PLoS ONE: slopinimas JAK2 /stat3 pathway Mažina skrandžio vėžio augimą in vitro ir in vivo

Anotacija

Signalo keitiklis ir Aktyvatorius transkripcijos-3 (STAT3) yra constitutively aktyvuota daugelyje vėžio kur jis skatina augimą, uždegimas, angiogenezę ir slopina apoptozę. Mes parodė, kad STAT3 yra constitutively aktyvuota žmogaus skrandžio vėžiu ir kad lėtinis IL-11 varoma STAT3 transkripcijos veikla skatina skrandžio tumorogenezės į gp 130 ^{757FF pelės modelio skrandžio vėžio vystymąsi. Čia mes parodysime, kad gydymas žmogaus AGS skrandžio vėžio ląstelių su Janus kinazės (JAK) inhibitorius WP1066 doz, ir skirtingu laiku darytą slopina stat3 fosforilinimas, kartu su riboto JAK2 fosforilinimo, sumažėjęs platinimu ir padidėjusio apoptozės. Be to, taikant į pilvaplėvės ertmę, WP1066 2 savaites, sumažėjęs skrandžio naviko tūrį iki 50% per gp 130 757FF pelės sutampantį su sumažintu JAK2 ir stat3 aktyvavimo, palyginti su transporto priemonių apdorojimo, littermate kontrolės. Skrandžio navikų iš WP1066- pelių buvo sumažintas polimorfonuklearinių uždegimą, sutampančią su slopinimo daugelio priešuždegiminiais citokinų, įskaitant IL-11, IL-6 ir IL-1β, taip pat augimo faktoriai Reg1 ir amphiregulin. Šie rezultatai rodo, kad WP1066 gali blokuoti ginklų platinimu, mažina uždegimą ir sukelti apoptozę skrandžio naviko ląstelių slopindamas stat3 fosforilinimas, ir kad daugelis citokinai ir augimo faktoriai, kurie skatina skrandžio naviko augimą reguliuoja stat3 priklausoma mechanizmus. WP1066 gali sudaryti ateities terapijos prieš skrandžio vėžio pagrindą}

nurodomoji dalis:. Judd LM, Menheniott TR lydeka O Jackson CB Howlett, M, Kalantzis A et al., (2014) slopinimas JAK2 /STAT3 Kelias Mažina skrandžio vėžio augimo vitro parsisiųsti ir , in vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. Doi: 10,1371 /journal.pone.0095993

redaktorius: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt universiteto medicinos mokykla, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Sausis 21, 2014 m Priėmė: Balandžio 1, 2014 m Paskelbta: Gegužės 7, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Judd et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis projektas parėmė lėšomis; NHMRC Australija (www.nhmrc.gov.au) projekto dotacijaǽ.165 NIH /NVI JAV (nih.gov; www.cancer.gov) melanomos SPORE P50 CA093459-06, NIH /NVI JAV (nih.gov; www.cancer. valst), smegenų SPORE 2 P50 CA127001-06. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų. Waldemar Priebe palaikykite patentų ir turi tokį finansinį suinteresuotumą kombinuotųjų WP1066 plėtros taip; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki junginius, panaudojimas ląstelių proliferacinių ligų gydymui. Jungtinėse Valstijose patentas WO /2005/058829 12/01/2004. Taip pat atkreipkite dėmesį, kad autoriai pateikė iš dalies pakeistą pranešimą apie konkuruojančių interesų dėl patentą WP1066 turimą W. Priebe. Autoriai taip pat pareiškia, kad "tai nekeičia mūsų, kaip laikomasi PLoS ONE politiką dėl dalijimosi duomenimis ir medžiagoms."

Įvadas

Iš septynių Signal keitiklio ir aktyvatorių transkripcijos (STAT) Šeimos nariai , STAT3 buvo pats nuosekliai susijęs bendrų vėžio žmonėms, įskaitant diapazonas; plaučių, krūties, kiaušidžių, prostatos, gaubtinės žarnos ir [1], [2], [3], [4]. Tai taip pat teisinga žmogaus skrandžio vėžio [5], [6], [7], kurioje STAT3 aktyvavimo lėtinio fosforilinimo ne tirozino (Y) gyvena 705 buvo susieti su didesniu augimo, angiogenezės, invazija ir metastazių pirminės vėžio [ ,,,0],6], [7], [8]. Taigi, slopinimas stat3 transkripcijos veiklos žmogaus skrandžio vėžio gali numatyti galimus būdus sumažinti didelį sergamumą ir pratęsti gyvenimą tarp skrandžio vėžiu sergančių pacientų visame pasaulyje.

funkcinių mutacijų nesant stat3 geno, netipinė STAT3 veikla yra sukeliama nuolat veiklos iš tiekėjų tirozino kinazės, ir /arba unscheduled- arba per-išraiškos stimuliuojantį ligandų [9], [10], [11]. Tai yra aiškiai Pavyzdys, kaip gp 130 ^{757F /F pelės modelis skrandžio vėžio išsivystymo,, kurioje Phe už Tyr keitimą, prie 757 pozicijos dėl ląstelėje rankos kurį iš IL-6 šeimos signalizacijos receptoriaus gp 130 vienu metu apsaugo nuo SHP2 ir SOCS3 privalomas , todėl slopinamas Ras /MAP kinazės signalo perdavime, ir hiperaktyvaciją STAT3 iki steigiamojo fosforilinimo [23], [24], [26]. Neseniai mes ir kiti parodė, kad skrandžio navikų, gerokai padidėjo transkripcijos sutampa su padidėjusia išraiška gp 130 ligando IL-11 žmogaus skrandžio vėžio ir pelės modeliai šios ligos [5], [12], [13]. Pastarojoje IL-6 yra nebūtinas, bet IL-11 yra visiškai reikalingas tumorogenezės [12], [13]. Be to, IL-11 /STAT3 buvo įrodyta, kad būti svarbus veiksnys atrofinį gastritas, pirmoji priešvėžinė pažeidimas skrandžio po lėtinė infekcija bakterijos Helicobacter pylori
[14].}

iki šiol buvo pranešta apie daug kinazės sukelti stat3 veiklą po ligandų /receptorių, tačiau tik JAK1 ir JAK2 sąskaita stat3 fosforilinimo ant jungiamojo su IL-11 /gp 130 receptoriaus kompleksas [15], ir iš šių IL-11 /gp 130 pirmenybė jungiasi JAK2 [16]. Šios pastabos rodo, kad JAK2 and stat3 dabartiniai perspektyvių tikslai projektuojant gydomąjį blokatoriai slopina IL-11 /stat3 signalizacijos žmogaus skrandžio vėžio.

Neseniai kofeino rūgšties darinys WP1066, struktūriškai susijęs su žema potencija tirozino kinazės inhibitorius AG490 , buvo įrodyta, kad būti labai stipriai slopina JAK2 /stat3 keliu į transformuota smegenų glioma [17] ir inkstų karcinoma [18] ląstelių linijų, todėl augimo slopinimo ir sužadinimo klasikinių proapoptozinis kelius. Be to, WP1066 yra veiksmingas vivo
nuo labai piktybinių melanomos ir Leukemija, kurie yra teigiamas JAK2-V617F + mutacija, kuris skatina steigiamasis JAK2 kinazės aktyvinimas [19], [20], [21], [22 ]. Neskelbtų tyrimai rodo, kad WP1066 nėra ATF konkurenciniu būdu slopina, ir gali blokuoti išraišką fosforilinto JAK2 ir STAT3; be to, p-STAT3-Y705 gali būti slopinamas nepriklausomai nuo JAK2 statusą. Taigi, WP1066 pristato unikalią galimybę slopinti tiek p-Jak ir p-stat3, o vėliau stipriai blokuoti JAK2 /stat3 signalinio kelio ir stat3 transkripcijos veiklą.

Norėdami išbandyti dvigubos blokados JAK2 ir stat3 aktyvavimo idėją skrandyje ir po skrandžio vėžio išsivystymo, mes naudojamas tiek in vitro, parsisiųsti ir vivo
metodus siekiant įvertinti, ar WP1066 gali sulėtinti ar sustabdyti skrandžio naviko augimą slopindami JAK2 /stat3 veiklos ir kiti glaudžiai susiję onkogeninėmis signalizacijos būdus. Čia mes parodome, kad WP1066 efektyviai slopina stat3 fosforilinimas ir indukuoja apoptozę skrandžio vėžio ląstelių linijos, ir kad jis gali slopinti skrandžio naviko augimą vivo
blokuoja indukcijos pagrindinių stat3 reguliuojamų genų.

medžiagos ir metodai

ruošimas ir laikymas kinazės inhibitoriai

inhibitorius WP1066 buvo sukurta ir susintetinti Teksaso MD Anderson Cancer Center universiteto Waldemar Priebe ir bendradarbiais, ir dabartinis akcijų buvo pateikta mandagumo Houston farmacija Inc, Hiustonas, Teksasas, JAV. Atsargos buvo resuspenduota Hybri-Max DMSO ir laikomas -20 ° C. Atsargos buvo tik vienkartinio naudojimo, o ne iš naujo užšaldyti atšildžius.

in vitro kultūros

AGS ląstelės (ATCC, Manasasas VA, JAV) ląstelės buvo laikomi visiškai žiniasklaidos, kuriuose RPMI + Glutamax ( Gibco Gyvosios gamtos mokslai, Invitrogen ARBA, JAV) žiniasklaida papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo, 50 TV penicilino 37 ° C 5% CO _{2-95% oro.}

Imunoblotingo

baltymo ekstraktai buvo paruošti arba su TRIzol reagento (Life technologies, VIC, Australia) pagal gamintojo instrukcijas ir baltymingų granules resuspenduojamos 1% natrio laurilsulfatas, kuriame 2 mmol /l Na _{3VO 4 arba Ripa buferis. Mėginiai (30 mikrogramų) buvo atliktas natrio dodecilo sulfatas /poliakrilamido gelyje. Membranos buvo užblokuotas ir inkubuojami esant 4 ° C temperatūroje per naktį į lieso pieno su šių antikūnų; STAT3, py (705) STAT3, ERK1 /2, PT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, py (1007) Y (1008) JAK2 (Mobilusis signalizacijos,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Membranos buvo inkubuojami su peroksido konjuguoto antrinio antikūno (Dako polikloninis kiaulių kovos triušis, HRP konjuguota, # P0399) ir regimos glaudesnio cheminės liuminescencijos (Amersham, Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė). Analizei juostos buvo kiekybiškai naudojant Kiekis One programinės įrangos sistemą (BIORAD) ir fosforilintus baltymus išreikštas kaip GAPDH proporcingai nuo dublikato membrana. Bent n = 8 mėginiai buvo įvertintas abiejų gydymo.}

Mobilusis skaičiuojant Haemocytometry

Ląstelės buvo pasėtos ne 5 × 10 ^{4 ląstelių /ml 24 šulinėlių formatu visiškai žiniasklaidos ir leidžiama augti neliečiami 24 valandas. Ląstelės buvo elgiamasi su atitinkamu koncentracijos WP1066 ar DMSO kaip valdymo 0-360 min. Po to, kai gydymo ląstelės buvo išjudinta, apdorojant tripsinu-EDTA 0,25% (Sigma), dažytas su Trypan-mėlyna 0,4% (Sigma), esant 1:1 praskiedimo 5 minutes, esant 4 ° C, ir suskaičiuoti ant haemocytometer.}

karboksifluoresceino dIACETATAS sukcinimidil esteris (CFSE) Dažymo

Jei ženklinti AGS ląsteles CFSE, ląstelės buvo išjudinta iki gydymo tripsino-EDTA 0,25% (Sigma), resuspenduojama pašildyto PBS /0,1% BSA tokiu tankumu 1 × 10 ^{6 ląstelių /ml. 10 mM CFSE dažų (Invitrogen) buvo parengta pagal gamintojo protokolą, tada 5 mikrol /ml, buvo įtraukta ir apverčiant išmaišomas, siekiant užtikrinti vienodą ženklinimą ląsteles. Mėginiai buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 10 minučių, skaldomas, pridedant 5 tomai ledinio laikmenų ir inkubuojami 5 minutes ant ledo. tada mėginiai buvo plaunami 5 kartus žiniasklaidoje ir pasėja 2 × 10 5 ląstelių /taip (6-bei patiekalai). Iš ląstelių mėginys buvo imtasi po dengimo ir ženklinami etiketėmis su 100 mikrogramų /ml, propidiumo jodido (PI) ir analizuojami tėkmės citometrijos vienodumo ir intensyvumo ženklinimo. tada ląstelės buvo auginamos visiškai terpėje 48 valandas po to, kai kuriomis jie buvo apdoroti su arba be tinkamo WP1066 (5 pM) 37 ° C temperatūroje su 5% CO _{2 95% oro 18 valandų. tada ląstelės buvo trypsinised, kaip nurodyta aukščiau ir resuspenduojamos visiškai laikmenų, pažymėti su 100 mikrogramų /ml PI, ir analizuojami, taikant tėkmės citometrijos esant 488 ηM. Duomenys buvo registruojami naudojant BD FACS Diva (BD Biosiences) programinės įrangos paketą ir analizuojami Modfit LT programinės įrangos paketo (VSH).}}

aneksinu Dažymo

AGS ląstelės buvo auginamos visiškoje laikmenas 2 × 10 ^{5 ląstelių /gerai 6-duobučių lėkštelėse su DMSO (nešiklį reguliuojamas), arba WP1066 (5 mikronų), arba etopozido (200 pM; teigiamas reguliuojamas) 37 ° C temperatūroje su 5% CO _{2 95% oro neliečiami 24 valandas. tada ląstelės buvo gydomi taip; plauti ledinio PBS, trypsinised, kaip nurodyta pirmiau, ir ląstelių tankis nustatomas pagal haemocytometry prieš susispenduotų į aneksino privalomu buferio 1 × 10 6 ląstelių /ml. 100 įxL šio preparato buvo imtasi, ir inkubuojama su 5 įxL komponentas A (aneksinas Fluor 488 aneksino V komponentą, 25 mM Hepes, 140 mm NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% galvijų serumo albumino) ir 1 g /ml PI 15 minučių kambario temperatūroje, tamsoje. tada mėginiai buvo sumaišyti su 400 pL aneksino privalomą buferio ir analizuojami tėkmės citometrijos metodą. Tinkamus patikrinimus +/- reakcijos komponentai buvo pasirengę koreguoti šališkumo strobavimo. Duomenys buvo registruojami naudojant BD FACS Diva (BD Biosiences) programinės įrangos paketai.}}

Etika pareiškimas

Visi bandymai su gyvūnais buvo atliekami laikantis Australijos kodekso priežiūros ir naudojimo gyvūnų naudojimą mokslo tikslais (7 ^{-asis leidimas), o po patvirtinimo iš Murdoch Childrens tyrimų instituto gyvūnų etikos komiteto (paraiškos # A583). buvo dedamos visos pastangos, siekiant sumažinti diskomfortą šių minimaliai invazinės procedūros.}

, in vivo
eksperimentai

gp 130 ^{757F /F pelių buvo aprašyta anksčiau [23]. Trumpai tariant, diskrečiųjų antralinių navikai vystytis 4 savaičių amžiaus ir sparčiai auga iki maždaug 12 savaičių. Jie Apibendrinant raidos ypatumus žarnyno tipo skrandžio adenokarcinoma, įskaitant gleivine invazijos, bet ne metastasise [24]. Gyvūnai buvo laikomi SPF įrenginio Tuo Murdoch vaikų tyrimo instituto ir patvirtino, kad be Helicobacter pylori
. buvo vertinami trys grupės pelėms auglių vystymuisi: 1) 8 savaitės amžiaus gp 130 757F /F pelių, kurios gavo jokio gydymo (n = 10); 2) gp 130 757F /F pelių, kurios gavo WP1066 nuo 8 iki 10 savaičių amžiaus (n = 10); ir 3) gp 130 757F /F pelių, kurios gavo DMSO automobilį nuo 8 iki 10 savaičių amžiaus (n = 8). Prieš eksperimentavimo visus gyvūnus buvo vertinamas gerovei, sveriami ir gydymo apimtys atitinkamai apskaičiuotas. Kontrolės gyvūnai gavo lygiaverčius kiekius DMSO transporto priemonės WP1066 gydytų gyvūnų. Pelės gavo 2 pradinius viduje peritoninės injekcijos WP1066 ne 10 mg /kg kas 48 val, kad prisitaikys juos gydymo poveikių, tada gavo 5 injekcijos WP1066 20 mg /kg kas 48 val užbaigti 2 savaičių gydymo. Vidiniai pilvaplėvės injekcijos vietos buvo kaitaliojami per keturias ketvirčiai nuo pelių pilvo. Pasibaigus eksperimento išvados, pelėms buvo numarinti, ir skrandžiai rezekcijos dėl fotografijos ir audinių kolekcija.}

makroskopinę ir histologinis įvertinimas

Skrandžiai sparčiai išpjaustytų palei mažesniu kreivės, segami iš, fotografavo ir nustatyta 4% buferiniame paraformaldehido prieš apdorojant. Parafino skyriai (4 pm) buvo tamsintas hematoksilinu ir eozinu (H & E). Morfometriniai analizė atlikta naudojant atviro kodo ImageJ programinė įranga (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Dėl vietovės matavimus, vaizdai skrandžio gleivinės buvo rankiniu nurodyta su programine įranga piešimo įrankį ir kiekybinio programa, naudojama generuoti matavimus

, in vivo
imunohistocheminis &.; Kiekybinis

Imunohistocheminis analizė buvo atlikta su antikūnais už Ki-67 (PharmingenȦ.609) ir aktyvuota kaspazės 3 (Cell signalizacijos technologijųϤ1). Antigenas paieška buvo atlikta pagal verdantys skyriuose, 30 minučių 10 mM citrinų rūgšties (pH 6,0). Dažymo buvo baigtas su atitinkamų rūšių Biotinilintų antrinių antikūnų (DaKo, Danija), avidino ir biotinilintu krienų peroksidazės stambiamolekulinį kompleksas (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija), 3,3'-diaminobenzidinas ( "Sigma, St Louis, MI) ir counterstained su hematoksilinu. Dėl Ki-67 skaičiais, užkoduotą stebėtojo suskaičiuoti skaičiaus tamsintas ląstelių viename liaukos keliose atkarpose vienam gyvūnui naudojant ImageJ kaip ir anksčiau. Duomenys buvo išreikštas numerio Ki-67 teigiamų ląstelių viename liaukos. Dėl aktyvuota kaspazės 3 kiekybinio, užkoduotą stebėtojas skaičiuojami vitražas ląstelių viename ploto gleivinės skaičių 4 atsitiktinių sričių pat orientuotos antralinėje dalyje vienam gyvūnui naudojant ImageJ kaip ir anksčiau. Duomenys buvo išreikštas numeris aktyvuojamas kaspazė 3 teigiamų ląstelių viename ploto gleivinės

Pusiau kiekybinis morfometriniai analizė uždegimas

Uždegimas buvo įvertintas naudojant mikroskopą aklu metodu, o H &. El tamsintas sekcijos. Antralinių navikų audiniuose, buvo analizuojami ir 3 juostelėmis per gyvūno (n = 7) buvo suteiktas pusiau kiekybinį rezultatą pagal uždegiminių ląstelių laipsnį iš minimalaus = 0 iki didžiausio = 3. Lymphoplasmocytic ir polimorfonuklearinių įsiskverbti buvo įvertintas nepriklausomai. Tuomet vidutinės vertės buvo lyginamos statistinei analizei.

Realaus laiko (K) -PCR analizė

RNR buvo ekstrahuojamas TRIzol reagento (Life Technologies, VIC, Australia) pagal gamintojo instrukcijas. Iš viso RNR (3 mikrogramų) buvo atvirkštinis transkripcija į kDNR naudojant Moloney pelių leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės (PROMEGA, Madison, WI) gruntuoti 0,3 mikrogramų oligo (dT). "Q-PGR pradmenys buvo sukurta, naudojant gruntą Express (Taikomoji BIOSYSTEMS) (1 lentelė). SYBR žalia chemija (Applied Biosystems) buvo naudojamas su L32 kaip normalizuoja. PGR sąlygos buvo 95 ° C temperatūroje 10 min, po to 40 ciklai 95 ° C temperatūroje 15 sekundžių ir 60 ° C temperatūroje 15 sekundžių; reakcijos buvo paleisti ant Applied Biosystems AB7500 RT PGR aparato. Rezultatai buvo analizuojami naudojant seka detektoriaus programinę įrangą ir santykiniai kartus skirtumai buvo nustatyti naudojant ΔΔCt metodu, kaip aprašyta gamintojo.

Statistinė analizė

duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± standartinė paklaida vidurkio , Vertės, gautos iš kiekybinės analizės genų ekspresiją arba skaičius tamsintas ląstelių buvo palyginti tarp mėginių ANOVA, ir kur buvo nustatyta, kad statistiškai reikšmingas skirtumas kiekvienai grupei buvo analizuojami su atitinkamu parametro arba neparametriniai statistikos naudojant Sigmastat statistinį paketą. Statistinis reikšmingumas buvo apibrėžtas kaip p≤0.05.

Rezultatai

WP1066 Sparčiai Stabdo fosforilinamos Y (705) STAT3 ir skatina fosforilinimas ERK1 /2 AGS ląstelių

JAK- STAT kelią ir ERK1 /2 stažuotė yra du pagrindiniai signalo perdavimo keliai pasroviui nuo gp 130. Šie du keliai turi abipuses ir atgalinės reguliavimo poveikį viena kitai, geriausias parodė neigiamą reguliavimo pSTAT3 po ERK1 /2 aktyvavimo [47].

WP1066 dozės reagavimo eksperimentai buvo atliekami apdorojant AGS ląsteles 0 , 1, 2 arba 5 mkm WP1066 60 min ir matavimo fosforilinimas JAK2, STAT3, ERK1 /2 ir SHP-2. Kaip ir tikėtasi, pJAK2 buvo stipriai slopina WP1066 ne visų tirtų koncentracijų ir > 80% ne 5 pm. 5 mkm WP1066 taip pat davė maksimalų slopina pSTAT3 ir abipusį aktyvavimo pERK1 /2 (pav. 1a) su bendrame STAT3 mažinimo bent 5 pm, arba didesnės koncentracijos (duomenys neparodyti). Sutampa su į gražintis padidėjimas, pSHP2 aktyvacija priklausomai nuo dozės sustiprintas po WP1066 administracija (1a pav.).

laiko kurso studijas, AGS ląstelės buvo gydomi 0-360 min su 5 pm WP1066 ir fosforilinimo iš JAK2, STAT3, ERK1 /2 ir SHP-2 buvo analizuojami Imunoblotingo (pav. 1B). WP1066 gydymas lėmė greitai nuslopina pJAK2, su 75% sumažės 30 min, o maksimalus 90% sumažės 60 min. Vėliau ląstelės atsigavo ir grįžo į bazinę JAK2 fosforilinimo iki 360 min. Iš modelis sumažėjo STAT3 aktyvacijos veidrodinį kad JAK2 fosforilinimo. Priešingai, ERK1 /2 fosforilinimas buvo ženkliai išaugo reaguodama į WP1066 gydymo, su 250% padidėjo 15 min, o maksimalus 460% padidėjo 60 min, prieš grįžtant į bazinių lygių 360 min. SHP2 aktyvacijos atidžiai stebėti pokyčius ERK išraiškos su maksimaliu indukcijos 60 min.

WP1066 slopina AGS augimo per slopinimas platinimu ir sukeliama apoptozė

aktyvuotos STAT3 yra nustatyta vairuotojas žmogaus skrandžio vėžio ląstelių augimas ir plitimas [5], ir ilgai aktyvacijos ERK1 /2 indukuoja apoptozę skrandžio epitelinių ląstelių [25]. Kuri įrodė, jog WP1066 reguliuoja stat3 ir ERK1 /2 signalizacijos abipusiškumo mados, mes patikrinome, ar ji taip pat gali jaudinti ląstelių augimą ir sukelti apoptozę AGS ląsteles.

Gydymas AGS ląstelių su 5 pm WP1066 (Pav. 2A ) lėmė gerokai sumažinti ląstelių skaičius, palyginti su DMSO valdiklių (DMSO; 100% ± 3,14 vs WP1066; 36.02% ± 3,18, p < 0,05). Norėdami nustatyti, ar šis sumažėjimas ląstelių skaičius buvo dėl pakitusios ląstelių dauginimasis ar apoptozės, ar abiejų kartu, CFSE ir aneksinu dažymo buvo atliktas paveiktų ląstelių. AGS ląstelės gydomi WP1066 buvo intensyviau paženklinti CFSE nei gydomi DMSO, įrodymų dėl sumažėjusio ląstelių padalinių skaičių ir todėl platinimu (2b pav.). Be to, didesnę dalį AGS ląstelių gydomiems WP1066 buvo paženklinti aneksinu (2C paveikslas), palyginti su ląstelėmis gydomų DMSO, įrodančią, kad WP1066 taip pat sukeltos apoptozės į AGS ląstelių (WP1066; 1,3 kartus padidėjo; p = 0,049).

WP1066 blokai skrandžio Naviko augimas gp 130 ^{757FF pelių kovos Naviko ląstelių proliferaciją ir stiprinimas apoptozę}

gp 130 ^{757FF pelės plėtoti distalinių skrandžio navikų būdinga padidėjusi skrandžio IL-11 varomas STAT3 aktyvacijos [12], [13]. Nuo pJAK2 ir p-STAT3 yra užblokuotas WP1066 in vitro
, mes patikrinome, ar WP1066 taip pat blokuoti skrandžio naviko vystymąsi vivo
. Gydymas gp 130 757FF pelių 3 kartus per savaitę 2 savaites su 10-20 mg /kg kūno svorio WP1066 žymiai sumažinto skrandžio naviko augimą 47% nuo 42.11 ± 3.21 mm 2 22.36 ± 3.64 mm 2 ( p. < 0,05) (pav 3A-D). DMSO gydyti navikai buvo nesiskiria pastebėtų 8 savaitės amžiaus pelių auglių, amžius, kurio WP1066 gydymas pradėtas, patvirtinantis, kad skrandžio naviko augimas yra gana stabili nuo 8-10 savaičių [27], ir kad WP1066 gydymas iš tikrųjų sukelia naviko regresiją, o ne sąstovis (pav. 3A-D).}

Norėdami nustatyti, ar platinimu buvo pakeista skrandžio auglių, Ki-67 teigiamų ląstelių /liaukų buvo kiekybiškai apdorotame kohortos. WP1066 gydymas žymiai sumažino skrandžio epitelio ląstelių proliferaciją (DMSO 62 ± 7,7 vs WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 Dėmėti ląstelių /liaukos, p < 0,05; pav. 3E-G), įrodantys, kad WP1066 gali slopinti auglio augimą slopina ląstelių proliferaciją. Įvertinti WP1066 poveikį naviko ląstelių apoptozę, skyriai iš WP1066 arba DMSO-apdorojimo grupėmis, buvo tamsintas su antikūnu prieš suskaldyti kaspazė, 3, iš apoptozės ląstelių žūtį gaudantis (pav. 3H, I). Nebuvo žymiai Apoptozinės profiliai WP1066 gydytų navikų nei kontrolės, rodo aiškų proapoptozinis poveikį WP1066 (WP1066 25,25 ± 5.32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 dažytos ląstelių /mm ^{2 gleivinė, P < 0,05; pav. 3J ).}

WP1066 konkrečiai skirta JAK2 ir stat3 fosforilinimo slopinti Skrandžio tumorogenezės į gp 130 ^{757FF pelės}

Kadangi gp 130 ^{757FF pelių kurti navikų atsakas į steigiamąjį gp 130 aktyvavimo [20] , mes patikrinome, ar WP1066 slopinamas tolesnis signalizacijos keliai in vivo.
WP1066 gydymas 2 savaites, 25% sumažėja santykinis sumos viso STAT3 į antralinių gleivinės, palyginti su DMSO gydytų grupių (. 4A pav) , Iš viso JAK2, AKT ir ERK1 /2 suma nebuvo pakeista WP1066 gydymą. Tai rodo, kad lėtinis gydymas gp 130 757FF peles su WP1066 slopina išraišką STAT3.}

Imunoblotingas signalizacijos aktyvavimo parodė, kad gerokai sumažėtų pJAK2 (80,12% ± 5,70 DMSO reguliuojamas), pY705 stat3 (26,84 % ± 7.2 DMSO kontrolę; 4B pav) ir pERK1 /2 (72,66% ± 5.23.of DMSO kontrolė;. 4B pav).. AKT fosforilinimas nėra pakeistas WP1066 gydymą. Sumažintas aktyvavimo JAK2 ir STAT3 yra suderinamas su in vitro
duomenys ir žinomi veiksmai WP1066.

WP1066 slopino uždegiminio atsako į antralinių gleivinę gp 130 757FF Pelės

nuo lėtinė uždegiminė reakcija skrandyje yra labai svarbus naviko vystymosi [27], mes patikrinome, ar dalis veiksmų WP1066 režimu yra slopinti stat3 tarpininkaujant uždegiminį atsaką, kuris paprastai prisideda prie naviko progresavimo. Histologinis tyrimas atskleidė, kad polimorfonuklearinių infiltracija į WP1066 pelių antralinėje dalyje buvo gerokai mažesnis nei kontrolinių pelių (pav 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p < 0,05), o lymphoplasmocytic Infiltrate nesiskyrė tarp dviejų grupės (pav. 5B; DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p > 0,05).

nuo skrandžio uždegimas paprastai tarpininkaujant nedaugeliui pagrindinių PRO-uždegiminių citokinų ir fermentų, mes matuojamas išraiška iš pasirinktos grupės tai Q-PGR DMSO ir WP1066-apdorotus skrandžius. Išraiška Visi PRO-uždegiminių mediatorių su IFNγ, TNF ir iAOS išskyrus reikšmingai slopino WP1066 gydymo taip; IL-6 (pav. 5C; 6,0 ± 2,6 karto), IL-11 (pav 5D;. 8,7 ± 3,4 karto), IL-1α (5E pav;. 10,9 ± 4,3) kartus), IL-1β (pav 5F.; 3 ± 0,9 karto) ir COX2 (pav 5G;. 2,94 ± 1,05). Todėl WP1066 slopinimas stat3 veiklos ir naviko progresavimas buvo iš dalies dėl sumažėjusio polymophonuclear infiltracijos ir sumažinta stat3 priklausoma transkripciją PRO-uždegiminių IL-6, IL-11, IL-1α, IL-1β ir COX2 genai.

WP1066 Slopino Amphiregulin išraiška antralinių gleivinę gp 130 757FF Pelės

iš WP1066 gydymo įtaka augimo faktoriaus ligandų žinoma, vaidina svarbų vaidmenį augimui ir diferenciacijai skrandžio išraiškos ir į gp 130 plėtrai ^{757FF navikai taip pat buvo įvertintas. WP1066 slopino amphiregulin išraiška (1,85 ± 0,60 karto, p < 0,05), bet ne HB-EGF (6 pav.), Esantį antralinių gleivinę, pagal pelių. Be to, skrandžio proliferacinis ligandas ir STAT3-reguliuojama genas Reg1 parodė tvirtą slopinančio tendenciją po WP1066 gydymui, palyginus su DMSO kontrolės antralinėje dalyje (6 pav.; P = 0,069).}

Aptarimas

šiame tyrime mes įrodyti, kad WP1066 priklausomai nuo dozės slopina JAK2 /stat3 signalizacijos kelią į žmogaus skrandžio vėžys (AGS) ląstelių, atitinkamai 60% sumažinti ląstelių proliferaciją ir mažesnio didinimo apoptozės. Tokia tvarka yra greičiausiai dėl dvigubos slopinimu fosforilintų formų JAK2 ir STAT3 taip sumažinant stat3 transkripcijos veiklą, kaip jau buvo parodyta keliems vėžio ląstelių linijas, įskaitant glioma [17], [28], [29], mieloleukemija [ ,,,0],30], o melanomos [20]. Kita vertus, WP1066 taikymas lėmė abipusis padidėjimo ERK1 /2 aktyvinimo sutampa su padidintu pSHP2, fosfatazės, atsakingo už aktyvuoti Ras /MAP kinazės signalizacijos kelią. Panašus stebėjimas, atsižvelgiant į ERK aktyvavimo buvo padaryta kitų vėžio ląstelių linijų, gautų iš inkstų karcinomos [18], ir glioma [28]. Todėl tarpvalstybinio reguliavimas STAT3 ir ERK tarpininkaujant signalizacijos pasroviui IL-6 šeimos citokinų pasirodo pasitaiko dažniausiai per audinių ir ląstelių linijų [31].

WP1066 taip pat buvo veiksmingas, kai skiriamas intervalus in vivo
, kur jis užblokuotas stat3 aktyvinimas (75%) ir gp 130 ^{757FF pelės antralinių navikai, taip pat sumažinti bendrą stat3 baltymų, o tai rodo, kad ji gali sumažinti išraišką stat3
genas į skrandžiai pelių. Tai patvirtina konsensuso svetainių aktyvuota STAT3 privalomas stat3
promotoriaus egzistavimą, su aktyvavimo stat3
genas kaip įrodytas, naudojant mutantas stat3
promotoriaus-reporteris konstruktai ir EJSA [48] arba lusto punktus [49], ir rodo, kad WP1066 gali slopinti autokrining aktyvavimo STAT3 po slopinimu JAK2 /stat3 fosforilinimo.}

Kaip ir tikėtasi, pJAK2 lygiai taip pat buvo sumažintas dalyvaujant WP1066 skrandyje. Skirtingai nuo WP1066 poveikio in vitro,
ERK1 /2 aktyvinimo skrandžius WP1066 pelių buvo šiek tiek sumažėjo. Šio skirtumo priežastis gali būti du kartus; Pirma, in vivo
poveikis WP1066 buvo lėtinis palyginti su ūmaus poveikio in vitro
; antra, ekspozicijos vivo
yra sudėtingesnė su keliais potencialiais signaliniu keliu, naudojant bendras signalo perdavime molekules. Nepaisant to, sumažėjo aktyvavimo JAK2 ir STAT3 dera su nustatyta vaidmenį šių citokinų /augimo faktoriaus signalizacijos komponentus skrandžio vėžio progresavimo [5], [27], o tai rodo, kad vivo, parsisiųsti ir kai izoliuota nuo į poveikis H.pylori
infekcija, tai daugiausia pakitęs aktyvavimo STAT3, o ne ERK1 /2, kuris yra labai svarbus naviko vystymąsi.

sutampa su slopinimu stat3 veiklos taikymas WP1066 tik 2 savaites in vivo
lėmė 50% sumažėja naviko srityje kartu su panašaus sumažinti platinimo matuojant Ki-67 dažymą, o kartu padidinti vėžinių ląstelių apoptozę, matuojant aktyvuota kaspazė 3 imunodažymu. Šis naviko augimo slopinimas buvo lygiagrečiai pagal > 40% sumažėja polimorfonuklearinių ląstelių skaičių ir up-reguliavimo asocijuotų PRO-uždegiminių citokinų, įskaitant IL-1α, IL-1β taip pat COX2, visi, kurie skatina skrandžio tumorogenezės. Kita vertus WP1066 neturėjo IFNγ, TNF ir iAOS išraiškos, proporcingą sumažinimą limfocitų ir makrofagų (lymphoplasmocytic infiltracijos) Per gydymo laiko žinoma trūkumo poveikį. IL-1β slopinimas po pSTAT3 slopina WP1066 yra ypač svarbūs, nes IL-1β yra svarbus reguliatorius skrandžio rūgšties sekrecijos, kuris yra stiprus promotorius bet kokių naviko augimo transgeninio pelės modelio skrandžio vėžio [33], ir neatskiriama iš NLRP3 inflammasome [32]. IL-11 yra žinoma, kad endogeninio stimuliatorius antralinių IL-1β išraiška per STAT3 [13], ir čia mes parodėme, kad IL-11 yra slopinamas WP1066. Nuo IL-11, atrodo, prieš IL-1β skrandyje, tai yra tikėtinas kelias už pastarojo slopinimas po blokados stat3 aktyvacijos.

slopinantis poveikis WP1066 į gp 130 ^{757FF pelės modelis skrandžio vėžio, reziumuoti ir išplėsti stat3 haploinsufficiency rezultatus generuoja genetiškai toje pačioje pelės modelį [26], taip pat sisteminių antiprasmiai naudojimą prieš STAT3 [12], taip pabrėždamas aktyvintų stat3 signalizacijos svarbą palengvinant skrandžio tumorogenezės. Atsižvelgiant į tai, IL-11 svarbą skatinant naviko inicijuoti ir plėtoti [12], [13], ir IL-6 palengvinti vietos polimorfonuklearinių infiltraciją [34] Jei gp 130 757FF pelė, svarbu, kad WP1066 efektyviai sumažintas ekspresijos lygis abiejų citokinų sutampantį su atstatymui naviko augimą. Tai patvirtina, kad STAT3 reguliuoja tiek IL-11 ir IL-6 transkripciją, galbūt lėmė autokrino grįžtamojo ryšio ciklais, nes abi citokinai pirmenybė panaudoti stat3 rašybą skrandžio [23].}

Reg1 yra plačiai platinamas narys Reg genų šeimos ir žinoma skrandžio augimo faktoriaus, kuris vaidina svarbų vaidmenį kaip proliferacijos ir anti-apoptozės reguliatorius abiejų pelių [26] skrandžio, [35] ir žmonės [36]. Mes jau anksčiau parodė, kad Reg1 yra tvirtai sukeltas antralinių navikų gp 130 ^{757FF pelių sutapti su IL-6 ir IL-11 raišką, ir tos stat3 sąlygoja sumažėjusį išraiška Reg1 haploinsufficiency, tai rodo, kad ji yra STAT3-reguliuojama genas [26]. Tai buvo patvirtinta skrandžio ląstelių linijas, kuriose IL-11 [37] ir IL-6 [36] skatino stat3 fosforilinimas, kuri, savo ruožtu, aktyvuota Reg1 transkripciją. Mūsų dabartiniai duomenys atitinka šių rezultatų, nes WP1066 rodo stiprią tendenciją slopinti Reg1 skrandžio navikų gp 130 757FF pelės kartu su IL-6 ir IL-11 slopinimo. h.}

• PLoS ONE: CD147 išraiška žmogaus skrandžio vėžys yra susijęs su auglio augimą ir Prognosis
• PLoS ONE: a MAP3k1 SNP prognozuoja išlikimo skrandžio vėžio į Kinijos gyventojų