PLoS ONE: Die Hemmung der JAK2 /STAT3 Pathway Reduziert Magenkrebs Wachstum in vitro und in vivo

Abstrakt

Signal Transducer und Aktivator der Transkription-3 (STAT3) bei vielen Krebsarten konstitutiv aktiviert wird, wo sie das Wachstum fördert, Entzündung, Angiogenese und hemmt die Apoptose. Wir haben gezeigt, dass STAT3 konstitutiv in menschlichen Magenkrebs aktiviert ist, und dass die chronische IL-11-driven STAT3 Transkriptionsaktivität induziert Magentumorgenese in der gp130 ^{757FF Mausmodell von Magenkrebsentwicklung. Hier zeigen wir, dass die Behandlung von menschlichem Magenkrebs AGS-Zellen mit dem Janus Kinase (JAK) -Inhibitor WP1066 dosis- und zeitabhängig STAT3-Phosphorylierung hemmt, in Verbindung mit reduzierten JAK2 Phosphorylierung, reduzierte Proliferation und erhöhte Apoptose. Zusätzlich Anwendung intraperitoneal WP1066 für 2 Wochen, verringert um 50% Magentumorvolumen in der gp130 757FF Maus koinzident mit reduzierten JAK2 und STAT3-Aktivierung im Vergleich zu mit Vehikel behandelten, littermate Kontrollen. Magentumoren von WP1066- behandelten Mäuse hatten polymorphkernigen Entzündung reduziert, koinzident mit der Hemmung der zahlreiche proinflammatorische Zytokine einschließlich IL-11, IL-6 und IL-1β, sowie das Wachstum Reg1 und Amphiregulin Faktoren ab. Diese Ergebnisse zeigen, dass WP1066 Proliferation blockieren kann, die Entzündung zu verringern und induzieren Apoptose in Tumorzellen des Magens durch die Hemmung der STAT3-Phosphorylierung und dass viele Zytokine und Wachstumsfaktoren, die Magentumorwachstum fördern von STAT3-abhängige Mechanismen reguliert werden. WP1066 können für zukünftige Therapeutika gegen Magenkrebs bilden die Basis}

Citation:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) Die Hemmung der JAK2 /STAT3 Pathway Reduziert Magenkrebs Wachstum In-vitro-
und In Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993

Editor: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 21. Januar 2014; Akzeptiert: 1. April 2014; Veröffentlicht: May 7, 2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Dieses Projekt von wurde von Mitteln unterstützt; NHMRC Australien (www.nhmrc.gov.au) Projektförderungǽ165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) Melanom SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) Gehirn SPORE 2 P50 CA127001-06. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

konkurrierende Interessen. Waldemar Priebe halten Patente und hat ein finanzielles Interesse an der Entwicklung der Verbindung WP1066 wie folgt; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki Verbindungen zur Behandlung von proliferativen Erkrankungen Zelle. Unites States Patent WO /2005/058829 12.01.2004. Beachten Sie auch, dass die Autoren einen geänderten Erklärung der widerstreitenden Interessen zur Verfügung gestellt haben in Bezug auf ein Patent auf WP1066 von W. Priebe gehalten. Die Autoren erklären auch, dass "dies nicht die Einhaltung der fest PLoS ONE Politik auf den Austausch von Daten und Materialien nicht verändert".

Einführung

Von den sieben Signal Transducer und Aktivator der Transkription (STAT) Familienmitglieder hat STAT3 am konsequentesten in einer Reihe von gemeinsamen Krebserkrankungen beim Menschen, einschließlich in Verbindung gebracht; Lungen-, Brust-, Eierstock-, Prostata- und Dickdarm [1], [2], [3], [4]. Dies gilt auch in menschlichen Magenkrebs [5], [6], [7], in der STAT3-Aktivierung durch chronische Phosphorylierung an Tyrosin (Y) 705 befinden, hat zu einem erhöhten Wachstum, Angiogenese, Invasion und Metastasierung des Primärkrebs in Verbindung gebracht worden [ ,,,0],6], [7], [8]. Somit Hemmung der STAT3 Transkriptionsaktivität in menschlichen Magenkrebs können eine mögliche Mittel bieten die hohe Morbidität zu verringern und das Leben unter Magenkrebs-Patienten weltweit verlängern.

In der Abwesenheit funktioneller Mutationen in dem STAT3-Gen aberrant STAT3-Aktivität wird durch anhaltende Aktivität von stromaufwärts Tyrosinkinasen und /oder durch unscheduled- oder über~~POS=TRUNC stimulierenden Liganden [9], [10], [11] induziert. Dies wird deutlich in der gp130 exemplifiziert ^{757F /F-Maus-Modell von Magenkrebsentwicklung, in dem ein Phe für Tyr Substitution an der 757-Position auf dem intrazellulären Arm des IL-6-Familie Signalisierungs Rezeptor gp130 gleichzeitig SHP2 und SOCS3 verhindert Bindung in der Hemmung der ras /MAP-Kinase-Signaltransduktion, resultiert, und Hyperaktivierung von STAT3 durch konstitutive Phosphorylierung [23], [24], [26]. Vor kurzem haben wir und andere gezeigt, dass die in Magentumoren, signifikante Erhöhungen in der Transkription mit einer erhöhten Expression des gp130-Liganden IL-11 in humanen Magenkrebs und Mausmodellen der Krankheit [5], [12], [13] überein. Im letzteren IL-6 entbehrlich ist, aber IL-11 ist absolut erforderlich Tumorigenese [12], [13]. Zusätzlich IL-11 /STAT3 wurde ein wichtiger Treiber der atrophischen Gastritis gezeigt werden, die erste Präkanzerose des Magens nach einer chronischen Infektion durch das Bakterium Helicobacter pylori
[14].}

bis heute wurden zahlreiche Kinasen berichtet STAT3 Aktivität nach Ligand /Rezeptor-Bindung, jedoch nur JAK1 und JAK2-Konto für STAT3-Phosphorylierung beim Andocken mit IL-11 /gp130-Rezeptor-Komplex [15] und von dieser IL-11 /gp130 bevorzugt an induzieren bindet JAK2 [16]. Diese Beobachtungen legen nahe, dass JAK2 und STAT3 vorhanden vielversprechende Ziele für die Entwicklung therapeutischer Antagonisten IL-11 zu unterdrücken /STAT3 Signalübertragung in menschlichen Magenkrebs.

Vor kurzem hat die Kaffeesäure-Derivat WP1066, im Zusammenhang mit strukturell mit der niedrigen Potenz Tyrosinkinase-Inhibitor AG490 wurde in transformierten Gehirn Gliom [17] und Nierenkarzinom [18] Zelllinien, was zu Wachstumshemmung und Induktion der klassischen pro-apoptotische Wege ein hochwirksamer Inhibitor der JAK2 /STAT3 Weg erwiesen. Darüber hinaus ist WP1066 wirksam in vivo
gegen hoch malignen Melanomen und Leukämien, die für die JAK2-V617F-Mutation + positiv sind, die eine Aktivierung konstitutiver JAK2-Kinase fördert [19], [20], [21], [22 ]. Nicht veröffentlichte Studien zeigen, dass WP1066 kein ATP-kompetitiver Inhibitor ist, und kann die Expression von phosphoryliertem JAK2 und STAT3 blockieren; zusätzlich kann p-STAT3-Y705 unabhängig von dem JAK2-Status gesperrt werden. So präsentiert WP1066 eine einzigartige Gelegenheit, sowohl p-JAK und p-STAT3 zu hemmen, und anschließend potent blockieren JAK2 /STAT3-Signalweg und STAT3 Transkriptionsaktivität.

Um die Idee der doppelten Blockade von JAK2 testen und STAT3-Aktivierung im Magen und die anschließende Entwicklung von Magenkrebs haben wir verwendet, um sowohl in-vitro-
und in vivo
Ansätze zu beurteilen, ob WP1066 Magentumorwachstum durch die Hemmung von JAK2 /STAT3 Aktivität verlangsamen oder blockieren können, und anderen eng verwandten onkogenen Signalwege. Hier zeigen wir, dass WP1066 effektiv STAT3-Phosphorylierung hemmt, und induziert Apoptose in einer Magenkrebs-Zelllinie, und dass es Magentumorwachstum hemmen können in vivo
durch Induktion von Schlüssel STAT3-regulierte Gene zu blockieren.

Materialien und Methoden

Herstellung und Lagerung von Kinase-Inhibitoren

Inhibitor WP1066 wurde von Waldemar Priebe und seinen Mitarbeitern an der University of Texas MD Anderson Cancer Center entwickelt und synthetisiert und aktuellen Bestand wurde mit freundlicher Genehmigung geliefert von Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Stammlösungen wurden in Hybri-Max DMSO und gelagert bei -20 ° C resuspendiert. Aktien waren den einmaligen Gebrauch, und nicht wieder eingefroren beim Auftauen.

In-vitro-Kultur

AGS-Zellen (ATCC, Manassas VA, USA) Zellen in komplettem Medium gehalten wurden, enthaltend RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) Medien mit 10% fötalem Rinderserum, 50 IE Penicillin bei 37 ° C in 5% CO _{2 bis 95% Luft.}

Western Blotting

Proteinextrakte wurden hergestellt entweder mit TRIzol-Reagenz (Life Technologies, Vic, Australien) nach den Anweisungen des Herstellers und die Proteinpellets wurden in 1% Natriumdodecylsulfat resuspendiert, enthaltend 2 mmol /l Na _{3VO 4 oder RIPA Puffer. Aliquots (30 &mgr; g) wurden auf Natriumdodecylsulfat /Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. über Nacht in Magermilch-Membranen wurden mit den folgenden Antikörpern bei 4 ° C blockiert und inkubiert; STAT3, Py (705) STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Y (204), ERK1 /2, AKT, pS (473) AKT, JAK2, Py (1007), Y (1008) JAK2 (Cell Signaling,Α2,Α4S,Α1,Ύ2Ƶ7,Ο2,ƕ8,ŷ2,ŷ1,ł9,Ź1), GAPDH (Abcamδ5). Die Membranen wurden mit Peroxid-konjugierten sekundären Antikörper (Dako, polyklonalen Schweine-Anti-Kaninchen, HRP konjugiert, # P0399) und visualisiert durch verstärkte Chemilumineszenz (Amersham, Buckinghamshire, UK) inkubiert. Für die Analyse-Banden wurden unter Verwendung der Quantity One Software-System (Biorad) und phosphorylierte Proteine ​​als Anteil an GAPDH von einer doppelten Membran ausgedrückt quantifiziert. Mindestens n = 8 Proben wurden entweder durch Behandlung bewertet.}

Zellzählung von Haemocytometry

Die Zellen wurden ausgesät bei 5 × 10 ^{4 Zellen /ml in 24-Well-Format in kompletten Medien und für 24 Stunden lang ungestört wachsen. Die Zellen wurden mit der geeigneten Konzentration von WP1066 oder DMSO als Kontrolle für 0-360 min behandelt. Nach der Behandlung die Zellen durch Behandlung mit Trypsin-EDTA 0,25% (Sigma), gefärbt mit Trypan-Blau 0,4% (Sigma) in einer Verdünnung 01.01 Uhr für 5 Minuten bei 4 ° C abgelöst wurden, und auf einem Hämozytometer gezählt.}

Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) Staining

To AGS Zellen mit CFSE etikettieren, wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin-EDTA 0,25% (Sigma) resuspendiert und in vorgewärmtem PBS /0,1% BSA in einer Dichte verdrängt von 1 × 10 ^{6 Zellen /ml. 10 mM CFSE Farbstoff (Invitrogen) wurde gemäß Herstellerprotokoll hergestellt, dann wurden 5 ul /ml zugegeben und gründlich durch Umdrehen gemischt, um homogene Markierung von Zellen gewährleisten. Die Proben wurden für 10 Minuten bei 37 ° C inkubiert, durch Zugabe von 5 Volumina eiskaltem Medium abgeschreckt und für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die Proben wurden dann 5-mal in Medien gewaschen und plattiert auf 2 x 10 5 Zellen /Well (6-Well-Platten). Eine Probe der Zellen wurde nach der Plattierung und markiert mit 100 &mgr; g /ml Propidiumiodid (PI) und analysiert durch Durchflußzytometrie für Gleichmßigkeit und Intensität der Markierung gemacht. Die Zellen wurden dann für 48 Stunden in Vollmedium gezüchtet, wonach sie mit oder ohne geeignete WP1066 (5 &mgr; M) bei 37 ° C mit 5% CO behandelt wurden _{2 95% Luft für 18 Stunden. Die Zellen wurden dann wie oben pelletiert und in komplettem Medium, markiert mit 100 &mgr; g /ml PI, und analysiert mittels Durchflusszytometrie bei 488 nM trypsinisiert. Die Daten wurden unter Verwendung des BD FACS Diva (BD Biosiences) Softwarepaket und analysiert von Modfit LT-Software-Paket (VSH) aufgezeichnet.}}

Annexin V-Färbung

AGS-Zellen wurden in komplettem Medium bei 2 × gewachsen 10 ^{5 Zellen /Well in 6-Well-Platten mit DMSO (Trägerkontrolle) oder WP1066 (5 uM) oder Etoposid (200 &mgr; M; positive Kontrolle) bei 37 ° C mit 5% CO _{2 95% Luft ungestört für 24 Stunden. Die Zellen wurden dann wie folgt behandelt; in eiskaltem PBS gewaschen, wie oben, und die Zelldichte bestimmt, indem haemocytometry vor der Resuspension in Annexin-Bindungspuffer auf 1 × 10 6 Zellen /ml Trypsin behandelt. 100 ul dieser Präparation genommen wurde, und mit 5 &mgr; l der Komponente A inkubiert (Annexin Fluor 488 Annexin V-Komponente, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% Rinderserumalbumin) und 1 &mgr; g /ml der PI für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Proben wurden dann mittels Durchflußzytometrie mit 400 ul Annexin-Bindungspuffer und analysiert gemischt. Entsprechende Kontrollen +/- Reaktionskomponenten bereit waren, für Bias in Gating einzustellen. Die Daten wurden unter Verwendung des BD FACS Diva (BD Biosiences) Software-Paket aufgenommen.}}

Ethik Statement

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke durchgeführt (7 ^{th Edition) und nach Zustimmung der Murdoch Childrens Research Institute Tierethikkommission (Anwendung # A583). Alle Anstrengungen wurden unternommen, Beschwerden in dieser minimal-invasiven Verfahren zu minimieren.}

In-vivo-Experimente

gp130 ^{757F /F Mäuse zuvor beschrieben worden sind [23]. Kurz gesagt, entwickeln diskrete antral Tumoren durch Alter von 4 Wochen und schnell bis zu 12 Wochen wachsen. Sie rekapitulieren die entwicklungsbedingten Charakteristika von Darm-Typ Adenokarzinom des Magens, einschließlich submuköse Invasion aber metastasieren nicht [24]. Die Tiere wurden in einem SPF-Anlage am Murdoch Kinder Research Institute untergebracht und bestätigt frei von Helicobacter pylori
zu sein. Drei Gruppen von Mäusen wurden auf Tumorentwicklung untersucht: 1) 8 Wochen alte gp130 757F /F-Mäuse, die keine Behandlung erhielten (n = 10); 2) gp130 757F /F-Mäuse, die WP1066 von 8 auf 10 Wochen alt sind erhalten (n = 10); und 3) gp130 757F /F-Mäuse, die DMSO Fahrzeug 8 bis 10 Wochen alt erhalten (n = 8). Vor allen Tieren Experimente wurden für das Wohlbefinden zu beurteilen, gewogen und Behandlungsvolumina entsprechend berechnet. Kontrolltiere erhielten äquivalente Volumina DMSO Fahrzeug WP1066 behandelten Tieren. Die Mäuse erhielten zwei anfängliche intraperitoneale Injektionen von WP1066 bei 10 mg /kg alle 48 Stunden um sie zu den Auswirkungen der Behandlung zu akklimatisieren, dann erhielt 5 Injektionen von WP1066 bei 20 mg /kg alle 48 Stunden die 2 Wochen-Schema zu vervollständigen. Intraperitonealen Injektionsstellen wurden durch vier Quadranten des Abdomens von Mäusen abwechselten. Am Ende des Experiments wurden die Mäuse eingeschläfert und Mägen für die Fotografie und Gewebesammlung reseziert.}

Die makroskopische und histologische Bewertung

Die Mägen wurden entlang der kleinen Krümmung schnell seziert, gepinnt aus, fotografiert und in 4% gepuffertem Paraformaldehyd fixiert, bevor die Verarbeitung. Paraffinschnitte (4 &mgr; m) wurden gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Die morphometrische Analyse wurde Open-Source-Software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html) durchgeführt werden. Bei Flächenmessungen, Bilder der Magenschleimhaut wurden mit der Software Zeichenwerkzeug und die Quantifizierung Programm zur Erzeugung Messungen manuell skizzierte

In-vivo-
Immunhistochemie &. Die Quantifizierung

Die immunhistochemische Analyse wurde mit Antikörpern für Ki-67 (PharmingenȦ609) und die aktivierte Caspase 3 (Cell SignaltechnikϤ1) durchgeführt. Antigen Retrieval wurde durch Sieden Abschnitte für 30 Minuten in 10 mM Citronensäure (pH 6,0) durchgeführt. Die Färbung wurde mit entsprechenden artspezifischen biotinylierten sekundären Antikörper (DAKO, Dänemark), Avidin und biotinylierter Meerrettich-Peroxidase-Komplex hochmolekularen (Vector Laboratories, Burlingame, CA) abgeschlossen, 3,3'-Diaminobenzidin (Sigma, St. Louis, MI) und counterstained mit Hämatoxylin. Für Ki-67 Quantifizierung einer verblindeten Beobachter gezählte Anzahl von gefärbten Zellen pro Drüse in mehrere Abschnitte pro Tier mit ImageJ wie zuvor. Die Daten wurden als die Zahl Ki-67-positiven Zellen pro Drüse ausgedrückt. Für aktivierte Caspase-3-Quantifizierung, zählte ein Blindbeobachter die Anzahl der gefärbten Zellen pro Fläche der Schleimhaut in 4 zufälligen Bereichen gut orientiert Antrum pro Tier wie vor mit ImageJ. Die Daten wurden als die Zahl aktivierte Caspase-3-positive Zellen pro Bereich der Schleimhaut ausgedrückt

Semi-quantitative morphometrische Analyse der Entzündung

Entzündung beurteilt wurde mit Mikroskopie in verblindet auf H &. E-gefärbten Abschnitte. Antral Tumorgewebe wurden analysiert und ein Minimum von 3 Streifen pro Tier (n = 7) aus einer semi-quantitative Punktzahl nach dem Grad der Entzündungszellen Minimum = 0 bis maximal = 3. Lymphoplasmocytic und polymorphkernigen Infiltrat wurden bewertet unabhängig gegeben wurden. Die Mittelwerte wurden dann für die statistische Analyse verglichen.

Real-Time (Q) -PCR-Analyse

RNA mit Trizolreagenz (Life Technologies, Vic, Australien) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Gesamt-RNA (3 ug) wurde revers in cDNA transkribiert unter Verwendung von Moloney Murine Leukemia Virus reverser Transkriptase (Promega, Madison, WI) grundiert mit 0,3 ug Oligo (dT). Q-PCR-Primer wurden unter Verwendung entworfen PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems) (Tabelle 1). SYBR Green Chemistry (Applied Biosystems) wurde mit L32 als normalizer verwendet. Die PCR-Bedingungen waren 95 ° C für 10 min, dann 40 Zyklen von 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 15 sec; die Reaktionen wurden auf einem Applied Biosystems AB7500 RT-PCR-Maschine. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von Sequenzdetektor-Software analysiert, und die relativen fache Unterschiede wurden unter Verwendung des ΔΔCt Methode bestimmt, wie vom Hersteller beschrieben.

Statistical Analysis

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt wurde . Werte von quantitative Analyse der Genexpression oder der Anzahl der gefärbten Zellen wurde zwischen den Proben durch ANOVA und wobei ein statistisch signifikanter Unterschied gefunden einzelnen Gruppen wurden weiter mit der entsprechenden parametrischer oder nicht-parametrischer-Statistik unter Verwendung des Sigmastat Statistikpaket analysiert verglichen. Die statistische Signifikanz wurde als p ≤ 0,05 definiert.

Ergebnisse

• PLoS ONE: CD147-Expression in menschlichen Magenkrebs ist im Zusammenhang mit Tumorrezidiven und Prognosis
• PLoS ONE: Ein MAP3K1 SNP Predicts Überleben von Magenkrebs in einem chinesischen Population