PLoS ONE: Menetys promyelosyyttileukemian proteiini mahasyövän: Implications for IP-10 Expression ja kasvain-infiltroivien Lymphocytes

tiivistelmä

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syistä syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti. Expression of kasvain vaimennin, promyelosyyttinen leukemia (PML) proteiini, vähennetään tai se poistetaan vuonna mahakarsinoomat, yhdessä tehostettuun imusuonten hyökkäystä, kehittäminen korkeamman pTNM lavastus, ja epäsuotuisa ennuste. Tässä tutkimme suhdetta laajuus kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja asema PML-proteiinin ilmentymistä kehittynyt mahasyöpä. Havaitsimme Useammat soluttautua T-solujen mahakarsinoo- kudoksissa, jossa PML ilmentyminen vähennetään tai se poistetaan, verrattuna kudoksiin positiivinen PML. Laajuus T-solumigraation kohti viljelmien supernatanteista saatu interferoni-gamma (IFN-γ-stimuloidun mahahapon sinoomasolulinjoja on lisäksi vaikuttanut ekspressioon PML in vitro
. Interferoni-gamma-indusoituva proteiini 10 (IP- -10 /CXCL10) ekspressio lisääntyi mahakarsinoo- kudoksissa näytetään vähentää PML tasoja. Lisäksi sekä PML
knockout ja pudotus solujen tehostunut IP-10-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen, kun läsnä on IFN-γ. PML pudotus lisääntynyt IFN-γ-välitteisen signaalin muuntimet ja Activator of Transcription-1 (STAT-1) sitoutuminen IP-10-promoottorin, jolloin kohonnut transkriptio IP-10-geeni. Kääntäen, PML IV proteiinin ilmentyminen tukahdutetaan IP-10-promoottorin aktivaation . näiden tulosten perusteella ehdotamme, että menetys PML-proteiinin ilmentymistä mahasyövän soluissa osaltaan lisäsi IP-10 transkriptio kautta
tehostaminen STAT-1 aktiivisuutta, mikä puolestaan ​​edistää lymfosyyttiliikennettä sisällä kasvain alueilla .

Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) menettäminen promyelosyyttileukemian proteiini mahasyövän: Implications for IP-10 Expression ja kasvain-tunkeutuvia lymfosyyttejä. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264

Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 huhtikuu 2011; Hyväksytty 23. syyskuuta 2011; Julkaistu: 12 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia (2010-0015506) Y-HC, National Research Foundation of Korea (NRF) rahastoiva jonka Korean hallitus (MEST) (2010-0029353) on JLK sekä RO1 NS50665 ja ENB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Viimeaikaiset edistysaskeleet genetiikan ovat helpottaneet havaitsemista tapahtumista aikana mahasyövän, mukaan lukien aktivoituminen onkogeenien, hiljentäminen kasvainten synnyssä, ja mutaatio liittyvien geenien DNA: n korjaukseen [1]. Näistä geneettisiä tapahtumia, tiedetään, että kasvain vaimennin promyelosyyttinen leukemia (PML) proteiinin ilmentymistä vähennetään tai se poistetaan mahasyövän, ja että tämä liittyy laajempaan imusuonten invaasio, korkeampi pTNM lavastus, ja epäsuotuisa ennuste viittaa siihen, että PML menetys on liittyy syövän synnyn ja mahakarsinoo- eteneminen [2]. Aikaisemmat tutkimukset sekaantunut PML
toimintahäiriöitä etenemistä erilaisia ​​syöpiä, ja vähennetään tai se poistetaan ilmaus PML on raportoitu eturauhas-, rinta-, keskushermoston, paksusuoli-, keuhko-, ja syöpien [2], [3] .

PML
geeni tunnistettiin alun perin fuusiolla kanssa retiinihapporeseptorin mukana t (15; 17) kromosomaaliseen translokaatio liittyvä akuutti promyelosyyttinen leukemia (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML on tuumorisuppressoriproteiinia joka säätelee solusyklin etenemistä, geenitranskriptiota, transformaatio tukahduttaminen, ja apoptoosin. PML
hiirten ovat huomattavasti herkempiä kasvaimen muodostumisen altistumisen jälkeen karsinogeeneja kuin ovat villin tyypin valvontaa, ja PML
vajausta solut ovat vähemmän todennäköisesti apoptoosiin soveltamisen jälkeen tietyntyyppisiä solustressiä [9]. Sen lisäksi, jossa keskitytään tuumorisuppressorigeenin roolia PML, useat tutkimukset ovat vahvistaneet, että proteiini toimii transkription sääntelijä, kautta
yhdessä koaktivaattoria CREB-sitova proteiini; co-repressors myös HDAC, N-CoR ja mSin3A; ja transkriptiotekijöille Nur77, AP-1, myc, p53, ja STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progressive mutaatio ja geneettisiä muutoksia useissa tuumorisuppressorigeeneille edistää kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [18]. Lisäksi geneettiset muutokset sisällä tuumorisoluissa, sekä tulehdussolujen ja välittäjien edistää muodostumista erityisesti kasvaimen mikroympäristöihin [19], [20]. Kasvaimeen liittyvä fibroblasteissa (TAFs) ja makrofagit (TAM) on myös mukana modulaatio kasvaimen mikroympäris- kautta
sytokiinien, kemokiinien, interferonien, ja muita biologisesti aktiivisia tekijöitä [21], [22]. Cross-talk keskuudessa kasvainsoluja, TAFs, TAM, ja lymfosyytit, on merkittävä kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen, ja edistää perustamiseen kasvaimen mikroympäristöjen rikastettu ilmaus erilaisten biologisesti aktiivisten tekijöiden [23], [24], [25] , [26], [27].

TAM on todettu korreloivan angiogeneesiä ja epäsuotuisa ennusteeseen useiden syöpätyyppien, kuten mahasyövän [22], [28]. Syöttösolujen tuottaa paljon angiogeenisten tekijöiden ja erilaisia ​​sytokiineja, ja sen tiheys on raportoitu erittäin korreloivan laajuus kasvaimen neoangiogeneesin ja huonoon ennusteeseen [29], [30]. CD4 ^{+ ja CD8 + lymfosyytit löytyy myös erilaisia ​​kiinteitä syöpä kudoksiin. Tähän asti molekyylitason mekanismeja, joiden tyyppi ja määrä kasvaimeen infiltroituvat solut säätelevät ovat suurelta osin tuntemattomia. On olemassa useita kiistanalaisia ​​raportteja osalta lukumäärä ja tehtävät kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä. Erityisesti CD8 + T-lymfosyyttejä, kun taas niiden funktio on tunnetusti poistaa orastavan transformoitujen solujen ja edistää immuunitutkimusohjelmasta [31], on raportoitu, että CD8 + kasvainta infiltroituneen T-solut ovat puutteellisia Efektorivaihe toiminto kosketuksessa kasvaimen soluihin [32], ja niiden tunkeutuminen liittyy epäedullinen ennustetta tietyntyyppiset syövät kuten nonsmall keuhkosyöpä ja nenänielun karsinooman [33], [34].}

Kemokiinit erittävät stroomasolut tai kasvain solut vaikuttavat kasvainsolun muuttoliike, invaasio, proliferaatio, angiogeneesi ja immuunijärjestelmän solujen tunkeutuminen kasvain massa [35]. IFN-γ-indusoituva proteiini-10 (IP-10, CXCL10) on yksi CXC-kemokiinien, joka toistaa useita rooleja tulehdussairauksien ja syövän [36], [37]. Koska IP-10 edullisesti edistää Th1 immuunivasteita voimakkaasti houkuttelemalla NK ja T-solujen, on ehdotettu yhtenä mahdollisista mekanismeista T-solujen infiltraatio kasvaimissa.

Onko menetys tuumorisuppressorigeeneille kasvainsoluissa indusoi rekrytointi lymfosyyttien ja modulaatio toimintoja tällaisten solujen kasvain mikroympäristöihin on tällä hetkellä epäselvä. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme PML toiminnon suhteen rekrytointi lymfosyyttien ja modulaatio ilmentymisen tuumorista peräisin tekijät. Expression of PML oli korreloi käänteisesti laajuus tunkeutumisen CD8 ^{+ T-solujen mahakarsinoomat. PML häviö liittyy edelleen parannettu ekspressio IP-10, yksi lymfosyytti-houkutella CXC-kemokiinien, mahalaukun karsinooma soluja ja kudoksia. PML pudotus edisti IFN-γ-välitteisen STAT-1 sitoutumisen IP-10-promoottorin, mikä lisää transkription IP-10-geeni. Meidän tiedot tukevat käsitystä, että PML osallistuu lymfosyyttien värväytymistä kasvaimiin, kautta
modulaatio ekspressiotasot kasvain- tekijöistä, kuten IP-10, tarjoaa uutta näyttöä siitä, että menetys tuumorisuppressorigeeneille kasvaimen solut osallistuu aktiivisesti perustamista kasvain mikroympäristöihin.}

tulokset

menetys PML-proteiinin liittyy lisääntynyt infiltraatio CD8 ^{+ T-solujen kehittynyt mahakarsinoo- kudos}

immunohistokemiallinen värjäys PML ja CD8 avulla selvitettiin, onko siinä määrin lymfosyyttien tunkeutumisen liittyi PML ilmentymistilanne pitkälle mahasyövässä. CD8-immunopositiivisen solut laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaikkiaan 35 näytettä (71,4%) osoitti osittainen-to-täydellinen menetys PML kasvainsolun ytimet vaiheen IV kehittyneen mahakarsinoomat. Näytteet 14 kehittynyt mahakarsinoo- potilaista oli hajanaisesti positiivisia PML, ja sisälsi keskimäärin 32,7 CD8 ^{+ T-solujen määrä kenttää kohden (kuvio 1A). Havaitsimme 19 tapauksia kehittyneiden mahakarsinooman näytteille polttovälin positiivisuutta PML, keskiarvon ollessa 47,2 CD8 + T-solujen määrä kenttää kohden. Lisäksi täydellinen menetys PML havaittiin 16 kehittynyt mahasyöpä potilaita; näytteet sisälsivät keskimäärin 52,8 CD8 + T-solujen määrä kenttää kohden. Näytteitä näytetään polttoväli positiivisuus tai täydellinen menetys PML osoitti voimakkaampaa kasvua CD8 + T-solujen määrä kuin teki yksilöiden näytteille diffuusi positiivisuutta PML. Kuvat ovat esitetään kuviossa 1B. Vaikka PML-proteiinin ilmentymistä vähennetään tai se poistetaan kasvainsoluissa, kaikki normaalin mahalaukun limakalvon rauhaset, strooman kudokset, ja imusolujen, näytteillä diffuusi kohtalainen-vahva ydinvoiman immunopositivity PML.}

PML vaikutteita T-solujen tunkeutuminen /muuttoliike in vitro

Koska menetys PML-proteiinin ilmentymisen ja kasvu soluttautuminen CD8 ^{+ T-lymfosyyttien kehittynyt mahasyöpä kudoksia, me arveltu, että PML osaltaan T-solujen tunkeutuminen /muuttoliikkeen mahasyövässä. Tutkia, onko PML tason mahalaukun syöpäsoluissa vaikuttanut T-solujen vaeltamiseen, väliaine mistä SNU-638-solut transfektoitiin joko PML
siRNA tai PML IV ekspressiovektoria, sitten käsiteltiin IFN-γ hyödynnettiin TranswellTM muuttoliike määrityksiä. SNU-638 mahasyövän solut ilmensivät korkeita PML-proteiinin, yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen [2], kun taas SNU-638-solut transfektoitu PML
siRNA näytetä kevyemmästä endogeenisen PML ilmaisun (~46-56%) on vahvistanut, immunoblottauksella (kuvio 2A). IFN-γ aiheuttama vaatimaton kasvu PML-proteiinin ilmentymisen, yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa [38]. Migraatio Jurkat-T-solujen kohti väliaine PML
siRNA-transfektoiduissa SNU-638-soluissa oli merkittävästi parannettu verrattuna kontrolli-siRNA-transfektoiduissa soluissa, sen jälkeen kun hoito IFN-γ (kuvio 2B). Kun transfektointi SNU-638 PML IV ekspressiovektorilla, migraatio Jurkat T-soluja kohtaan väliaine PML IV yli-ilmennetään solujen väheni verrattuna tyhjällä vektorilla (kuvio 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PML säätelee tasot sekretorisen molekyylejä tuotetaan ja vapautetaan IFN-γ-stimuloitujen mahalaukun syövän soluja, ja vaikuttaa myös kulkeutumista T- lymfosyyttien.}

menetys PML parantaa IFN-γ-induced IP-10 ilmentyminen

Chemokines, perheen kemotaksista sytokiinien, edistää migraatio kiertävien leukosyyttien /lymfosyyttien tulehduskohtiin ja vahingon. Tutkitaan onko kemokiinitasoihin vaikutti PML
perimäluokituksesta, kemokiini geenin ilmentymistä tutkittiin käyttäen ribonukleaasisuojausmäärityksestä (RPA). PML
<sup>+ /+ ja PML
- /- hiiren alkion fibroblasti (MEF) soluja inkuboitiin poissa tai läsnä IFN-γ varten 0-24 , kokonais-mRNA kerättiin eri ajankohtina, ja niille RPA. In PML
- /- MEF-solut, IP-10-mRNA: n tasot nousivat 1,5-kertainen 2 h, ja tuli merkittävästi koholla (8-kertainen), 4 h (kuvio 3A). RANTES mRNA kohoamiseen 3,2-kertainen 0,5 tuntia, ja pysyi koholla, mutta vähemmässä määrin (1,3-kertainen), 8 h jälkeinen IFN-γ hoitoa PML
- /- MEF . Muut kemokiini geenejä, mukaan lukien MIP-1, MIP-2, ja MCP-1, eivät havaittavasti ilmaistu PML
+ /+ tai PML
- /- MEF-solut (tuloksia ei ole esitetty). STAT-1 ekspressio lisääntyi altistumisen jälkeen IFN-γ molemmissa solutyypeissä, mutta ei eroa ollut selvää, kun IFN-γ tasot verrattiin toisiinsa PML
+ /+ ja PML
- /- solut. Koska transkriptio IP-10-geeni merkittävästi koholla IFN-γ-stimuloidun PML
- /- MEF, mittasimme asiaan proteiinin tasot viljelysupernatanteista PML
+ /+ ja PML
- /- MEF-solut, käyttäen entsyymi-immunologinen määritys (ELISA). Yhdenmukainen RPA tuloksia, korkeampaa IP-10-proteiinin näkyivät kunnostetussa alustassa IFN-γ-käsitelty PML
- /- MEF-solut (kuvio 3B). Lisäksi, IP-10 mRNA: n ekspression PML
siRNA-transfektoiduissa NIH3T3-solut on parantunut verrattuna kontrolli-siRNA-transfektoiduissa soluissa, seuraavat IFN-γ hoitoa (kuvio 3C). Vähentäminen ilmentyminen PML-proteiinin PML
siRNA-transfektoiduissa NIH3T3-solut varmistettiin immunoblottauksella.</sup>

alennetulla PML ilmentyminen korreloi käänteisesti IP-10-proteiinin tasot mahasyövän kudosten ja SNU- 638 solut

Seuraavaksi tutkimme suhdetta IP-10 ja PML-proteiinin ilmentymistä kehittynyt mahakarsinoo- kudosta. Cancer kudokset immunohistokemiallisesti värjättiin PML ja IP-10, ja intensiteetti IP-10 immunopositivity mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Keskimääräinen intensiteetti IP-10 oli 1,2 14 näytteissä osoittaa diffuusi positiivisuus (DP) PML, 2,2 19 esiintymät polttoväli positiivisuus (FP), ja 2,0 vuonna 16 näytettä, joissa oli täydellinen menetys (CL) PML ilmaisun ( Kuva 4A, vasen paneeli). Merkittävä nousu IP-10 ilmentyminen havaittiin näytteissä osoittaa polttoväli positiivisuus PML ( P
= 0,034), verrattuna osoittavat hajanainen positiivinen PML ilme. Lisääntyminen IP-10 ilmentyminen havaittiin, kun täydellinen menetys PML oli ilmeistä, kuin mitä havaittiin, kun PML oli hajanaisesti ilmaistuna; mutta tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Edustavia esimerkkejä vaihtelut PML-proteiinin asema, joka korreloi eri IP-10 ekspressiotasot kasvainsoluissa kehittyneistä mahakarsinoomat esitetään (kuvio 4A, oikealla). Tutkia edelleen suhdetta IP-10 ja PML-proteiinin ilmentymistä mahan sinoomasolulinjoja, IP-10-proteiinin tasot mitattiin viljelmäsupematanteista SNU-638-solut transfektoitiin joko PML
siRNA tai PML IV exression vektori. Soluja kasvatettiin ilman tai sen läsnä ollessa IFN-γ: ssa 8 tuntia, supernatantit kerättiin, ja IP-10-tasot määrällisesti siinä (ELISA-menetelmällä). IFN-γ-indusoidun IP-10: n eritystä tehostaa merkittävästi SNU-638- PML
siRNA-transfektoiduissa soluissa, verrattiin SNU-638-solut transfektoitiin ohjaus siRNA (kuvio 4B). Transfektio SNU-638 PML IV ekspressiovektorilla tukahdutetaan IFN-γ aiheuttama IP-10 eritystä (kuvio 4C). Tulokset osoittavat selvästi, että eritystä IP-10 mahalaukun syövän solujen kasvaa, kun PML ilmentyminen vähenee.

IP-10 neutralointi vähentää migraation T-solujen

SNU-638- PML
siRNA sisältävät soluja, jotka ilmentävät alhaisempia PML-proteiinin osoitti parantamiseksi uusien T-solujen ja IP-10 eritys vasteena IFN-γ (kuviot 2 ja 4), tutkimme seuraavaksi, onko lisäys IP 10 tasoa helpotti T-solujen vaeltamiseen kohti väliaine SNU-638 mahalaukun syöpäsolujen stimuloida IFN-γ. SNU-638- PML
siRNA soluja kasvatettiin läsnä ollessa tai ilman IFN-γ: ssa 8 tuntia, ja kerättiin supernatantit esikäsiteltiin anti-IP-10 neutraloivan vasta-aineen tai kontrolli-ei-spesifisiä IgG: tä 1 h, ennen aloittamista transwell määrityksessä. Neutraloivien vasta-aineiden tai IgG sisältäviä supernatantteja sijoitettiin alakammioissa, ja muuttoliike Jurkat-solujen ylhäältä alentaa kammioihin analysoitiin tarkastelemalla kerättyjä soluja alakammioissa. Sisällyttäminen IP-10-neutraloivat vasta-aineet inhiboivat Jurkat T-solujen vaeltamiseen kohti väliaine SNU-638- PML
siRNA-soluja (kuvio 5A). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​saatuja tietoja NIH3T3-solut; IP-10-neutraloiva vasta-aine inhiboi EL-4-T-solujen vaeltamiseen kohti väliaine NIH3T3- PML
siRNA-solut (kuvio 5B).

PML pudotus lisää IP-10-promoottorin aktivaation

Koska IP-10 ekspressio lisääntyi PML pudotus soluissa, me tutkia tarkemmin, onko PML-proteiinin ilmentymistä vaikuttaa IP-10-promoottorin aktiivisuutta. Hiiren IP-10-promoottori sisältää oletetun GAS-elementin välissä mukset -246 ja -238 (TTN _{5AA) (kuvio 6A). Olemme aiemmin raportoitu, että PML säätelee negatiivisesti transkriptionaalista aktiivisuutta STAT-1 [17]. Sen varmistamiseksi, PML vaikuttaa IFN-γ aiheuttama IP-10-geenin ilmentymisen kautta
mekanismin liittyy STAT-1, me eristettiin ja tuotti reportterikonstruktio joka alkaa asemassa -330 hiiren IP-10-promoottorin sisältävä oletetun GAS-elementin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. IP-10- luc
reportteri, joka sisältää GAS-elementin transfektoitiin väliaikaisesti NIH3T3-solut inkuboitiin kanssa tai ilman IFN-γ: ssa 24 tuntia, ja sen jälkeen niistä määritettiin lusiferaasiaktiivisuus. IFN-γ-indusoidun IP-10-promoottorin aktiivisuus on merkittävästi parannettu NIH3T3-soluissa, jotka on transfektoitu PML
siRNA, verrattuna soluihin, jotka saavat ohjaus siRNA (kuvio 6B). Kun transfektio NIH3T3-soluja, joilla on PML IV ekspressiovektori, IFN-γ-indusoidun IP-10-promoottorin aktivaatio oli merkittävästi tukahdutettu. Downregulation PML ilmaisun käyttämällä PML
siRNA ja yli-ilmentyminen PML PML IV ekspressiovektori todennettiin immunoblottauksella. Sen määrittämiseksi, onko estävä vaikutus PML IFN-γ-indusoidun IP-10-promoottorin aktiivisuus on tapahtunut mahalaukun syövän solulinjat, suoritimme samanlaisia ​​kokeita SNU-638 mahalaukun syöpäsoluja. Kuviot nousu ja lasku lusiferaasiaktiivisuuden SNU-638 olivat samankaltaisia ​​kuin NIH3T3-solut (kuvio 6C). Taso PML-proteiinin ilmentymistä SNU-638-solut transfektoitiin joko PML
siRNA tai PML IV ekspressiovektoriin varmistettiin immunoblottauksella (tuloksia ei ole esitetty).}

PML pudotus kasvaa IFN-γ- aiheuttama STAT-1 DNA: n sitoutumista IP-10 promoottori

vaikutus PML on IFN-γ aiheuttama STAT-1 DNA: n sitoutumista IP-10 promoottori tutkittiin tarkemmin. PML-proteiinin yli-ilmentyminen NIH3T3-soluissa, sen jälkeen kun ohimenevän transfektion kanssa PML IV ekspressiovektori, osittain tukossa IFN-γ-indusoidun STAT-1 DNA: ta sitova ja IP-10-promoottorin, mukaan lukien sekvenssi -246--238 (kuvio 7A, vertaa kaistat 3 ja 5). Kilpailu käyttäen 100-molaarisen ylimäärän leimaamatonta oligonukleotidi, joka koodaa IP-10-promoottorin kumottu kompleksin muodostumista (kaista 6). Tasot PML ja STAT-1-proteiinin ekspression kokosolulysaateista (WCL) ja missä määrin STAT-1 tyrosiinifosforylaation tumauutteita (NE) todennettiin immunoblottauksella. Hyödyntämällä NE päässä NIH3T3- PML
siRNA-solut saadaan 0,5 tunnin kuluttua IFN-γ hoitoon, vahva sitoutuminen hiiren IP-10-promoottori havaittiin (kuvio 7B, yläpaneeli, kaista 5), ​​verrattuna sitoutuminen nähty NIH3T3-ohjaus siRNA soluja (kaista 3). Samat NE altistettiin STAT-1 konsensus oligonukleotidia, ja STAT-1 DNA: n sitoutuminen oli lisääntynyt NE alkaen NIH3T3- PML
siRNA soluja (kuvio 7B, keskimmäinen paneeli, vertaa kaistat 3 ja 5). Käyttäen SNU-638 mahalaukun syövän soluja, olemme myös havainneet, että STAT-1 DNA: n sitoutumisen PML
siRNA-transfektoiduissa SNU-638-solut on parantunut verrattuna ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa, sen jälkeen kun hoito IFN-γ (kuvio 7C, vertaa kaistat 3 ja 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PML osittain estää STAT-1 sitoutumisen IP-10-promoottorin, ja että tämä vaikutus korreloi lisääntyneen IFN-γ-indusoidun IP-10-transkription puuttuessa PML.

Keskustelu

histopatologinen tutkimukset ovat osoittaneet, että tulehduksellinen microenvironment kasvaimia on ominaista läsnäolo mononukleaaristen solujen infiltraatteja, sekä tukevat strooman ja kasvaimen alueilla. Kuitenkin tarkka mekanismeja, joilla mononukleaarisolujen tunkeutuu ja on jatkuvaa kuluessa syövän kudoksissa tällä hetkellä ei täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa, tarjoamme todisteita siitä, että menetys ilmentymisen tuumorisuppressoriproteiinia, PML, edistää parantaminen lymfosyyttien tunkeutumista mahasyövässä kudokseen, kautta
sääntely IP-10 ilmentyminen.

Tutkimme funktio PML suhteen lymfosyyttien rekrytointi käyttäen ihmisen mahasyövän kudosnäytteitä, PML
<sup>+ /+ ja PML
- /- MEF, ja PML pudotus sekä NIH3T3 ja SNU-638 soluja. Saadut tiedot sekä ihmisen kudoksesta testejä ja Transvvell- muuttoliike analyysit osoittivat, että menetys PML edistää lymfosyyttiliikennettä; Näin olemme pyrkineet syntyminen että mahdollisesti selittää nämä havainnot. Osoitamme, että kasvu IP-10 tasoa syöpäsoluissa ilmentävät alhainen PML osallistuu lymfosyyttien rekrytointi. Lisäksi IP-10 neutraloiva vasta-aine inhiboi T-solujen vaeltamiseen kohti väliaine NIH3T3-fibroblastit ja SNU-638 mahalaukun syöpäsolujen in vitro
, vastaa tuloksia, useita ennen in vivo
tutkimuksissa , joka osoitti, että neutralointi IP-10 vaimentaa T-solujen rekrytointi [39], [40]. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että kasvain vaimennin, PML, säätelee IP-10 kemokiinin transkription ja lymfosyyttiliikennettä mahasyövän, moduloimalla aktiivisuus IFN-γ /STAT-1 signalointireitin.</sup>

IP-10, lymfosyytin kohdistus CXC-kemokiinin aiheuttama tyypin I ja II IFN, on tärkeä rooli lymfosyyttien rekrytointi useita tulehdustiloja [41]. IP-10 erittyy kasvainta infiltroivien immuunisolujen, ja myös kasvainsolujen ja parenkyymin soluista interferoni ja sytokiini-rikastettu mikroympäristö. TAFs keuhkosyöpään potilaiden konstitutiivisesti tuottamaan ja erittämään IP-10 [27]. Hepatosyytit infektoitiin C-hepatiittiviruksen tuottaa IP-10, ja aiheuttaa migraatio aktivoidun T-solujen maksaparenkyymi, mikä osoittaa, että IP-10-tasot korreloivat histologisia vakavuuden ja tulehdus [42]. Meidän järjestelmässä, IP-10: n eritystä havaittiin mahalaukun syövän SNU-638-solut, NIH3T3-fibroblasteissa, ja MEF-solut, vasteena IFN-γ, ja eritys parannettu puuttuessa PML-proteiinin ilmentymistä. Koska huomasimme, että ei ollut huomattavia eroja tason STAT-1 ilmentymisen ja fosforylaatio puuttuessa tai läsnä PML upon IFN-γ (kuviot 3 ja 7), lisääntynyt IFN-γ aiheuttama IP-10 transkriptio puuttuessa PML johtui lähinnä tehostetun STAT-1 DNA: n sitoutumista IP-10-promoottori. Ehdotamme, että PML-estoa STAT-1 DNA: n sitoutuminen johtaa tukahduttaminen STAT-1-riippuvainen IP-10 ilme, sopusoinnussa aiempien havaintojen [17]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnistaa mahdolliset säätelyalue PML IP-10-promoottorin, joka on otaksuttu STAT-1-sitoutumiskohdan. Lisäksi osoitamme, että PML pudotus kasvaa IFN-γ-indusoidun STAT-1 DNA: ta sitova ja IP-10-promoottorin, ja lisää IP-10-tasot ilman PML.

Lymfosyytit, neutrofiilit, makrofagit ja syöttösolut ovat olennaisimpia eniten kasvaimen infiltraattien. Tuumoriin tunkeutuvia lymfosyyttejä on tunnistettu erilaisia ​​kiinteitä syöpäkudoksissa. Kuitenkin tiettyjä toimintoja kuten solujen kasvaimia, ja tarkka molekyylitason mekanismeja lymfosyyttien rekrytointi kasvaimia, on edelleen kiistanalainen. Tilan ja toiminnallinen merkitystä CD8 ^{+ T-solujen infiltraatiota kasvaimia, ja yhdistys tällaisia ​​soluja potilaan ennusteeseen, ovat epäselviä. Munuaissolukarsinoomassa, tunkeutumisen CD8 + T-solujen, jotka liittyvät suotuisat ennusteeseen [43]. Sitä vastoin mainitut tunkeutumisen liittyy epäedullinen ennusteen nonsmall keuhkosyöpä potilaat [33]. Olemme tässä osoittavat, että PML-proteiinin ilmentymistä tuumorisoluissa korreloi käänteisesti laajuuden kanssa tunkeutumisen CD8 + T-solujen kasvaimen kudoksiin. Kun toiminto PML imusuonten hyökkäystä pidetään yhdessä yhdistyksen välillä PML ilmaisun ja epäsuotuisa ennusteen [2], on ilmeistä, että mikä tahansa suhde kliinisiä piirteitä ja laajuus CD8 + T-solujen tunkeutuminen mahalaukun syöpäpotilailla vaatii edelleen selventämiseksi.}

Nuclei normaalin mahalaukun limakalvon rauhaset, strooman kudosten ja imusolujen olivat diffuusisti immunopositiivista (kohtalainen-voimakas) PML-proteiinin ilmentymisen, kun taas PML tasot vähennetään tai se poistetaan kasvainsoluissa (kuvio 1). Tulokset tukevat ajatusta, että syöpäsolut ovat erityisiä hajoamisen mekanismit PML. Ehdotamme, että translaation jälkeiset proteasomin riippuvaa hajoamista selittää menetyksen PML-proteiinin. Toisin sanoen, hajoamista transkriptionaalisella tasolla ei ole operatiivisia [2], [44]. PML-proteiinin ilmentymistä vähennetään tai se poistetaan monissa eri syövissä, mukaan lukien eturauhasen, rinnan, keskushermoston, koolon-, keuhko-, ja mahasyövän [2], [3]. Yhdenmukaisesti näiden tulosten, havaitsimme vähemmän tai merkityksetön ilmentymistä PML edennyt mahasyöpä kudoksiin. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että syöpäsolut ilmentävät eri PML-proteiinin vaihtelevat niiden kyky houkutella lymfosyyttien kasvaimen alueilla, mikä tarjoaa lisätodiste siitä, että tällaisia ​​soluja aktiivisesti osallistua perustamisen tulehduksellinen kasvain mikroympäristöihin, kautta
PML-mekanismeilla.

NF-KB ja STAT-3 signalointi ehdotetaan palvelemaan suuria sääntelyjärjestelmiään yhdistää tulehdus syöpään [45]. IL-6, joka on NF-KB-riippuvaisia ​​inflammatorisia kasvutekijä, on välttämätöntä kehittämiseen tulehdukseen liittyvä karsinogeneesi [46]. Viimeaikaiset aihetodisteet on vahvistanut ajatusta, että IL-6 /gp130 /STAT-3 signalointi akseli toimii sekä autokriini ja paracrine vahvistus silmukan keuhkojen adenokarsinooma, multippeli myelooma, Ras-transformoidut syöpäsoluja, ja koliitti liittyvän syövän malli [47], [48], [49], [50]. PML: n on osoitettu tukahduttaa IL-6-indusoidun STAT-3: n aktiivisuuden [51], edistää apoptoosia kautta
TNF-välitteisen prosessi, ja herkistää soluja apoptoosin inhiboimalla NF-KB: n välittämä selviytymisen polku [52]. On kuitenkin vielä selvitettävä, onko menetys tuumorisuppressorigeenin PML edistää muutoksia isännän immuunivastetta tai kasvaimen mikroympäristössä, ehkä tuloksena joko immuunitutkimusohjelmasta tai immuuni paeta, moduloimalla transkriptiotekijöiden. Näin ollen olisi mielenkiintoista verrata vaikutuksia menetyksen PML-proteiinin ilmentymistä NF-KB /STAT-3 ja STAT-1 signalointi, ja onko nämä transkriptiotekijät toimivat koordinoidusti säätelemään osajoukko kemokiinit auttaa luomaan tulehduksellisten kasvaimen mikroympäristöihin.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

Ensisijainen ja ikuisti PML
<sup>+ /+ ja PML
- /- MEF otettiin talteen ja säilytettävä kuten aikaisemmin on kuvattu [53]. SNU-638 ihmisen mahalaukun carconoma solulinja Jurkat ihmisen T-solu-lymfoblastien solulinja, joka on, ja EL-4-hiiren T-lymfooma solulinjoja ylläpidettiin kuten edellä on kuvattu [2], [54].</sup>

mahakarsinoo- kudokset

yhteensä 49 mahakarsinooman parafiiniblokit saatiin 49 potilasta (29 urosta, 20 naarasta, mediaani-ikä 64 vuotta, alue 35-84), joille oli tehty kokonaan tai välisumman gastrektomia vaiheessa IV edennyt mahakarsinoomat at Mokdong Hospital, Ewha Womans University School of Medicine, Seoul, Korea vuodesta 2001 vuoteen 2007.

reagenssit ja vasta

rekombinantti hiiren ja ihmisen IFN-γ (mIFN-γ ja hIFN- γ) ja MIP-10 ja hip-10 hankittiin ProSpec (Rehovot, Israel). Vasta-aineita PML (hiiren monoklonaalinen) ja STAT-1 hankittiin Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) ja neutraloivat vasta-IP-10 hankittiin R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Vasta-aine p-Y701-STAT-1 hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet histoni, Lamin B ja PML (kaniinin polyklonaalinen) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), ja anti-tubuliinia vasta-aine hankittiin Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) .

immunohistokemia, solumäärät, ja mittaus immunoreaktiivisia alueita

Ihmisen mahasyövän kudoksia käsiteltiin immunohistokemiallista analyysiä kuten aiemmin on kuvattu [2] pienin muutoksin. Ensisijainen vasta PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), ja IP-10 (01:50; R &D Systems) käytettiin. Kaikki objektilasit vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä. Positiiviset kontrollit saatiin käyttämällä nielurisa PML-proteiinin ja CD8 ja nenänielun eriytymättömiä karsinoomat IP-10. Negatiiviset kontrollit saatiin jättämällä pois ensisijainen vasta kaikista dioja. Immunopositivity PML-proteiinin luokiteltiin hajanainen positiivisuus (ydin- immuunivaste ≥50% kasvainsolujen), polttoväli positiivisuus (in ≥10%, mutta < 50%), tai täydellinen menetys (in < 10% syöpäsoluja). Numerot CD8 immunopositiivista solujen yksi korkean tehon kentän (HPF, x40) 0,25 mm ^{2 viiden satunnaisesti valitun kasvain infiltratiivinen rajat laskettiin kullekin näytteestä, minkä jälkeen laskenta lukumäärien keskiarvon ja SD. Immunopositivity IP-10 määriteltiin sellainen ydin- tai sytoplasmista positiivinen ilmentymistä kasvainsoluissa. Määrittämiseksi ilmaistu kunkin tason dian, digitaalisia kuvia saatiin käyttämällä mikroskooppia asennettava digitaalikamera. Käyttämällä ImageJ ohjelmistot (http://rsb.info.nih.gov/ij), jokainen kuva muutettiin 8-bittinen harmaasävy ja alue tiheydet mitattiin pikseleistä alueen kohteisiin; vain pikseliä ylittää tietyn tason (> 50 intensiteetti arvo) sisällytettiin eliminoimiseksi tausta virhe.}

siRNA transfektion

NIH3T3-solut transfektoitiin ohimenevästi käyttäen Mirus transfektioreagenssia (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLoS ONE: alassäätely RPL6 siRNA Estää leviämisen ja solusyklin etenemisen of Human mahasyövän Cell Lines
• PLoS ONE: MiR-29a Estää Cell proliferaatiota ja indusoi solukierron pysähtymisen kautta alassäätely p42.3 Human mahasyövän