Maagkanker is een van de meest voorkomende oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte wereldwijd. Expressie van het tumor suppressor, promyelocytische leukemie (PML) eiwit wordt verlaagd of afgeschaft maagcarcinomen, samen met een verhoogd niveau van lymfatische invasie, ontwikkeling van hogere pTNM staging en ongunstige prognose. Hierin hebben we de relatie tussen de mate van tumor-infiltrerende lymfocyten en de status van PML eiwitexpressie in gevorderde maagcarcinoom. We observeerden hoger aantal infiltrerende T-cellen in maagcarcinoom weefsels waarin PML expressie is verlaagd of opgeheven, tegenover weefsels positief voor PML. De mate van T-celmigratie richting kweeksupernatanten verkregen van interferon-gamma (IFN-γ-gestimuleerde maagcarcinoom cellijnen werd bovendien beïnvloed door expressie van PML in vitro Visum: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Verlies van de Promyelocytic Leukemie Protein bij maagkanker: Gevolgen voor de IP-10 Expressie en Tumor-Infiltrating Lymfocytes. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264 Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), de Verenigde Staten van Amerika Ontvangen: 21 april 2011; Aanvaard: 23 september 2011; Gepubliceerd: 12 oktober 2011 Copyright: © 2011 Kim et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (2010-0015506) naar Y-HC, door de National Research Foundation Korea (NRF) gefinancierde door de Korea overheid (MEST) (2010-0029353) naar JLK, en door RO1 NS50665 te ENB. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Maagkanker is een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd. Recente ontwikkelingen in genetica het detecteren van gebeurtenissen in de loop van maagkanker, waaronder activering van oncogenen vergemakkelijkt, onderdrukking van tumorsuppressorgenen en mutatie van genen betrokken bij DNA-herstel [1]. Onder deze genetische gebeurtenissen, is het bekend dat tumor suppressor promyelocytische leukemie (PML) eiwitexpressie verminderd of afgeschaft maagkanker, en dat dit gepaard gaat met uitgebreidere lymfatische invasie, hogere pTNM opvoeren, en ongunstige prognose, wat suggereert dat PML verlies verbonden carcinogenese en maagcarcinoom progressie [2]. Eerdere studies Betrokken Pml de Pml Progressieve mutatie en genetische veranderingen in verscheidene tumorsuppressorgenen bevorderen tumorontwikkeling en progressie [18]. Naast genetische veranderingen in tumorcellen, zowel ontstekingscellen en mediatoren bij aan de vorming van bepaalde tumoren micromilieu [19], [20]. Tumor-geassocieerde fibroblasten (TAF) en macrofagen (TAM) zijn betrokken bij de modulatie van de tumor micro TAM blijken te correleren met angiogenese en een ongunstige prognose bij verschillende soorten kanker, met inbegrip van maagkanker [22], [28]. Mestcel veroorzaakt vele angiogene factoren en een verscheidenheid aan cytokinen, en de dichtheid is gemeld dat sterk correleert met de omvang van de tumor neo- angiogenese en slechte prognose [29], [30]. CD4 + en CD8 + lymfocyten zijn ook gevonden in een verscheidenheid van vaste kanker weefsels. Tot nu toe, de precieze moleculaire mechanismen waarbij het type en het aantal tumor- infiltrerende cellen gereguleerd grotendeels onbekend. Er zijn verschillende controversieel verslaglegging van het aantal en de functie van tumor-infiltrerende lymfocyten. Vooral CD8 + T lymfocyten, terwijl hun functie bekend wordende getransformeerde cellen te elimineren en bijdragen aan immuunsurveillance [31], wordt gemeld dat CD8 + tumor-infiltrerende T cellen defect in effectorfase functie bij contact met tumorcellen [32] en de infiltratie gekoppeld ongunstige prognose van soorten kanker zoals nonsmall longkanker en nasofaryngeale carcinomen [33], [34]. Chemokinen uitgescheiden door stromale cellen of tumor cellen beïnvloeden tumor celmigratie, invasie, proliferatie, angiogenese en immuuncel infiltratie in de tumormassa [35]. IFN-γ-induceerbare eiwit-10 (IP-10, CXCL10) is een van de CXC chemokinen die meerdere rollen in ontstekingsziekten en kanker [36] bereikt, [37]. Aangezien IP-10 bevordert preferentieel Th1 immuunresponsen door krachtig aantrekken NK- en T-cellen wordt gesuggereerd als een mogelijke mechanismen van T-cel infiltratie tumoren. Of verlies van tumor suppressor genen in tumorcellen induceert werven lymfocyten en modulatie van de functies van deze cellen in tumor micro-omgevingen is nog onduidelijk. In de onderhavige studie hebben we onderzocht PML functie naar rekrutering van lymfocyten en modulatie van de expressie van tumor afgeleide factoren. Expressie van PML is omgekeerd gecorreleerd met de mate van infiltratie van CD8 + T-cellen in maagcarcinomen. PML verlies werd verder geassocieerd met verhoogde expressie van IP-10, een van de lymfocyt aantrekken CXC chemokinen, in gastrische carcinoomcellen en weefsels. PML knockdown bevorderd IFN-γ-gemedieerde STAT-1 binding aan de IP-10 promoter, resulteert in verhoogde transcriptie van de IP-10 gen. Ondersteunen onze gegevens het idee dat PML is betrokken bij rekrutering van lymfocyten in tumoren, Resultaten Verlies van PML-eiwit is geassocieerd met een verhoogde infiltratie van CD8 + T-cellen in gevorderde maagcarcinoom weefsel Immunohistochemische kleuring voor PML en CD8 werd uitgevoerd om te onderzoeken of de mate van lymfocyt infiltratie werd geassocieerd met PML expressie status bij gevorderde maagkanker. CD8-immunopositive cellen werden geteld zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen. In totaal werden 35 monsters (71,4%) lieten een gedeeltelijke tot volledig verlies van PML in de tumorcel kernen van stadium IV advanced maagcarcinomen. Monsters van 14 geavanceerd maagcarcinoom patiënten waren positief voor diffuus PML en bevatte gemiddeld 32,7 CD8 + T-cellen per veld (Figuur 1A). We identificeerden 19 gevallen van gevorderde maagcarcinoom tentoonstellen focal positiviteit voor PML, met een gemiddelde van 47.2 CD8 + T-cellen per veld. Bovendien volledig verlies van PML waargenomen bij 16 geavanceerd maagcarcinoom patiënten; de monsters bevatten aan gemiddeld 52,8 CD8 + T-cellen per veld. Monsters weergave focal positiviteit of volledig verlies van PML toonde een duidelijke toename in CD8 + T-cel nummer dan deed exemplaren tentoonstellen diffuse positiviteit voor PML. Representatieve beelden worden weergegeven in figuur 1B. Hoewel PML eiwitexpressie werd verlaagd of afgeschaft tumorcellen, alle normale maagslijmvlies klieren, stromale weefsels en lymfoïde cellen, vertoonden diffuse matige tot sterke nucleaire immunopositivity voor PML. Gezien het verlies van PML eiwitexpressie en de toename van infiltratie van CD8 + T-lymfocyten in geavanceerde maagcarcinoom weefsels veronderstelden we dat PML bijgedragen om T-cel infiltratie /migratie in maagkanker. Om te onderzoeken of de PML-niveau bij maagkanker cellen beïnvloed T-cel migratie, geconditioneerde media van SNU-638 cellen tijdelijk getransfecteerd met ofwel Pml Chemokinen, een familie van chemotactische cytokinen, het bevorderen van migratie van circulerende leukocyten /lymfocyten naar sites van ontsteking en letsel. Om te onderzoeken of chemokine niveaus werden beïnvloed door de Pml Vervolgens hebben we gekeken naar de relatie tussen de IP-10 en PML eiwitexpressie in gevorderde maagcarcinoom weefsel. weefsels kanker werden immunohistochemisch gekleurd PML en IP-10 en de intensiteit van IP-10 immunopositivity werd gemeten zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen. De gemiddelde intensiteit van IP-10 was 1,2 in 14 monsters toont diffuse positiviteit (DP) voor PML, 2,2 in 19 gevallen van focale positiviteit (FP), en 2,0 in 16 monsters waarin er volledig verlies (CL) van PML expressie ( Figuur 4A, linker paneel). Significante toename in IP-10-expressie werden waargenomen in monsters toont focale positiviteit van PML ( P Al SNU-638- Pml PML knock-down verbetert IP-10 promotor activering Als IP-10-expressie in PML knockdown cellen werd verhoogd, we nader onderzocht of PML eiwituitdrukking beïnvloed IP-10 promotor activiteit. De muizen IP-10 promoter bevat een vermeend GAS-element dat tussen nts -246 en -238 (TTN 5AA) (figuur 6A). We eerder gemeld dat PML negatief reguleert de transcriptionele activiteit van STAT-1 [17]. Om na te gaan of de PML beïnvloed IFN-γ-geïnduceerde IP-10 genexpressie via het effect van PML op-IFN-γ geïnduceerde STAT-1 DNA binding aan de IP-10 promoter werd verder onderzocht. PML eiwitoverexpressie in NIH3T3-cellen, na transiënte transfectie met PML IV expressievector gedeeltelijk geblokkeerd IFN-γ-geïnduceerde STAT-1 DNA binding aan de IP-10 promoter, waaronder de sequentie van -246 tot -238 (figuur 7A, vergelijk lanen 3 en 5). Concurrentie met een 100-molaire overmaat ongelabeld oligonucleotide dat codeert voor de IP-10 promoter ingetrokken complexvorming (laan 6). De niveaus van PML en STAT-1 eiwitexpressie in gehele cellysaten (WCL) en de mate van STAT-1 tyrosine fosforylatie in kernextracten (NE) werden geverifieerd door immunoblotting. NE gebruikmaking van NIH3T3- Pml Histopathologische studies hebben aangetoond dat de inflammatoire micromilieu van tumoren wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van mononucleaire celinfiltraten, zowel in de ondersteunende stroma en tumor regio. De precieze mechanismen waardoor mononucleaire cellen infiltreren en ze houden binnen kankerweefsel momenteel niet volledig begrepen. In de huidige studie, bieden we het bewijs dat het verlies van de expressie van de tumor suppressor eiwit, PML, draagt bij aan de versterking van de lymfocyt infiltratie in maagkanker weefsel, via We hebben gekeken naar de functie van PML met betrekking tot de aanwerving van lymfocyten met behulp van maagkanker weefselmonsters mens, Pml IP-10, een lymfocyt gericht CXC chemokine geïnduceerd door type I en II IFN, speelt een belangrijke rol bij de rekrutering van lymfocyten onder verschillende ontstekingsaandoeningen [41]. IP-10 wordt uitgescheiden door tumor infiltrerende immuuncellen, en ook door tumorale en parenchymcellen in een interferon en cytokine-verrijkte micromilieu. TAF van longkankerpatiënten constitutief produceren en uitscheiden IP-10 [27]. Hepatocyten geïnfecteerd met het hepatitis C virus produceren IP-10 en veroorzaken migratie van geactiveerde T-cellen naar de lever parenchym, wat aangeeft dat IP-10 niveaus zijn gecorreleerd met histologische ernst en ontsteking [42]. In ons systeem is IP-10 secretie waargenomen bij maagkanker SNU-638-cellen, NIH3T3 fibroblasten en MEFs, in respons op IFN-γ en secretie werd versterkt in afwezigheid van PML eiwitexpressie. Aangezien we vastgesteld dat er geen merkbare verschillen in het niveau van STAT-1 expressie en fosforylering in afwezigheid of aanwezigheid van PML bij IFN-γ (figuren 3 en 7), verhoogde IFN-γ-geïnduceerde IP-10 transcriptie in afwezigheid van PML werd voornamelijk veroorzaakt door verhoogde STAT-1 DNA te binden aan IP-10-promotor. Wij stellen voor dat PML-gemedieerde remming van de STAT-1 DNA-binding leidt tot onderdrukking van de STAT-1-afhankelijke IP-10 expressie, in overeenstemming met onze eerdere bevindingen [17]. In deze studie identificeren we een potentiële regulerend gebied van PML in de IP-10 promoter, een vermoedelijke STAT-1-bindingsplaats. Verder tonen we aan dat PML knockdown verhogingen-IFN-γ geïnduceerde STAT-1 DNA binding aan de IP-10 promoter, en verbetert IP-10 niveaus in afwezigheid van PML. lymfocyten, neutrofielen, macrofagen, en mestcellen zijn de belangrijkste bestanddelen van de meeste tumor infiltraten. Tumor-infiltrerende lymfocyten geïdentificeerd in diverse vaste kankerweefsels. De specifieke functies van deze cellen in tumoren, en de precieze moleculaire mechanismen van lymfocyten rekrutering tumoren, blijft controversieel. De status en functionele relevantie van CD8 + T-cel infiltratie in tumoren, en de vereniging van dergelijke cellen met een prognose voor de patiënt, zijn ook onduidelijk. In niercelcarcinoom, is infiltratie van CD8 + T-cellen in verband met gunstige prognose [43]. Omgekeerd, zodanig infiltratie gekoppeld ongunstige prognose nonsmall cellige longkankerpatiënten [33]. We hier laten zien dat PML eiwitexpressie in tumorcellen omgekeerd gecorreleerd met de mate van infiltratie van CD8 + T-cellen in tumorweefsels. Wanneer de functie van PML in lymfatische invasie samen met het verband tussen PML expressie en ongunstige prognose [2] wordt beschouwd, blijkt dat een relatie tussen klinische kenmerken en de omvang van CD8 + T-cel infiltratie in maagkankerpatienten vergt nadere toelichting. kernen van de normale maagslijmvlies klieren, stromale weefsels, en lymfoïde cellen diffuus immunopositive (matig tot sterk) voor PML eiwitexpressie, terwijl PML werden verlaagd of afgeschaft in tumorcellen (Figuur 1). Deze bevindingen ondersteunen het idee dat kankercellen specifiek degradatiemechanismen voor PML. We zouden stellen voor dat post-translationele proteasoomafhankelijke degradatie verklaart het verlies van PML-eiwit. Met andere woorden, degradatie bij het transcriptieniveau niet werkzaam [2], [44]. PML eiwitexpressie verminderd of opgeheven in vele verschillende kankers, zoals prostaat-, borst-, CNS, colon-, long- en maagkanker [2], [3]. In overeenstemming met deze resultaten, zagen we een beperkte of verwaarloosbare expressie van PML bij gevorderde maagkanker weefsels. Bovendien, onze resultaten suggereren dat kanker cellen die verschillende niveaus van PML eiwit variëren in hun vermogen aan te trekken en te behouden lymfocyten in tumor gebieden, waardoor een verder bewijs dat dergelijke cellen actief deelnemen aan de oprichting van inflammatoire tumor micro-omgevingen, via NF-kB en STAT-3-signalering worden voorgesteld als belangrijke regulerende systemen koppelen ontsteking aan kanker [45] dienen. IL-6, een NF-KB-afhankelijke inflammatoire groeifactor, is essentieel voor de ontwikkeling van ontsteking geassocieerd carcinogenese [46]. Recente indirect bewijs is verder het idee dat de IL-6 /gp130 /STAT-3 signalering as dient als een autocriene en paracriene versterking lus longadenocarcinoom versterkt, multiple myeloma, Ras-getransformeerde kankercellen, en colitis-geassocieerde kankermodel [47], [48], [49], [50]. PML is aangetoond dat het onderdrukken van IL-6 geïnduceerde STAT-3 activiteit [51], apoptose promoten via Materialen en methoden Cells Primary en vereeuwigd Pml Een totaal van 49 maagcarcinoom paraffineblokken werden verkregen van 49 patiënten (29 mannen, 20 vrouwen, mediane leeftijd 64 jaar; range 35-84), die geheel of subtotale gastrectomie hadden ondergaan voor fase IV geavanceerde maagcarcinomen bij Mokdong Hospital, Ewha Womans University School of Medicine, Seoul, Korea van 2001 tot 2007. reagentia en antilichamen Recombinant muizen en menselijke IFN-γ (mIFNa-γ en hIFN- γ) en MIP-10 en hip-10 werden aangekocht van ProSpec (Rehovot, Israël). Antilichamen tegen PML (monoklonaal) en STAT-1 werden verkregen van Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) en neutraliserend antilichaam tegen IP-10 werd gekocht bij R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antilichamen tegen p-Y701-STAT-1 werd gekocht bij Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antilichamen tegen histon, Lamine B en PML (konijn polyklonaal) werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) en anti-tubuline antilichaam werd gekocht bij Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) . Immunohistochemie, cel-tellingen en metingen van immunoreactieve gebieden Human maagkanker weefsels werden verwerkt voor immunohistochemische analyse zoals eerder beschreven [2] met kleine aanpassingen. Primaire antilichamen PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (01:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), en IP-10 (01:50; R &D Systems) werden gebruikt. Alle objectglaasjes werden tegengekleurd met Mayer's hematoxyline. Positieve controles werden verkregen met palatine tonsil PML eiwit en CD8 en nasofaryngeale carcinomen ongedifferentieerde voor IP-10. Negatieve controles werden verkregen door het weglaten van primaire antilichamen van alle dia. Immunopositivity voor PML eiwit werd gecategoriseerd als diffuse positiviteit (nucleaire immunoreactiviteit in ≥50% van de tumorcellen), focale positiviteit (in ≥10% maar < 50%), of volledig verlies (in < 10% van de tumorcellen). Het aantal CD8 immunopositive cellen in een high power veld (HPF, x40) van 0,25 mm 2 voor vijf willekeurig gekozen tumor infiltrative grenzen werden geteld voor elk monster, gevolgd door berekening van het gemiddelde aantal en SD. Immunopositivity voor IP-10 werd gedefinieerd als een nucleaire of cytoplasmatische positieve uitdrukking in tumorcellen. Ter bepaling van de expressie van elk glaasje werden digitale beelden verkregen met behulp van een microscoop gemonteerde camera. Behulp ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij) werd elk beeld omgezet in 8-bits grijsschaal en specifieke dichtheden werden gemeten van de pixels in het gebied van belang; alleen pixels boven een bepaald niveau (> 50 intensiteit waarde). werden opgenomen om de achtergrond fouten te elimineren siRNA transfectie NIH3T3 cellen werden tijdelijk getransfecteerd met behulp van Mirus transfectiereagens (Mirus Bio LLC, Madison,
. Interferon-gamma-induceerbare proteïne 10 (IP -10 /CXCL10) expressie was verhoogd bij maagcarcinoom weefsels tonen verlaagde niveaus PML. Bovendien hebben zowel Pml
knockout en knockdown cellen weergegeven verbeterde IP-10 mRNA en eiwitexpressie in de aanwezigheid van IFN-γ. PML knockdown verhoogde IFN-γ gemedieerde Signal Transducer en Activator van transcriptie-1 (STAT-1) binding aan de IP-10 promoter, resulteert in verhoogde transcriptie van de IP-10 gen. Omgekeerd PML IV eiwitexpressie onderdrukt IP-10 promoter activatie . op basis van deze resultaten, stellen wij voor dat verlies van PML eiwitexpressie bij maagkanker cellen neemt niet alleen IP-10 transcriptie
via versterking van STAT-1 activiteit, die op zijn beurt stimuleert lymfocyttransport binnen tumor regio .
disfunctie bij progressie van verschillende kankers en verminderd of opgeheven expressie van PML is gemeld bij prostaat-, borst-, CNS, colon-, long- en maagkanker [2], [3] .
gen werd oorspronkelijk geïdentificeerd door fusie met het retinoïnezuur receptor betrokken bij de t (15; 17) translocatie geassocieerd met acute promyelocytische leukemie (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML is een tumorsuppressoreiwit die celcyclusprogressie, gentranscriptie, transformatie onderdrukking en apoptose reguleert. Pml
knockout muizen aanzienlijk gevoeliger zijn voor tumorvorming na blootstelling aan carcinogenen zijn dan wildtype controles en Pml
deficiënte cellen minder snel apoptose ondergaan na het aanbrengen van bepaalde soorten cellulaire stress [9]. Naast opgesteld die gericht op de tumor suppressor rol van PML hebben verscheidene studies bevestigden dat het eiwit werkt als een transcriptionele regulator,
via associatie met de co-activator CREB-bindend eiwit; co-repressoren waaronder HDAC, N-CvdR, en mSin3a; en de transcriptiefactoren Nur77, AP-1, myc, p53, en STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].
via de productie van cytokinen, chemokinen, interferonen, en andere biologisch actieve factoren [21], [22]. Overspraak tussen tumorcellen, TAFs, TAM en lymfocyten, is belangrijk in tumorontwikkeling en progressie, en draagt bij tot het stellen van tumor micromilieus verrijkt in expressie van een verscheidenheid van biologisch actieve factoren [23], [24], [25] , [26], [27].
via modulatie van de expressie van tumor afgeleide factoren zoals IP-10, verschaffen verder bewijs dat het verlies van tumor suppressor genen in tumor cellen actief deel aan de oprichting van de tumor micro-omgevingen.
PML beïnvloedt T-cel infiltratie /migratie in vitro
siRNA of PML IV expressievector, vervolgens behandeld met IFN-γ werd gebruikt in Transwell migratie assays. SNU-638 maagkanker cellen brachten hoge niveaus van PML eiwit, in overeenstemming met eerdere bevindingen [2], terwijl SNU-638-cellen die met Pml
siRNA weergegeven verlaagde endogene expressie PML (~46-56%) , zoals bevestigd door immunoblotting (Figuur 2A). IFN-γ veroorzaakte een bescheiden toename van PML eiwit expressie, in overeenstemming met eerdere resultaten [38]. Migratie van Jurkat T-cellen geconditioneerd medium in de richting van Pml
-siRNA getransfecteerde SNU-638-cellen werd significant verbeterd in vergelijking met die van het controle-siRNA getransfecteerde cellen, na behandeling met IFN-γ (figuur 2B). Na transfectie van SNU-638 met PML IV expressievector, migratie van Jurkat T-cellen geconditioneerd medium in de richting van PML IV overexpressie cellen werd verminderd in vergelijking met die van lege vector (Figuur 2C). Deze resultaten suggereren dat PML regelt de niveaus van secretorische moleculen door en vrijkomen bij IFN-γ-gestimuleerde maagkanker cellen en beïnvloedt ook de migratie van T-lymfocyten.
Verlies van PML versterkt IFN-γ-geïnduceerde IP-10 expressie
genetische status werd chemokine genexpressie onderzocht met behulp van bescherming ribonuclease assay (RPA). Pml
+ /+ en Pml
- /- muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen werden geïncubeerd in de aan- of afwezigheid van IFN-γ voor 0-24 uur totale mRNA werd verzameld op verschillende tijdstippen, en onderworpen aan RPA. In Pml
- /- MEF, IP-10-mRNA-niveaus 1,5-voudig verhoogd in 2 uur, en werd duidelijk verhoogde (8-voudig) met 4 h (figuur 3A). RANTES mRNA niveaus verhoogd 3,2-voudig bij 0,5 uur en bleven verhoogd, maar in mindere mate (1,3-voudig), 8 uur na IFN-γ behandeling Pml
- /- MEF . Andere chemokine genen, waaronder MIP-1, MIP-2 en MCP-1, werden niet detecteerbaar uitgedrukt in Pml
+ /+ of Pml
- /- MEF (gegevens niet getoond). STAT-1 expressie werd verhoogd na blootstelling aan IFN-γ in beide celtypen, maar geen verschil was duidelijk wanneer IFN-γ niveaus werden vergeleken tussen de Pml
+ /+ en Pml
- /- cellen. Als transcriptie van de IP-10-gen aanzienlijk werd verhoogd in IFN-γ-gestimuleerde Pml
- /- MEF, we gemeten relevante proteïne niveaus in kweeksupernatanten van Pml
+ /+ en Pml
- /- MEF, met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). In overeenstemming met de RPA resultaten, hogere niveaus van IP-10-eiwit waren duidelijk in geconditioneerd medium van IFN-γ-behandelde Pml
- /- MEF (Figuur 3B). Ook IP-10 mRNA expressie in Pml
-siRNA getransfecteerde NIH3T3-cellen werd verbeterd, vergeleken met die van het controle-siRNA getransfecteerde cellen na IFN-γ behandeling (Figuur 3C). De vermindering van de expressie van PML eiwit in Pml
-siRNA getransfecteerde NIH3T3 cellen werd bevestigd door immunoblotting.
Minder PML uitdrukking is omgekeerd gecorreleerd met IP-10-eiwit levels bij maagkanker weefsel en SNU- 638 cellen
= 0,034), in vergelijking met die tonen diffuse positief PML expressie. Een verhoging van de IP-10-expressie werd waargenomen wanneer volledig verlies van PML was duidelijk, in vergelijking met wat werd opgemerkt toen PML was diffuus uitgedrukt; echter, heeft dit verschil niet statistisch significant. Representatieve voorbeelden van variaties in PML eiwitstatus die gecorreleerd met verschillende IP-10 expressie in tumorcellen van geavanceerde maagcarcinomen getoond (figuur 4A, rechts). De relatie tussen IP-10 en PML eiwitexpressie in gastrische carcinoma cellijnen, IP-10 eiwitniveaus werden gemeten in kweeksupernatanten van SNU-638-cellen die transiënt zijn getransfecteerd met ofwel Pml
siRNA of PML IV exression verder te bestuderen vector. Cellen werden gekweekt in de afwezigheid of aanwezigheid van IFN-γ gedurende 8 uur supernatanten verzameld en IP-10 niveaus daarin gekwantificeerd (door ELISA). IFN-γ-geïnduceerde IP-10 secretie significant verbeterd in SNU-638- Pml
-siRNA getransfecteerde cellen, in vergelijking met die van SNU-638-cellen getransfecteerd met controle-siRNA (figuur 4B). Transfectie van SNU-638 met PML IV expressievector onderdrukt IFN-γ-geïnduceerde IP-10 uitscheiding (Figuur 4C). De resultaten tonen duidelijk aan dat de uitscheiding van IP-10 van maagkanker cellen wordt verhoogd wanneer PML expressie wordt verminderd.
IP-10 neutralisatie vermindert migratie van T-cellen
-siRNA bevattende cellen die verlaagde PML eiwit toonde verhoging van T-cel rekrutering en IP-10 secretie in reactie op IFN-γ (figuren 2 en 4), we vervolgens onderzocht of een toename IP 10 levels vergemakkelijkt T-celmigratie richting geconditioneerde medium van SNU-638 maagkanker cellen gestimuleerd met IFN-γ. SNU-638- Pml
siRNA-cellen werden gekweekt in de afwezigheid of aanwezigheid van IFN-γ gedurende 8 uur, en de verzamelde supernatanten werden voorbehandeld met anti-IP-10 neutraliserend antilichaam of controle niet-specifieke IgG voor 1 uur voor aanvang van het Transwell assay. Neutraliserende antilichamen of IgG-bevattende supernatanten werden geplaatst in de onderste kamers en migratie van Jurkat cellen van bovenste naar onderste kamers werd geanalyseerd door cellen geoogst uit de onderkamer. Opname van IP-10-neutraliserende antilichamen remde Jurkat T-cel migratie in de richting van geconditioneerde medium van SNU-638- Pml
siRNA-cellen (Figuur 5A). Deze bevindingen komen overeen met de gegevens verkregen van NIH3T3-cellen; een IP-10-neutraliserende antilichamen remde EL-4 T-cel migratie in de richting van geconditioneerde medium van NIH3T3- Pml
siRNA-cellen (Figuur 5B).
een mechanisme met STAT-1, die we en genereerde een reporter construct die begint op positie -330 van de muizen IP-10-promotor met de vermeende GAS-element, zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen. De IP-10-
luc reporter die de GAS-element werd transiënt getransfecteerd in NIH3T3-cellen geïncubeerd met of zonder IFN-γ gedurende 24 uur, en vervolgens onderzocht op luciferaseactiviteit. IFN-γ-geïnduceerde IP-10 promotoractiviteit werd significant verbeterd in NIH3T3-cellen getransfecteerd met Pml
siRNA vergeleken met cellen waar controle siRNA (figuur 6B). Na transfectie van NIH3T3 cellen met de PML IV expressievector werd IFN-γ-geïnduceerde IP-10 promoter activatie aanzienlijk onderdrukt. Neerwaartse regulatie van PML expressie met behulp van Pml
siRNA en overexpressie van PML door PML IV expressievector werden geverifieerd door immunoblotting. Te bepalen of het remmende effect van PML IFN-γ-geïnduceerde IP-10 promotoractiviteit is opgetreden bij maagkanker cellijnen voerden we soortgelijke experimenten met SNU-638 maagkanker cellen. De patronen van toename en afname van de luciferaseactiviteit in SNU-638 waren vergelijkbaar met die van NIH3T3-cellen (Figuur 6C). Het niveau van eiwitexpressie in PML SNU-638-cellen getransfecteerd met ofwel Pml
siRNA of PML IV expressievector werd geverifieerd door immunoblotting (gegevens niet getoond).
PML knockdown verhogingen IFN-γ- geïnduceerde STAT-1 DNA binding aan de IP-10 promoter
siRNA cellen verkregen na 0,5 h IFN-γ behandeling sterke binding aan de muizen IP-10 promoter waargenomen (Figuur 7B, bovenste paneel, laan 5), vergeleken met binding gezien in NIH3T3-control siRNA cellen (laan 3). Dezelfde NE's werden blootgesteld aan de STAT-1 consensus oligonucleotide, en STAT-1 DNA-bindende werd versterkt in NE uit NIH3T3- Pml
siRNA-cellen (Figuur 7B, middenpaneel, vergelijk de lanen 3 en 5). Gebruik SNU-638 maagkanker cellen, vonden we ook dat STAT-1 DNA binding van Pml
-siRNA getransfecteerde SNU-638-cellen was verbeterd vergeleken met die van het controle-siRNA getransfecteerde cellen, na behandeling met IFN-γ (Figuur 7C, vergelijk de lanen 3 en 5). Deze gegevens aan dat PML gedeeltelijk remt STAT-1 binding aan de IP-10 promoter, en dat dit effect is gecorreleerd met verhoogde IFN-γ-geïnduceerde IP-10 transcriptie in afwezigheid van PML.
Discussie
regulering van de IP-10 expressie.
+ /+ en Pml
- /- MEF, en PML knockdown in zowel NIH3T3 en SNU-638-cellen. Gegevens verkregen van zowel menselijk weefsel tests en de transwell migratie assays toonde aan dat het verlies van PML bevordert lymfocyt mensenhandel; dus we zochten mechanismen die mogelijk deze waarnemingen kunnen verklaren. We tonen aan dat een toename van IP-10 niveaus in kankercellen tot expressie lage PML bijdraagt aan lymfocyt recrutering. Bovendien, IP-10 neutraliserende antilichamen remde T-celmigratie richting geconditioneerde medium van NIH3T3 fibroblasten en SNU-638 maagkanker cellen in vitro
, consistent met de resultaten van diverse eerdere In vivo studies
, waaruit bleek dat neutralisatie van IP-10 onderdrukt T-celrecrutering [39], [40]. Voor zover ons bekend is dit de eerste studie blijkt dat de tumor suppressor, PML, reguleert IP-10 chemokine transcriptie en lymfocyttransport bij maagkanker door moduleren van de activiteit van de IFN-γ /STAT-1 signaleringsroute.
PML-gemedieerde mechanismen.
-TNF gemedieerd proces, en om cellen te sensibiliseren apoptose door remming van de NF-KB gemedieerde overleving pathway [52]. Echter, moet nog worden vastgesteld of het verlies van de tumor suppressor PML bij aan veranderingen in de immuunrespons van de gastheer en de tumor micro-omgeving, bijvoorbeeld als gevolg van hetzij immunosurveillance of immune escape, door modulatie van transcriptiefactoren. Zo zou het interessant zijn om de effecten van het verlies van PML eiwitexpressie op NF-KB /STAT-3 en STAT-1-signalering te vergelijken en te bepalen of deze transcriptiefactoren werken op een gecoördineerde wijze de expressie van een subset van regulering chemokines bij te dragen aan de totstandkoming van inflammatoire tumor micro-omgevingen.
+ /+ en Pml
- /- MEF werden opgericht en in stand gehouden zoals eerder beschreven [53]. De SNU-638 menselijke maag carconoma cellijn, werden Jurkat menselijke T-cel lymfoblast-achtige cellijn en EL-4 muis T-lymfoom cellijnen gehandhaafd zoals eerder beschreven [2], [54].
maagcarcinoom weefsels
Longmicrobioom voorspelt ernst van de ziekte van COVID-19
Xylitol en grapefruitzaadextract zijn veelbelovend bij het voorkomen van SARS-CoV-2-infectie,
Lichaamstrillingen helpen ontstekingen te verminderen,
Darmmicrobioom verandert bij het koken van plantaardig voedsel,
Rurale en stedelijke microbiota verschillen van jongs af aan,
Nieuwe studie toont verbeterde overleving voor patiënten met gevorderde colorectale BRAF-mutante kanker
Hoe helpen gastheerfactoren zoals het longmicrobioom bij SARS-CoV‐2-infectie?
Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is een RNA-virus dat behoort tot het geslacht Coronaviridae en het subgenus betacoronavirus. Het is de nieuwe en zeer besmettelijke ziekte
Anti-coronavirusmoleculen van microben kunnen de sleutel zijn tot nieuwe behandelingen
Microben in de darm die nuttige verbindingen produceren, kunnen de sleutel zijn tot de behandeling van symptomen van coronavirus. Darm microbioom. Image Credit:Anatomy Image/Shutterstock.
Penismicrobioom is reservoir voor bacteriële vaginose-geassocieerde bacteriën
Onder de seksueel overdraagbare aandoeningen (soas), bacteriële vaginose treft meer dan 20 procent van de vrouwen over de hele wereld. De aandoening komt voort uit de proliferatie van bepaalde bacteri