Inhibičný účinok WP1066 v gp130 ^{757FF myšou model karcinómu žalúdka, zhrnúť a rozšíriť výsledky STAT3 haploinsufficiency generovaných geneticky rovnakým myšiam modelu [26], ako aj používanie systémových antisencie oligonukleotidov proti STAT3 [12], čím sa zdôrazňuje význam aktívneho STAT3 signalizácia pri uľahčovaní žalúdočné tumorogenézy. Vzhľadom na význam IL-11 pri podpore vzniku a rozvoja [12] nádoru [13], a IL-6 v uľahčovaní miestnej polymorfonukle- infiltráciu [34] v gp130 757FF myš, je príznačné, že WP1066 účinne znížila hladiny expresie oboch cytokínov zhodný s obrátením rastu nádoru. To podporuje názor, že STAT3 reguluje transkripciu oboch IL-11 a IL-6, prípadne poháňané autokrinný slučky spätnej väzby, pretože oba cytokíny prednostne používajú STAT3 transkripciu v žalúdku [23].}

REG1 je široko distribuované členom génovej rodiny Reg a známy žalúdočné rastový faktor, ktorý hrá významnú úlohu ako proliferatívne a anti-apoptotický regulátor v žalúdku ako u myší [26], [35] a ľudí [36]. Už skôr sme ukázali, že REG1 je silne indukovaná v antrálnej nádorov gp130 ^{757FF myši totožný s IL-6 a IL-11 expresie, a že haploinsufficiency výsledkov STAT3 v zníženú expresiu REG1, čo naznačuje, že sa jedná o STAT3 regulovaná gen [26]. To bolo potvrdené v žalúdočných bunkových línií, kde IL-11 [37], a IL-6 [36] stimulovaných STAT3 fosforyláciu ktorý zase aktivuje REG1 transkripciu. Naša súčasná dáta sú v súlade s týmito výsledkami v tom, že WP1066 vykazuje silnú tendenciu inhibovať REG1 v žalúdočných nádorov gp130 757FF myši spolu s IL-6 a IL-11 inhibícia. H.}

• Ploche ONE: CD147 Expression v rakovina žalúdka u ľudí je spojený s recidívy a Prognosis
• Ploche on: MAP3k1 SNP Predpovedá prežívanie rakoviny žalúdka v čínskej populácie