PLoS ONE: In vitro karakterizacija Rapid citotoksičnosti protiv raka Peptide HPRP-A2 kroz membrane Uništenje i intracelularne mehanizam protiv želučane staničnim linijama karcinoma

Sažetak pregled

U ovom istraživanju, HPRP-A2, sintetski 15 mer kationski peptid sa svim D-amino kiselina, učinkovito inhibira preživljavanje želučanih stanične linije na način ovisan o dozi. Želučani tumorske stanice ubija HPRP-A2 uključuje brzi raspad cjelovitosti membrane i unutarstaničnim putevima. Propidij jodida (PI) i laktat-dehidrogenaze (LDH) Testovi su pokazali da je jedan sat liječenje HPRP-A2 dovelo do propusnosti membrane promjenama BGC-823 stanica na način ovisan o dozi. Štoviše, HPRP-A2 inducirana apoptoza u BGC-823 stanica uključuje značajno povećanje u generaciji reaktivnih vrsta kisika (ROS), kaspaze-3, -8 i -9 aktivacija, smanjenje mitohondrijske membranskog potencijala (MMP), i staničnog ciklusa uhićenje u G1 fazi. Osim svoje inherentne citotoksičnosti, HPRP-A2 synergized snažno s doksorubicin (DOX) kako bi se poboljšala učinkovitost ubijanja želučanog tumorske stanice i n vitro
. Vjerujemo da HPRP-A2 svih D-amino kiselina može biti moćan kandidat protiv raka terapiji, naročito u kombiniranoj terapiji pregled

Izvor. Zhao J Hao X, Liu D, Huang Y, Chen Y (2015 ) In vitro pregled Karakterizacija Rapid citotoksičnosti protiv raka Peptide HPRP-A2 kroz membrane uništenje i intracelularne mehanizam protiv želučane staničnim linijama karcinoma. PLoS ONE 10 (9): e0139578. doi: 10,1371 /journal.pone.0139578 pregled

Urednik: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Sjedinjene Američke Države pregled

Primljeno: 2. srpnja 2015; Prihvaćeno: 15. rujna 2015; Objavljeno: 30. rujna 2015 pregled

Copyright: © 2015 Zhao i sur. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu pregled

Financiranje:. Ova studija je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br 81373445, YXC i broj 21442001, YBH) i zaklada Prirodoslovlje Jilin provincije (br 20150101189JC , YC i br 20140101042JC, YBH). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Tijekom proteklih desetljeća, iako se pomaci postignuti u razvoju terapija protiv raka, otpornost i nespecifičnih toksičnosti konvencionalnih lijekova još uvijek na bočicu vrat pitanja za potencijalne kliničke prakse [1-3]. Stoga, hitno je potrebno razviti nove lijekove s različitim načinima djelovanja koja može prevladati nedostatke mnogih raspoloživih lijekova. Pregled

Trenutno potencijalne primjene antitumorskih peptida (ACPs) kao terapijska sredstva za liječenje raka napredovanje privući više pozornosti nego konvencionalne kemoterapije uglavnom zbog sljedećih svojstava: (1) visoka specifičnost. Pozitivno nabijene peptidi selektivno ciljati stanice raka koje nose negativne naboje i imaju različite komponente membrane od normalnih stanica [4, 5], (2) novi način djelovanja. Moglo bi se izbjeglo uspostavilo mehanizme MDR-otpor [5-7]; (3) sinergistički antitumorski učinak s kemoterapeuticima. On je izvijestio da određeni ACPs može proizvesti sinergističko antitumornu aktivnost kada kombiniranu upotrebu s različitim konvencionalnim lijekovima protiv raka [8-10]. Pregled

Opći mehanizam peptida inducirane stanične smrti je citoplazmatski membranskog prekida putem miceliranje ili stvaranja pore iako su neke ACPs izvijestili da pokreću apoptozu puteva receptora smrti, i /ili mitohondrija, put [8, 11]. Osim toga, stvaranje pora na staničnoj membrani i promjene propusnosti membrane može osigurati bolji kanal za upis drugih lijekova protiv raka u stanicama i povećati svoje antikancerogene aktivnosti [8, 12]. Pregled

Naša prethodna studija je dokazano da HPRP-A2 može izazvati smrt stanica i istovremeno poboljšane DOX /epirubicin (EPI) koji inducira apoptozu u HeLa i HepG2 stanične linije [12]. Osim toga, s obzirom na sastav D-amino kiseline, HPRP-A2 je otporan na proteolitičko cijepanje i zadržava ekvivalent antikancerogene aktivnosti njegovim L enantiomere [6, 12]. Na temelju prethodnih studija, cilj nam je postići dva cilja u ovom istraživanju: razgraničiti temeljni antitumorski mehanizam HPRP-A2 i istražiti sinergistički antitumorski učinak na BGC-823 i SGC-7901 stanica u kombinaciji HPRP-A2 sa DOX. pregled

Materijali i metode

staničnih linija i kultura stanica pregled

Ljudski rak želuca stanične linije BGC-823 i SGC-7901 dobiveni su od American Type Culture Collection koji ovjerava stanica linije kratkom tandema testiranje ponoviti DNA korištene su unutar 6 mjeseci od reanimacije i uzgajane u DMEM s fetalnog goveđeg seruma (FBS; 10% v /v), penicilinom (100 u /ml) i streptomicin (100 u /ml) u vlažnoj atmosferi na 37 ° C s 5% CO _{2. pregled}

sinteza peptida i pročišćavanje pregled

peptid se pripraviti sintezom peptida iz čvrste faze koristeći Fmoc (9-fluorenil -methoxycar-alkiloksikarbonil) kao što je ranije opisano [13]. Daljnja karakterizacija detektirano je masenom spektrometrijom i analizom amino kiselina. DOX · HCl je kupljen od Meilun biologiju Technology Co, Ltd (Dalian, Kina). Pregled

Cell održivost testovi pregled

BGC-823 i SGC-7901 stanice (5 × 10 ^{3) su stavljene u triplikatu u mikrotitarske ploče s 96 jažica. Kompletni se medij je bio zamijenjen nakon 24 sata s 100 ul svježeg medija koji je sadržavao različite koncentracije lijekova. Nakon daljnja 24 sata, stanice se inkubira s 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolijev bromid (MTT) na 37 ° C tijekom 4 sata. Zatim dimetil sulfoksid (DMSO), je dodan da se otopi formazan kristala i apsorbancija pri 492 nm je mjerena pomoću čitača mikroposuda (GF-M3000, Gaomi Caihong Analytical Instruments Co., Shandong, Kina). Jin formula korištena je za daljnje kvantificiranje sinergijski efekt kombiniranog liječenja HPRP-A2 i DOX. Formula je: Q = Ea + b /(Ea + Eb-Ea × EB), gdje je Q indeks kombinacija; EA + b predstavlja brzinu proliferacije inhibiciju staničnog kombiniranog lijeka; Ea i Eb su znakovi brzinu proliferacije inhibiciju staničnog svakog lijeka. Nakon izračuna. Q < 0,85, P > 1,15 i 0,85 < P < 1.15 pokazuju antagonizam, sinergiju i dodatni efekt, odnosno [14] pregled, analiza}

hemolizu aktivnost Test pregled

hemolize aktivnost izvesti kao što je opisano [13]. Za dobivanje crvene krvne stanice, Svježa krv stabiliziran EDTAK se centrifugira na 1000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta, ispere se dva puta s PBS i razrijedi do konačne koncentracije od 2% u PBS. 70 ul 2% humanih eritrocita doda okruglog dna s 96 jažica, a zatim 70 uL različitih koncentracija HPRP-A2. Nakon inkubacije na 37 ° C 1 h, ploča je zatim centrifugirana na 3000 rpm tijekom 10 min i 90 ul supernatanta se prenese s ravnim dnom od 96 jažica. Oslobađanje hemoglobina određuje se mjerenjem apsorbancije supernatanta na 540 nm. Eritrocita u PBS i destiliranu vodu (dH _{2O) korišteni su kao pozitivne i negativne kontrole. Hemolitičkih aktivnosti izračunat je kao postotak pokusne skupine i pozitivnom kontrolom, nakon oduzimanja negativna kontrola. Podaci su srednje vrijednosti ± SD iz tri neovisna eksperimenta. Pregled}

PI pokus pregled

BGC-823 stanice (1 × 106 stanica /jažici) nasađene su u pločicama sa šest jamica. Nakon inkubacije s HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) tijekom 1 sata, stanice su skupljene, a zatim obrađena sa 5 ug /ml PI na 4 ° C tijekom 10 minuta u mraku. Stanice su isprane s PBS-tri puta, a zatim otkriti intenzitet fluorescencije PI pomoću protočne citometrije (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Pregled

LDH izdanje pregled

otpuštanje LDH aktivnost mjerena je LDH assay opreme (Jiancheng Bioengineering, Ltd., Kina) u skladu s uputama proizvođača. BGC-823 stanice su posađene na 5 × 10 ^{3 stanica /jažici u pločici s 96 jažica. Nakon inkubacije s HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) tijekom 1 sata, oslobađanje LDH u supernatantu izmjerena je pomoću čitača mikroposuda (GF-M3000, Gaomi Caihong Analytical Instruments Co., Ltd. Shandong, Kina) na 450 nm. Stanice bez tretmana ili lizirane sa Triton X-100 se koristi kao negativnih i pozitivnih kontrole. Svi pokusi su provedeni u triplikatu. LDH aktivnost je izračunata kao postotak pokusne skupine i pozitivnom kontrolom, nakon oduzimanja negativnih kontrola pojedinačno, pregled}

ROS Test pregled

ROS assay kit (BestBio, Co. Shanghai, Kina) je korištena za otkriti generacije ROS. Stanice (1 × 106) se tretira HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) 1 sat. Dalje se postupa se izvesti prema protokolu proizvođača. Ukratko, stanice probavljaju tripsinom su centrifugirani pri 1.500 okretaja u minuti tijekom 3 min, isprane tri puta s PBS, a zatim se suspendira u 500 ul PBS. Nakon inkubacije s 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) fluorescentne probe tijekom 20 minuta na 37 ° C, stanice su isprane s PBS-om tri puta, a otkriven zelenu intenzitet fluorescencije (u GEOMEAN) protočnom citometrijom. Zelena Intenzitet fluorescencije pozitivno korelira s razinom ROS. Pregled

Mjerenje MMP pregled

MMP određena je mitohondrijski membranskog potencijala assay opreme uz 5,5 ', 6,6'-tetrakloro -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1), što je sonda za mitohondrijsko djelovanje (BestBio, Co., Shanghai, Kina). JC-1 uvijek koristi za otkrivanje mitohondrijsku depolarizaciju pojavljuje u ranoj fazi apoptoze. Kada se stanice s visokim MMP, JC-1 okupljenih u mitohondrijske matrici tvoreći J agregate i proizvodnju crvene fluorescencije. S druge strane, stanice koje sadrže JC-1 monomera monomer monomermonomer imaju nizak MMP i pokazati zelenu fluorescenciju. Mitohondrijski depolarizacija određena je smanjenje u crvenom (590 nm, FL-2 kanal) /zeleno (530 nm, FL-1 kanal) odnos intenzitet fluorescencije. Ukratko, nakon obrade s HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) 1 sat, BGC-823 stanice su sakupljene i inkubirane s 0,5 ml JC-1 radni otopinu 20 min na 37 ° C, a zatim dva puta isprane s PBS, suspendirane u PBS-u, i analiziraju pomoću protočne citometrije (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). pregled

aktivnost kaspaze test pregled

Stanice su tretirane s HPRP-A2 (10, 15 uM) 24 sata i zatim se stupnjevi kaspaze aktivnosti mjereni su koristeći odgovarajuće djelovanje kaspaze kitova za otkrivanje (BestBio, Co., Shanghai, Kina), u skladu s uputama proizvođača. Prosječni podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD od najmanje tri neovisna pokusa. Pregled

Stanični ciklus analiza pregled

BGC-823 stanice (1 × 10 ^{6) su kultivirani na 6-dobro ploče za 24 h. Nakon indukcije HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) tijekom 24 h, distribucija stanični ciklus određena je FACScan citometru and Cell Quest softvera (FACS Calibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Svi pokusi su izvedeni trostruko. Pregled}

Statistička analiza pregled

Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± SD iz tri neovisna određivanja. Statistička značajnost razlike između skupina analizirane su t pregled -test, uz značaj prihvaćen na P izvoznici < 0,005 (*) i P izvoznici < 0,001 (**). Pregled

Rezultati pregled

Peptide i citotoksičnost pregled

Kao što je prikazano na slici 1, je 15-ostatak α-helikalni amfipatsku membranom aktivan peptid HPRP-A2 peptid se sastoji od svih D-amino kiselina. Uspoređujući selektivnu toksičnost HPRP-A2 prema želučanih stanica raka i normalnih stanica (ljudske crvene krvne stanice), lako možemo naći da je IC _{50 (koncentracija lijeka pri kojoj vijabilnost stanica je smanjen za 50% u odnosu na netretirani stanice) vrijednosti su daleko manje od minimalne koncentracije hemolitička (koncentracija lijeka koja su dovela do 20% hemolize stanica) od HPRP-A2. Ovi rezultati ukazuju da HPRP-A2 selektivno mogu ubiti stanice raka želučanog i poštedjeti normalne stanice (slike 2 i 3). Slični antitumorski aktivnosti dviju staničnih linija (BGC-823 i SGC-7901) pokazuje da je došlo do širokog spektra učinak u antitumorski djelovanja HPRP-A2. Zbog svoje membrane aktivni obilježju HPRP-A2 pokazuje antitumorski terapijski potencijal, budući da je više selektivno toksičan za stanice tumora u odnosu na normalne stanice. Pregled}

HPRP-A2 inducira povećanje propusnosti membrane

u cilju provjere promjenu propusnosti membrane nakon inkubacije s HPRP-A2, stanični unos PI i otpuštanjem LDH, i to s protočnom citometrijom i mikro ploče čitača prema BGC-823 stanicama. Kao što je prikazano na slici 4, protočnom citometrijom grafovi PI postupno pomicati prema smjeru visokog intenziteta fluorescencije na način ovisan o koncentraciji, a povećana otpuštanje LDH također je opažen u stanicama inkubiranim sa HPRP-A2. To jest, HPRP-A2 može uzrokovati štetu od stanične membrane i dovesti u poboljšanje propusnosti stanične membrane. Pregled

HPRP-A2 izazvao oštećenja mitohondrijske funkcije Netlogu

unutarstanični reaktivni kisik vrsta (ROS) oslobađanje i mitohondrijski potencijal membrane (MMP) su otkrivena s FACS da odražava mitohondrija funkciju BGC-823 stanicama in vitro pregled. Kao što je prikazano na slici 5A, citometrijska protok histogram stanica inkubiranih s povećanom koncentracijom HPRP-A2 otkriva veći intenzitet fluorescencije nakon inkubacije 1 sat. Odgovarajuće Protočna citometrična kvantitativne usporedbe intenziteta fluorescencije u GEOMEAN na tim različitim koncentracijama pokazali sličan trend, odnosno da je povećano ispuštanje ROS u BGC-823 stanice u prisutnosti HPRP-A2 bila je ovisan o koncentraciji. Slično ovisi o koncentraciji mijenja trend zabilježen je na slici 5B, omjer FL2-H /FL1-H značajno smanjena, što ukazuje na depolarizaciju MMP. Pregled

aktivaciju kaspaze i stanični ciklus analiza pregled

aktivacija kaspaze-3, -8 i 9 na HPRP-A2-induciranih stanica izmjerena je pomoću pomoću čitača mikroploče na 405 nm. Kao što je prikazano na slici 5C, kaspaze-3, -8 i -9 sve su povećana nakon obrade HPRP-A2 24 h u BGC-823 stanica, što sugerira da je indukcija apoptoze od HPRP-A2 može caspase ovisna , Kao što je prikazano na slici 6, BGC-823 stanice koje su tretirane s različitim koncentracijama HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) tijekom 24 h rezultirao je povećanjem sub-G1 i zastoja u G1 aresta. Ovi rezultati također ojačao povećanu aktivnost kaspaze-3 nakon liječenja HPRP-A2. Pregled

HPRP-A2-inducirani porast DOX citotoksičnost pregled

BGC-823 i SGC-7901 stanice su odabrani za proučiti sinergistički antitumorski učinak HPRP-A2 i kemo droga DOX. Stanice su tretirane s HPRP-A2 (6 uM) i /ili Dox (1.6 ug /ml) za 4, 24 i 48 sati. MTT testovi su korišteni za procjenu combinational antikancerogeno djelovanje na stanice. Koncentracije lijekova odabranih u ovoj studiji bili su utemeljeni na IC _{50 vrijednostima sama svaki lijek. Nije bilo očigledno citotoksičnost ili rast smanjenje kada svaki lijek je korišten sam. Nasuprot tome, kada se koriste u kombinaciji lijekova /peptid (HPRP-A2 /DOX) kod istih doza se koristi sama, kombinacija je pokazao značajnu citotoksičnost (Slika 7). Također je jasno da antikancerogeno djelovanje HPRP-A2 nije toliko pogođeno vrijeme inkubacije; Nasuprot tome, s porastom vremena inkubacije za 48 h, DOX pokazuje puno veću antitumornu aktivnost nego da se 4 sata, što ukazuje na značajno različite mehanizme djelovanja između ACP i kemoterapijskog lijeka. Prema Jin formuli, svi q (kombinacija indeks) bile su veće od 1,15, što ukazuje na to da postoje značajne sinergijske efekte između alfa-spiralni peptida HPRP-A2 i konvencionalnog lijekom protiv raka DOX u BGC-823 i SGC-7901 stanica . pregled}

Rasprava pregled

protiv raka peptidi (ACPs) nedavno dobio veliku pozornost što obećavaju kemoterapijskih agenasa koji izbjegavaju nedostatke sadašnjih lijekova. Mnoga istraživanja su potvrdili da neke sintetske i prirodne kationske peptidi imaju brz i širok spektar aktivnosti protiv raka prema tumorskim stanicama nego normalne stanice poput humanih eritrocita [4, 15]. Štoviše, ACPs također su potvrdili da imaju sposobnost da prevladaju mehanizam MDR-otpora, i sinergijske efekte u kombinaciji liječenja [11]. Pregled

HPRP-A2 ima brz i širok spektar antitumorski aktivnost, međutim, neke razlike također se javljaju u osjetljivosti HPRP-A2 različitim staničnim linijama. Na temelju različitog IC _{50 vrijednosti za HPRP-A2 u BGC-823 (8,65 ± 0,38 uM), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 uM), PC3 (21.38 ± 0.56 uM) i B16 (19.16 ± 0.38 JM ), odabrali smo BGC-823 i SGC-7901 stanica kao istraživačkih ciljeva. Osim toga, antitumorski aktivnosti HPRP-A2 prema drugim staničnim linijama karcinoma, kao što su HeLa i HepG2 objavljeni su u našem prethodnom radu [12]. Oba BGC-823 i SGC-7901 stanica spadaju u staničnim linijama želuca, dakle, odabrali smo BGC-823 kao primjer da se istraži antitumorski mehanizam HPRP-A2 In vitro pregled. Pregled}

u ovom istraživanju, pokazali smo da HPRP-A2 amfipatsku α-helikalni peptid sa značajnom aktivnošću protiv raka u BGC-823 i SGC-7901 stanične linije. Naše studije su pokazala da HPRP-A2 izložena toksičnost za rak-selektivni, uglavnom zbog toga što se da stanice raka sastoji od više anionskih fosfolipida i sadrže O-glikoziliranog mucin, što povećava negativan naboj na stanice raka površine [16, 17]. Štoviše, sve mikrovila na stanice raka mogu povećati koncentracije vezanja peptida širenjem površinu membrane i time pokazuju jači citotoksičnost protiv raka stanične membrane [11, 18]. Pregled

ACPs sposobni narušavanja stanične membrane, koje mogu uzrokuju stanična membrana promjene propusnosti. U ovom istraživanju, promjena BGC-823 stanične membrane uočeno otkrivanjem pi-propusnost i LDH izdanje. Postupnog povećanja PI permeabilizacijom i LDH izdanju su u koncentracijskim ovisna ponašanja nakon tretmana s HPRP-A2. Štoviše, HPRP-A2-izazvanu smrt stanica povezana s generacijom reaktivnih vrsta kisika, depolarizacije MMP, aktiviranjem kaspaza aktivnosti i bloka u G1 fazi staničnog ciklusa. Pregled

Osim citotoksičnost HPRP-A2, dokazali smo da bi to moglo povećati efikasnost DOX protiv BGC-823 i SGC-7901 stanicama, što je u skladu s našim prethodnim studija. U našem prethodnom istraživanju, koje smo istraživali combinational antitumorski terapiju pomoću α-spiralni peptide HPRP-A1 i HPRP-A2 s kemijskih lijekova Dox i epi u HeLa i HepG2 stanične linije [12]. Sinergija prikazan dopušta koristi od relativno niskim koncentracijama peptida i lijekova kako bi se postigla značajne antikancerogeno djelovanje In vitro pregled i in vivo pregled. Ova redukcija doze smanjuje lijeka sporedne učinke na normalne stanice i omogućuje učinkovitu apoptoze posredovane antitumorski učinak. Naše je istraživanje ima implikacije na tom HPRP-A2 može postati obećavajući antikancerogeno terapijsko sredstvo s visokim protiv raka, selektivnosti i jakog sinergističkog učinka u kombiniranoj terapiji. Naša istraživanja uglavnom pokazuju mehanizam HPRP-A2-inducirane stanične smrti, a može biti od pomoći u dizajnu kemoterapeuticima protiv staničnih linija želuca. Pregled

Zaključci pregled

HPRP-A2 pokazuje jaku antitumorsko djelovanje na BGC- 823 i SGC-7901 stanične linije i nisku toksičnost protiv ljudskih crvenih krvnih stanica. HPRP-A2 inducirana raka smrt stanica kroz obje izravnog učinka membrane razaranja i unutarstanične mehanizme, uključujući i dramatično povećanje kaspaze-3, -8 i -9 aktivacije, što je smanjenje od mitohondrijske membrane potencijal (MMP), te stvaranje ROS i zaustavljanje staničnog ciklusa u G1. Osim toga, HPRP-A2 snažno synergized s DOX kako bi se poboljšala učinkovitost ubijanje tumorskih stanica želučane in vitro pregled. Naši rezultati naglašavaju široku antitumorski potencijal HPRP-A2 i rasvijetliti njegov mehanizam djelovanja. Vjerujemo da endowing ACPs s učinkovitijim i tumor-ciljanje nekretnina će otvoriti nove načine za borbu protiv raka uspješno. Pregled

• PLoS ONE: Intra-u tumora Heterogenost HER2, FGFR2, cMET i ATM-u rak želuca: Optimiziranje personaliziranih zdravstvenih kroz inovativne patološki i statistiku Analysis
• PLoS ONE: Kvantifikacija Jod sadržaju Perigastric masnom tkivu Dual-Energy CT: nova metoda za preoperativnoj dijagnostici T4-Stage želudac Cancer