PLoS ONE: praradimas promielocitine leukoze Baltymai skrandžio vėžiu: Pasekmės IP 10 išraiška ir naviko infiltruojanti limfocitų

Anotacija

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių priežasčių vėžio susijusio mirtingumo visame pasaulyje. Išraiška navikas slopintuvas, promielocitinės leukemija (PDL) baltymas, yra sumažinamas arba panaikinamas skrandžio karcinoma, kartu su padidėjusia lygio limfinės invazijos, plėtros aukštojo pTNM sustojimo ir nepalankiai prognozei. Čia, mes ištirti ryšį tarp naviko infiltruojanti limfocitų mastą ir PDL baltymų raiškos statusą išplitusiu skrandžio karcinoma santykius. Mes pastebėta didesnių skaičių infiltrating T-ląstelių skrandžio karcinoma audinių, kurioje PDL išraiška buvo sumažinamas arba panaikinamas, palyginti su audinių teigiamas PDL. Ir T-ląstelių migracija link kultūros supernatanto, gautų iš interferono-gama (IFN-γ-stimuliuotą skrandžio karcinoma ląstelių linijų mastu papildomai buvo paveikta išraiška PDL in vitro
. Interferonas-gama-indukuojamas baltymų 10 (IP -10 /CXCL10) išraiška buvo padidintas skrandžio karcinoma audinių rodyti mažesnius PDL lygį. Be to, ir PDL
nokautas ir Klojinius išardomi ląstelės, rodomą sustiprintas IP 10 iRNR ir baltymų ekspresija iš IFN-gama buvimą. PDL nokdaunas padidėjo IFN-γ-tarpininkaujant signalo keitiklio ir Aktyvatorius transkripcijos-1 (STAT-1) privalomo TL-10 promotoriaus, todėl padidėjusi transkripcijos IP-10 geno. Priešingai, PDL IV baltymo ekspresija slopino IP-10 promotoriaus aktyvavimo . remiantis šiais rezultatais, mes siūlome, kad nuostolis PDL baltymų raiškos skrandžio vėžio ląstelių prisideda prie didesnio IP 10 transkripcijos , per pervežimas iš STAT-1 aktyvumui, tobulinimu, kuris, savo ruožtu, skatina prekybą limfocitų naviko regionuose per .

nurodomoji dalis: Kim HJ, Lyrinės DE, Lim SY Lee SH, Kanas JL Lee SJ ir kt. (2011) praradimas promielocitine leukoze Baltymai skrandžio vėžiu: Pasekmės IP 10 išraiška ir naviko infiltruojanti limfocitams. PLoS ONE 6 (10): e26264. Doi: 10,1371 /journal.pone.0026264

redaktorius: Yoshio Yamaoka, Veteranų reikalų medicinos centras (111D), Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Balandžio 21, 2011 m Priimta rugsėjo 23, 2011 m Paskelbta: Vasaris 12, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 Kim et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė pagrindinių mokslo tyrimų programa pagal nacionalinės mokslinių tyrimų fondo Korėjos (NRF), finansuojamą švietimo, mokslo ir technologijos (2010-0015506) Y-HC ministerijos, nacionalinio mokslinių tyrimų fondo Korėjos (NRP) finansuojama iki Korėjos vyriausybės (mest) (2.010-0.029.353) į JLK, ir Ro1 NS50665 į ENB. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš dažniausių priežasčių vėžio mirčių visame pasaulyje. Naujausi pasiekimai genetikos palengvino įvykių metu skrandžio kancerogenezėje, įskaitant aktyvavimo onkogenų žinoma aptikimo, triukšmo slopinimo auglio slopintuvas genų ir mutacijos genuose dalyvaujančių DNR taisymo [1]. Tarp šių genetinių įvykių, yra žinoma, kad navikas slopintuvas promielocitine leukoze (PDL) baltymų ekspresija yra sumažinamas arba panaikinamas skrandžio vėžio, ir tai siejama su plačiau limfinės invazijos, aukštojo pTNM sustojimo ir nepalankiai prognozei, ir tai reiškia, kad PDL praradimas yra susijęs su karcinogeneze ir skrandžio karcinoma progresavimo [2]. Ankstesni tyrimai susijęs PDL
disfunkcija progresuoja vėžio įvairovė ir sumažinamas arba panaikinamas išraiškos PDL buvo pranešta prostatos, krūties, CNS, storosios žarnos, plaučių ir skrandžio vėžio [2], [3] .

PDL
genas iš pradžių buvo identifikuojama sintezės su retino rūgšties receptorių dalyvauja t (15; 17) TRANSLOKACIJA susijęs su ūmine promielocitine leukoze (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PDL yra naviko slopintuvas baltymas, kuris reguliuoja ląstelės ciklą, genų transkripciją, transformacija slopinimo ir apoptozės. PDL
nokautas pelės yra žymiai jautresni navikų susidarymo po kancerogenų poveikiu nei yra laukinio tipo valdiklius, ir PDL
-deficient ląstelės yra mažiau tikėtina, pritaikius tam tikrų tipų atlikti apoptozę korinio stresas [9]. Be ataskaitų, daugiausia dėmesio skiriant naviko slopinamojo vaidmens PDL, keli tyrimai patvirtino, kad baltymai veikia kaip transkripcijos reguliatorių, per pervežimas kartu su bendro aktyvatorius CREB surišančio baltymo; bendradarbiai repressors įskaitant HDAC, N-RK ir mSin3A; ir transkripcijos veiksniai Nur77, ap-1 Myc, p53 ir STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progresyvus mutacija ir genetiniai pakitimai keliose auglio slopintuvas genų skatinti navikų vystymąsi ir progresavimą [18]. Be to, genetinių pakitimų per vėžinių ląstelių, abi uždegiminių ląstelių ir tarpininkai prisidėti prie formavimo ypač naviko mikroaplinkos [19], [20]. Naviku susijęs fibroblastai (TAFs) ir makrofagai (TAM) taip pat dalyvauja moduliavimo naviko mikroaplinkos per pervežimas citokinų chemokinus, interferonų ir kitų biologiškai aktyvių faktorių [21] gamybos [22]. Kryžminis aptarimas tarp vėžinių ląstelių, TAFs, TAM, ir limfocitai, yra reikšmingas auglių vystymuisi ir progresavimui, ir prisideda prie nustatymo naviko mikroaplinkos praturtintas į išraiškos biologiškai aktyvių įvairių veiksnių [23], [24], [25] [26], [27].

TAM randama koreliuoja su angiogenezę ir nepalankiai prognozei kelių tipų vėžio, įskaitant skrandžio vėžio [22], [28]. Putliųjų ląstelių gamina daug angiogeninių faktorių ir citokinų įvairovė, o jos tankis buvo pranešta, kad labai koreliuoja su naviko neoangiogenesis ir blogos prognozės [29] mastu [30]. CD4 ^{+ ir CD8 + limfocitai taip pat yra kietų vėžio audiniuose įvairovė. Iki šiol tiksliai molekulinius mechanizmus, pagal kurį tipo ir naviko infiltrating ląstelių skaičius yra reguliuojamos, yra plačiai žinomas. Yra keletas prieštaringų ataskaitos, atsižvelgiant į skaičius ir funkcijos naviko infiltruojanti limfocitų. Ypač, CD8 + T limfocitai, o jų funkcija yra žinoma, kad pašalinti kylančią transformuotų ląstelių ir prisidėti prie imuninės [31], ji pranešė, kad CD8 + naviko infiltruojanti T ląstelės yra defektu efektorinių fazės funkcija susilietę su vėžinių ląstelių [32], o jų infiltracija yra susijęs su nepalankia prognoze tam tikrų vėžio rūšių, pavyzdžiui, nemaža plaučių vėžio ir nosiaryklės karcinomą [33], [34].}

chemokinus išskiriami stromos ląstelių arba naviko ląstelės įtakos naviko ląstelių migraciją, invazija, platinimu, angiogenezę ir imuninių ląstelių infiltraciją į naviko masės [35]. IFN-γ-indukuojamas baltymų-10 (IP-10, CXCL10) yra vienas iš CXC chemokinų, kuri atlieka daug funkcijų uždegiminių ligų ir vėžio [36], [37]. Nuo TL-10 pirmenybė skatina Th1 imuninį atsaką sparčiai pritraukti NK ir T ląsteles, siūloma kaip vieną iš galimų mechanizmų T ląstelių infiltracija į navikų.

Ar nuostolis navikas slopintuvas genų vėžinių ląstelių skatina įdarbinti limfocitų ir moduliavimas tokių ląstelių funkcijas per naviko mikroaplinkos šiuo metu neaišku. Šiame tyrime mes išnagrinėjo PDL funkciją susijusių su įdarbinimo limfocitų ir moduliavimo auglio kilmės veiksnių išraiškos. Išraiška PDL buvo atvirkščiai koreliuoja su infiltracija CD8 ^{+ T-ląstelių, kiek į skrandžio karcinoma. PML nuostoliai buvo toliau susijęs su padidintu išraiškos IP-10, vienas iš limfocitų-pritraukti CXC chemokinų, skrandžio karcinoma ląstelių ir audinių. PDL nokdaunas skatinamas IFN-γ-tarpininkaujant STAT-1 privalomi IP-10 promotoriaus, todėl padidėja transkripcijos IP-10 geno. Mūsų duomenys patvirtina mintį, kad PDL samdymo limfocitų į navikų, per pervežimas ekspresijos lygio naviko kilmės veiksnių, įskaitant TL-10 moduliavimo, teikti papildomų įrodymų, kad auglių slopintuvas genų naviko praradimas ląstelės aktyviai dalyvauja naviko mikroaplinkos įsteigimo.}

rezultatai

praradimas PDL baltymų yra susijęs su padidėjusia infiltracija CD8 ^{+ T-ląstelių į išplitusiu skrandžio vėžiu audinio}

imunohistocheminis dažymas PDL ir CD8 buvo atliktas siekiant ištirti, ar limfocitų infiltracija, kiek buvo susijęs su PDL išraiška statusą išplitusiu skrandžio vėžiu. CD8-imunoteigiamų ląstelės buvo išvardytos, kaip nurodyta Medžiagos ir metodai. Iš viso 35 mėginių (71,4%) parodė, dalinė iki visiško praradimo PDL į naviko ląstelių branduolius IV etapas išplitusiu skrandžio karcinoma. Mėginiai iš 14 pažangiausių skrandžio karcinoma sergantiems pacientams buvo išplitęs teigiamas PDL, ir jame yra apie 32,7 CD8 ^{+ T-ląstelių viename lauke (1a pav) vidurkį. Rasta 19 atvejų išplitusiu skrandžio karcinoma matomos židinio pozityvumo už PDL, su iš 47,2 CD8 + T-ląstelių viename srityje vidurkį. Be to, visiškas apakimas PDL buvo stebimas 16 išplitusiu skrandžio karcinoma sergantiems pacientams; mėginiai esančius vidutinį skaičių 52,8 CD8 + T-ląstelių viename lauke. Mėginiai rodantys židinio pozityvumo ar visiško praradimo dėl PDL parodė daugiau padidėjimą CD8 + T-ląstelių skaičius, nei padarė pavyzdžiai eksponuoti Difuzinis pozityvumo už PDL. Tipinių vaizdai yra parodyta 1B pav. Nors PDL baltymo ekspresija buvo sumažinta arba panaikinta vėžinių ląstelių, visi normalios skrandžio gleivinės liaukų, stromos audinių ir limfinių ląstelių, eksponuojami Difuzinis vidutinio sunkumo ir stiprus branduolinių immunopositivity už PDL.}

PDL įtakoja T-ląstelių infiltracija /migracija in vitro

atsižvelgiant į PDL baltymų raiškos nuostoliai ir infiltracija CD8 padidėjimas ^{+ T-limfocitai į pažangias skrandžio karcinoma audinių, mes iškėlė hipotezę, kad PDL prisidėjo T-ląstelių infiltracija /migracija skrandžio vėžio. Ištirti, ar PDL lygis skrandžio vėžio ląstelių įtakos T-ląstelių migracija, kondicionieriai laikmenas iš SNU-638 ląstelių laikinai perkeltų su arba PDL
siRNA ar PDL IV ekspresijos vektorių, tada gydomi IFN-γ buvo panaudotas transwell migracijos tyrimų. SNU-638 skrandžio vėžio ląstelės išreikšti aukšto lygio PDL baltymų, suderinamas su ankstesnėmis išvadomis [2], kadangi SNU-638 ląstelių perkeltų su PDL
siRNR nuotraukos rodomos sumažintas lygius endogeninio PDL išraiškos (~46-56%) , kaip patvirtinta munoblotingu (2a pav.) IFN-γ sukėlė nedidelį padidėjimą PDL baltymų raiškos, susitarusi su ankstesniais rezultatais [38]. Migracija Jurkat T-ląstelių link sąlygoja laikmenoje PDL
siRNA-perkeltų SNU-638 ląstelės buvo daug didesnis, palyginti su kontrolės siRNA-perkeltų ląstelių, po gydymo IFN-gama (2b pav.) Po transfekciją SNU-638 su PDL IV ekspresijos vektorių, migracijos Jurkat T-ląstelių link sąlygoja laikmenoje PDL IV ekspresija ląstelių buvo sumažintas, palyginti su tuščiu vektoriaus (2C pav.) Šie rezultatai rodo, kad PDL reguliuoja sekrecijos molekules ir grįžusių iš lygius IFN-gama skatino skrandžio vėžio ląsteles, taip pat įtakoja T- limfocitų migracija.}

praradimas PDL pagerina IFN-gama sukeltas IP 10 išraiška

chemokinai, iš chemotaksinio citokinų šeima, skatinti migracijos cirkuliuojančių leukocitų /limfocitus į svetaines uždegimo ir traumos. Ištirti, ar chemokino lygiai buvo paveikti PDL
genetinė būklė, chemokino genų ekspresijos buvo tiriama naudojant ribonukleazė apsaugos tyrimą (RPA). PDL
<sup>+ /+ ir PDL
- /- pelės embriono fibroblastų (MEF) ląstelės buvo inkubuojami nesant ar esant IFN-gama už 0-24 h bendras iRNR buvo surinkta įvairių laiko momentų ir taikomos RPA. Be PDL
- /- MEF, IP 10 iRNR kiekis padidėjo 1,5 karto už 2 val, ir tapo žymiai padidėjusi (8 kartų) iki 4 h (3a pav.) RANTES iRNR kiekis buvo padidėjęs 3,2 karto per 0,5 h, ir liko padidėjusi, bet mažesne apimtimi (1,3 karto), 8 h po IFN-gama gydymo PDL
- /- MEF , Kitos chemokino genai, įskaitant MIP-1, MIP-2 ir MCP-1, buvo nenustatyta, išreikštas PDL
+ /+ arba PDL
- /- MEF (duomenys neparodyti). STAT-1 išraiška buvo padidinta po sąlyčio su IFN-gama tiek ląstelių tipų, tačiau ne skirtumas buvo akivaizdus, ​​kai IFN-gama lygiai buvo palyginti tarp PDL
+ /+ ir PDL
- /- ląstelės. Kaip transkripcija IP-10 geno buvo gerokai padidėjusi IFN-gama-skatino, PDL
- /- MEF, mes matuojamas atitinkamas baltymų kiekį kultūros nuopile yra PDL
+ /+ ir PDL
- /- MEF, naudojant imunofermentinės analizės (IFA). Suderinamas su RPA rezultatus, aukštesnio lygio IP 10 baltymų buvo akivaizdus apdorotas terpę iš IFN-γ-elgiamasi, PDL
- /- MEF (3B pav.) Be to, TL-10 iRNR raiška PDL
siRNA-perkeltų NIH3T3 ląstelės buvo sustiprintas, palyginti su kontrolės siRNA-perkeltų ląstelių, po IFN-gama gydymo (3C pav.) Į išraiška PDL baltymų PDL
siRNA-perkeltų NIH3T3 ląstelių sumažėjimas buvo patvirtinta munoblotingu.</sup>

Sumažintas PDL išraiška yra atvirkščiai koreliuoja su IP 10 baltymų lygių skrandžio vėžio audinio ir SNU- 638 ląstelių

Be to, mes išnagrinėjo tarp TL-10 ir PDL baltymų raiškos santykį išplitusiu skrandžio vėžiu audinio. Vėžio audiniai buvo immunohistochemically tamsintas už PDL ir TL-10, o IP-10 immunopositivity intensyvumas buvo matuojamas kaip aprašyta Medžiagos ir metodai. Vidutinis intensyvumas IP-10 buvo 1.2 14 mėginiai, rodantys Difuzinis pozityvumo (DP) ir PDL, 2.2 19 atvejų židinio pozityvumo (FP), ir 2.0 16 mėginių, kurioje buvo baigtas nuostolių (Cl) PDL išraiškos ( 4A pav paliko panelė). Žymus IP 10 išraiška buvo pastebėtas mėginiuose rodo židinio pozityvumo PDL ( P
= 0,034), palyginti su tais, rodo Difuzinis teigiamą PDL išraiška. In IP-10 raiškos padidėjimas buvo pastebėtas, kai visiškas apakimas PDL buvo akivaizdu, palyginti su tuo, kas buvo pažymėta, kada PDL buvo išplitęs išreiškė; Tačiau, šis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmę. Reprezentacinės pavyzdžiai svyravimų PDL baltymų statusą, susijęs su skirtingų IP 10 ekspresijos lygį vėžinių ląstelių iš pažangių skrandžio karcinoma yra parodyta (4A pav, dešinėje). Toliau nagrinėti tarp IP-10 ir PDL baltymų raiškos santykį skrandžio karcinoma ląstelių linijų, IP-10 baltymo koncentracija buvo matuojama kultūros nuopile iš SNU-638 ląstelių laikinai perkeltų su arba PDL pervežimas siRNR ar PDL IV exression vektorius. Ląstelės buvo auginamos nedalyvaujant arba dalyvaujant IFN-gama 8 h, surinkti supernatantų, ir jame kiekybiškai (ELISA) IP-10 lygių. IFN-γ sukeltos IP 10 sekrecija buvo gerokai sustiprintas SNU-638- PDL
siRNA-perkeltų ląstelių, palyginti su SNU-638 ląstelių transfektuotose valdymo siRNA (4b pav.) Transfekciją SNU-638 su PDL IV ekspresijos vektorių slopino IFN-γ-sukeltas IP 10 sekreciją (pav 4c). Rezultatai aiškiai rodo, kad sekrecijos TL-10 nuo skrandžio vėžio ląstelių padidėja, kai PDL išraiška yra sumažintas.

IP 10 neutralizavimo mažėja migracijos T-ląstelių

Kaip SNU-638- PDL
siRNA turinčių ląstelių išreiškiantys mažesnio PDL baltymų parodė stiprinimą T-ląstelių įdarbinimo ir IP 10 sekrecijos reaguojant į IFN-gama (2 ir 4 pav), kitą kartą ištyrė, ar į IP-padidėjimas 10 lygių palengvino, T-ląstelių migraciją į sąlygoja laikmenoje SNU-638 skrandžio vėžio ląstelių stimuliuojamais IFN-gama. SNU-638- PDL
siRNA ląstelės buvo auginamos nesant ar esant IFN-gama už 8 val, o surinkti supernatantai buvo išvalytos su anti-IP-10 neutralizuojančių antikūnų arba kontroliuoti nespecifinis lgG 1H, prieš pradedant vykdyti transwell tyrimu. Neutralizuojančių antikūnų arba IgG, kuriuose supernatantai buvo sudėti į mažesnes kameras ir buvo analizuojami migracijos Jurkat ląstelių iš viršutinės mažesnių kamerų nagrinėjant ląsteles paruoštos iš apatinių rūmams. Įtraukimas IP-10-neutralizuojančių antikūnų slopinamas Jurkat T-ląstelių migracija link sąlygoja laikmenoje SNU-638- PDL
siRNA ląstelių (5a pav.) Šie duomenys sutampa su duomenimis, gautais iš NIH3T3 ląstelių; IP-10-neutralizuojančių antikūnų slopinamas EL-4 T-ląstelių migraciją į sąlygoja laikmenoje NIH3T3- PDL
siRNA ląstelės (5b pav.)

PDL nokdaunas pagerina IP 10 promotoriaus aktyvacijos

", IP-10 išraiška buvo padidintas PDL triuškinantis ląsteles, mes toliau nagrinėti, ar PDL baltymo ekspresija įtakos IP 10 promotoriaus aktyvumą. Pelių IP 10 rengėjas yra spėjamą dujų kaip elementas, esantys tarp NTS -246 ir -238 (TTN _{5AA) (6a pav.) Mes anksčiau pranešė, kad PDL neigiamai reguliuoja transkripcijos veiklą STAT-1 [17]. Siekiant įsitikinti, ar PDL įtakos IFN-γ-sukeltas IP 10 genų ekspresiją per
mechanizmą įtraukiant STAT-1, mes izoliuotas ir generuoja reporteris konstruktą, prasidedantį ne -330 padėties pelių IP 10 promotoriaus, kurioje yra spėjamas DUJŲ kaip elementas, kaip aprašyta medžiagos ir metodai. IP-10- , Luc
žurnalistė, turinti dujų kaip elementas buvo laikinai perkeltų į NIH3T3 ląstelių inkubuojamų su arba be IFN-gama 24 h, o vėliau tiriami dėl liuciferazės veikla. IFN-γ sukeltos IP 10 rengėjas veikla buvo gerokai sustiprintas NIH3T3 ląstelių transfektuotose PDL
siRNA, palyginti su ląstelėmis, gaunančių kontrolės siRNA (6b pav.) Po transfekciją NIH3T3 ląstelių su PDL IV ekspresijos vektorių, IFN-γ sukeltos IP 10 rengėjas aktyvacija žymiai represuoti. Downregulation PDL išraiškos naudojant PDL
siRNR ir raiška PDL iki PDL IV ekspresijos vektorius buvo patikrinti munoblotingu. Norint nustatyti, ar slopinantis poveikis PDL IFN-γ-sukeltas IP 10 promotoriaus veiklos pasitaikė skrandžio vėžio ląstelių linijas, mes atlikti panašius eksperimentus su SNU-638 skrandžio vėžio ląsteles. Padidėjimo ir sumažėjimo liuciferazės veiklos SNU-638 modeliai buvo panašus į NIH3T3 ląstelių (6c pav). PDL baltymų ekspresijos lygis SNU-638 ląstelių perkeltų su arba PDL
siRNR ar PDL IV ekspresijos vektorius buvo patikrinta munoblotingu (duomenys neparodyti).}

PDL triuškinantis padidėja IFN-γ- buvo toliau nagrinėjama sukeltas STAT-1 DNR jungiasi prie IP-10 rengėjo

PDL poveikio IFN-gama sukeltos STAT-1 DNR jungimosi prie IP-10 steigėjas. PDL baltymų ekspresija NIH3T3 ląstelių, po trumpalaikis transfekciją su PDL IV ekspresijos vektorių, dalinai blokavo IFN-γ sukeltos STAT-1 DNR privalomą TL-10 promotoriaus, įskaitant bent -246 seka -238 (7a pav, palyginkite ir 5 juostos 3). Konkurencijos naudojant 100-molinis perteklių etikete nepažymėtą oligonukleotidą koduojanti IP 10 rengėjas panaikinta sudėtingą formavimas (juostų 6). PDL ir STAT-1 baltymo ekspresijos lygis sveikų ląstelių fragmentai (PDK) ir STAT-1 tirozino fosforilinimo branduolinėmis ekstraktų (ne) mastą buvo patikrinti munoblotingu. Naudojant NE iš NIH3T3- PDL
gauti siRNA ląstelės po 0,5 h IFN-gama gydymo, stiprią privalomą į pelių IP 10 rengėjas buvo pastebėta (7b pav viršutiniame tinklinio audeklo gabale, Lane 5), palyginti su privaloma vertinti į NIH3T3-kontrolės siRNR ląstelių (takelis 3). Tie patys NE buvo veikiami STAT-1 sutarimo oligonukleotido ir STAT-1 DNR privalomas buvo sustiprintas NE iš NIH3T3- PDL
siRNA ląstelės (7B pav, viduryje skydelio, palyginti juostas 3 ir 5). Naudojant SNU-638 skrandžio vėžio ląsteles, taip pat nustatė, kad STAT-1 DNR jungiasi PDL
siRNA-perkeltų SNU-638 ląstelės buvo sustiprintas, palyginti su kontrolės siRNA-perkeltų ląstelių, po gydymo IFN-gama (pav 7C, palyginkite ir 5 juostų 3). Šie duomenys rodo, kad PDL iš dalies slopina STAT-1 privalomi IP-10 promotoriaus ir kad šis poveikis yra susijęs su padidinta IFN-γ-sukeltas IP 10 transkripcijos į PDL nėra.

Diskusijos

histopatologinis tyrimai parodė, kad uždegiminis mikroaplinka navikų yra būdinga tai, kad limfocitų infiltratų buvimas, tiek patvirtinamųjų stromos ir vėžinių regionuose. Tačiau tikslių mechanizmų, kuriuos vieno branduolio ląstelių įsiskverbti į ir ilgalaikės per vėžinių audinių šiuo metu nėra iki galo suprastas. Šioje studijoje, siūlome įrodymų, kad nuostolis išraiška auglio slopinamojo baltymų, PDL, prisideda prie stiprinimo limfocitų infiltracija į skrandžio vėžio audinyje, per pervežimas IP-10 raiškos reguliavimas.

Mes išnagrinėjo PDL funkciją atžvilgiu limfocitų įdarbinimo naudojant žmogaus skrandžio vėžio audinių mėginius PDL
<sup>+ /+ ir PDL
- /- MEF ir PDL triuškinantis tiek NIH3T3 ir SNU-638 ląstelių. gauti iš abiejų žmogaus audinių testų ir transwell migracijos tyrimų duomenys parodė, kad nuostoliai PDL skatina prekyba limfocitų; Taigi, mes siekėme mechanizmus, kurie galbūt paaiškinti šias pastabas. Mes parodome, kad IP-10 lygių padidėjimas vėžinių ląstelių išreikšti žemą PML prisideda prie limfocitų įdarbinimo. Be to, TL-10 neutralizuojančių antikūnų slopinamas, T-ląstelių migraciją į sąlygoja laikmenoje NIH3T3 fibroblastų ir SNU-638 skrandžio vėžio ląstelių in vitro
, suderinamas su keliais ankstesniais vivo
tyrimų rezultatais , kuris parodė, kad neutralizacijos IP-10 slopina T limfocitų įdarbinimo [39], [40]. Kiek mums žinoma, tai pirmasis tyrimas rodo, kad navikas slopintuvas, PDL, reguliuoja IP 10 chemokino transkripcija ir prekyba limfocitų skrandžio vėžio, moduliuoja IFN-γ /STAT-1 signalinio kelio aktyvumą.</sup>

"IP 10, limfocitų nukreipimą CXC chemokino sukelia I tipo ir II IFNs, vaidina svarbų vaidmenį limfocitų įdarbinimo pagal kelis uždegiminių sąlygomis [41]. IP-10 yra išskiriami į navikines infiltruojanti imuninių ląstelių, ir taip pat pagal Auglio ir parenchimos ląstelių į interferonas-ir citokinų-praturtintas mikroaplinka. TAFs iš plaučių vėžiu sergantiems pacientams constitutively gaminti ir išskirti IP 10 [27]. infekuoti hepatito C viruso hepatocitų gaminti IP-10, ir sukelti migraciją aktyvuotų T-ląstelių į kepenų parenchima, nurodant, kad IP-10 lygių yra susiję su histologinio sunkumo ir uždegimas [42]. Mūsų sistema IP-10 sekrecija buvo pastebėtas skrandžio vėžio SNU-638 ląstelių, fibroblastų NIH3T3 ir MEF, reaguojant į IFN-gama, ir sekrecija buvo sustiprintas PDL baltymų požymiams. Kadangi mes nustatėme, kad nebuvo jokių pastebimų skirtumų STAT-1 saviraiškos ir fosforilinimo lygis nesant ar esant PDL ant IFN-gama (3 ir 7 paveikslai), padidėjęs IFN-γ sukeltos IP 10 rašybą nesant PDL sukėlė daugiausia glaudesnio STAT-1 DNR jungiasi su IP 10 rengėjas. Mes rekomenduojame, kad PDL slopinamos STAT-1 DNR privalomu veda slopinimo STAT-1-priklauso IP 10 išraiška, sutinkamai su mūsų ankstesnių tyrimų išvadas [17]. Šiame tyrime, mes atpažinti potencialų reguliavimo regioną PML į IP-10 promotoriaus, kuris yra tariamas STAT-1-rišančią vietą. Be to, mes parodome, kad PDL Klojinius išardomi padidėja IFN-γ sukeltos STAT-1 DNR jungiasi prie IP-10 promotoriaus ir pagerina IP-10 lygių į PDL nėra.

limfocitų, neutrofilų, makrofagų ir putliųjų ląstelių yra pagrindiniai komponentai dauguma vėžinių infiltratų. Naviko infiltruojanti limfocitai buvo nustatyta kietų vėžio audinių įvairovė. Tačiau konkrečios funkcijos tokių ląstelių per navikų, ir tikslius molekulinius mechanizmus limfocitų šaukimą į navikų, lieka prieštaringas. Statusas ir funkcinis tinkamumas CD8 ^{+ T-ląstelių infiltraciją į navikų, ir tokių ląstelių turinčių pacientų prognozei asociacija, taip pat neaišku. Inkstų ląstelių karcinoma, infiltracija CD8 + T-ląstelių yra susijęs su palanki prognozė [43]. Priešingai, tokia infiltracija yra susijęs su nepalankia prognoze nemaža ląstelių plaučių vėžiu sergančių pacientų [33]. Mes čia rodo, kad PDL baltymų ekspresija vėžinių ląstelių yra atvirkščiai koreliuoja su infiltracija CD8 + T-ląstelių, kiek į naviko audiniuose. Kai PDL funkcija limfinės invazijos yra laikomas kartu su tarp PML išraiškos ir nepalankiai prognozei [2] asociacijos, akivaizdu, kad bet santykiai tarp klinikiniais požymiais ir CD8 + T-ląstelių infiltracijos mastu skrandžio vėžiu sergantiems pacientams reikia toliau eta.}

branduoliai normaliomis skrandžio gleivinės liaukų, stromos audinių ir limfinių ląstelių buvo išplitęs imunoteigiamų (vidutinio sunkumo ir stiprus) PDL baltymų ekspresijos, o PDL koncentracija buvo sumažinamas arba panaikinamas naviko ląstelėse (paveikslas 1). Šie duomenys paremti idėją, kad vėžio ląstelės turi specifinių degradacijos mechanizmus PDL. Norime pasiūlyti potransliacinis proteosomos priklauso nuo degradacijos paaiškina PDL baltymų praradimą. Kitaip tariant, degradacija tuo transkripcijos lygio yra ne operacinis [2], [44]. PML baltymo ekspresija yra sumažinamas arba panaikinamas įvairiais vėžio, įskaitant prostatos, krūties, centrinės nervų sistemos, gaubtinės žarnos, plaučių, ir skrandžio vėžys [2], [3]. Suderinamas su šiais rezultatais, mes nustatėme, sumažinta arba veikia nereikšmingai išraišką PDL pažangių skrandžio vėžio audiniuose. Be to, mūsų rezultatai rodo, kad vėžinės ląstelės išreiškiantys skirtingų lygių PDL baltymų skiriasi jų gebėjimą pritraukti ir išlaikyti limfocitų naviko sričių, taip suteikiant papildomų įrodymų, kad tokios ląstelės aktyviai dalyvauti uždegiminių naviko mikroaplinkos įkūrimo, per
PDL tarpininkaujant mechanizmus.

NF-κB ir STAT-3 signalizacijos siūloma tapti didelių reguliavimo sistemas susiejimas uždegimą vėžį [45]. IL-6, NF-κB priklauso nuo uždegimo augimo faktoriaus, yra labai svarbus plėtojant uždegimas susijęs kancerogenezėje [46]. Naujausi netiesioginių įrodymų dar labiau sustiprino mintį, kad IL-6 /gp 130 /STAT-3 signalizacijos ašis tarnauja kaip tiek autokrining ir paracrine amplifikacijos kilpa plaučių adenokarcinoma, daugine mieloma, RAS-transformuotos vėžinės ląstelės, ir kolitas susijęs vėžys modelis [47], [48], [49], [50]. PDL buvo įrodyta, kad slopinti IL-6-sukeltas STAT-3 veikla [51], skatinti apoptozę per
TNF-tarpininkaujant procesą ir supažindinti ląsteles apoptozės slopina NF-κB-tarpininkaujant išlikimą kelias [52]. Tačiau ji dar turi būti nustatyta, ar nuostolis auglio slopinamojo PDL prisideda prie pokyčių priimančiosios imuninis atsakas ar naviko mikroaplinka, galbūt todėl abiejų imunologinės ar imuninės pabėgti, moduliavimu, transkripcijos veiksnių. Taigi, būtų įdomu palyginti praradimo PDL baltymų raiškos NF-κB /STAT-3 ir STAT-1 signalizacijos poveikį, ir nustatyti, ar tai transkripcijos veiksniai funkcija koordinuotai reguliuoti poaibis išraiška chemokinus prisidedantys prie uždegiminių naviko mikroaplinkos įsteigimo.

medžiagos ir metodai

Ląstelės

Pirminė ir įamžino PDL
<sup>+ /+ ir PDL
- /- MEF buvo kuriamos ir išlaikomos kaip aprašyta anksčiau [53]. SNU-638 žmogaus skrandžio carconoma ląstelių linija, Jurkat žmogaus T-ląstelių limfoblasto tipo ląstelių linija, ir El-4 Pelės, T-limfomos ląstelių linijos išliko kaip buvo aprašyta anksčiau [2], [54].</sup>

skrandžio vėžys audiniai

49 skrandžio karcinoma parafino blokus iš viso buvo gauti iš 49 pacientų (29 vyrai; 20 moterims; amžiaus mediana 64 metai; diapazonas 35-84) iškentęs visišką ar tarpinės sumos pašalintas skrandis IV etape pažangios skrandžio karcinoma Mokdong ligoninė, Ewha Moterys universiteto medicinos mokyklos, Seulas, Pietų Korėja nuo 2001 iki 2007 m

Reagentai ir antikūnai

rekombinantinis pelių ir žmogaus IFN-γ (mIFN-γ ir hIFN- γ) ir MIP-10 ir Hip-10 buvo įsigytas iš ProSpec (Rehovot, Izraelis). Antikūnai prieš PDL (pelės monokloninis) ir STAT-1 buvo įsigytas iš pietūs biotechnologijos, Inc. (Lake Placid, NY, JAV) ir neutralizuojančių antikūnų į IP-10 buvo įsigytas iš R & D Systems (Mineapolis, MN, JAV). Antikūnų P-Y701-Stat-1 buvo įsigytas iš mobiliųjų Signalizacijos technologijos (Beverly, MA). Antikūnai prieš Histonas, Lamin B ir PDL (triušis polikloninis) buvo nupirkta iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, JAV) ir anti-tubulino antikūnų buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich, Co (St Louis, MO, USA) .

imunohistocheminis, ląstelių skaičius, ir matavimo imunoreaktyviųjų sričių

žmogaus skrandžio vėžio audiniuose buvo tvarkomi imunohistocheminio analizę, kaip aprašyta anksčiau [2] su nežymiais pakeitimais. Pirminiai antikūnai PDL (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, JAV) ir TL-10 (1:50; R & D Systems) buvo panaudoti. Visos skaidrės buvo counterstained su Mayer hematoksilinu. Teigiami kontroliniai mėginiai buvo gauti naudojant Palatine tonziles PDL baltymų ir CD8 ir nosiaryklės nediferencijuotose karcinoma IP-10. Neigiami kontroliniai mėginiai buvo gautas pašalinant pirminius antikūnus iš visų skaidres. Immunopositivity PDL baltymų buvo klasifikuojama kaip difuzinis teigiamos (branduolinės reaktyvumas į ≥50% naviko ląstelių), židinio pozityvumo (iš ≥10%, bet < 50%), arba visiškas praradimas (< 10% vėžinių ląstelių). Į CD8 imunoteigiamų ląstelių skaičius viename didelės galios lauke (HPF, X40) 0,25 mm ^{2 penkias atsitiktinai pasirinktas auglio infiltracinė sienų buvo skaičiuojami už kiekvieną medžiagoje, po to skaičiuojant vidutinį skaičių ir SD. Immunopositivity IP-10 buvo apibrėžtas kaip bet kokio branduolinio arba citoplazmos teigiamo žodžio vėžinių ląstelių. Nustatant išsakytą lygį kiekvienoje skaidrėje, skaitmeniniai vaizdai buvo gauti naudojant mikroskopą montuojamas skaitmeninį fotoaparatą. Naudojant ImageJ programinė įranga (http://rsb.info.nih.gov/ij~~HEAD=dobj), kiekvienas paveikslėlis buvo konvertuoti į 8 bitų pilka masto, o lankytini vietovės tankių buvo matuojamas nuo d ÷ l palūkanų regione pikselių; tik pikselių viršija tam tikrą lygį (> 50 intensyvumo vertė). buvo įtraukti pašalinti fono klaidą}

siRNR transfekcija

NIH3T3 ląstelės buvo laikinai perkeltų naudojant Mirus transfekcijq reagento (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLoS ONE: downregulation iš RPL6 pagal siRNA slopina proliferaciją ir ląstelinį ciklą Žmogiškųjų Skrandžio vėžio ląstelių Lines
• PLoS ONE: mir-29a slopina ląstelių proliferaciją ir indukuoja ląstelės ciklo arešto per p42.3 downregulation į žmogaus Skrandžio Cancer