PLoS ONE: In vitro karakterisering van de Rapid cytotoxiciteit van Antikanker Peptide HPRP-A2 tot Membraan Destruction en intracellulaire mechanisme tegen maagkanker cellijnen

Samenvatting

In deze studie HPRP-A2, een synthetische 15-meer kationische peptiden met D-aminozuren, remt effectief de overleving van maag cellijnen op een dosisafhankelijke wijze. Gastric tumorcellen doden door HPRP-A2 omvat een snelle ineenstorting van het membraan integriteit en intracellulaire wegen. Propidium jodide (PI) en lactaat dehydrogenase (LDH) assays die één uur behandeling met HPRP-A2 tot membraanpermeabiliteit veranderingen van BGC-823 cellen in een dosisafhankelijke manier. Bovendien HPRP A2-geïnduceerde apoptose in BGC-823 cellen impliceert een aanzienlijke toename van de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), caspase-3, -8 en -9 activatie, een reductie van de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) en celcyclus arrestatie in G1-fase. Naast de inherente cytotoxiciteit, HPRP-A2 sterk verwoven met doxorubicine (DOX) bij de werkzaamheid van het doden gastrische tumorcellen i n vitro
verbeteren. Wij geloven dat HPRP-A2 met D-aminozuren een krachtige kandidaat antikanker therapieën kunnen, met name in combinatietherapie

Citation:. Zhao J, X Hao, Liu D, Huang Y, Chen Y (2015 ) In vitro
karakterisering van de Rapid cytotoxiciteit van Antikanker Peptide HPRP-A2 tot Membraan Destruction en intracellulaire mechanisme tegen maagkanker cellijnen. PLoS ONE 10 (9): e0139578. doi: 10.1371 /journal.pone.0139578

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 2 juli 2015; Aanvaard: 15 september 2015; Gepubliceerd: 30 september 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit onderzoek werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81373445, YXC en nr 21442001, YBH) en het Natural Science Foundation van de provincie Jilin (nr 20150101189JC , YC en nr 20140101042JC, YBH). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

afgelopen decennia, hoewel doorbraken in de ontwikkeling van kankertherapieën, weerstand en niet-specifieke toxiciteit van conventionele geneesmiddelen bereikt nog knelpunt nrs voor potentiële klinische praktijken [1-3]. Daarom is het dringend noodzakelijk om nieuwe geneesmiddelen met verschillende werkingsmechanismen die de tekortkomingen van vele beschikbare geneesmiddelen kan ondervangen ontwikkelen.

Momenteel is de mogelijke toepassingen van antikanker peptiden (ACP) als therapeutische middelen voor de behandeling van kanker progressie trekken meer aandacht dan conventionele chemotherapie vooral als gevolg van de volgende eigenschappen: (1) hoge specificiteit. De positief geladen peptiden selectief richten op kankercellen die negatieve ladingen dragen en hebben verschillende membraan componenten van normale cellen [4, 5], (2) innovatieve werking. Het kan voorkomen dat gevestigde multidrug-resistentie mechanismen [5-7]; (3) synergistisch anti-kanker effect met chemotherapeutica. Vermeld is dat bepaalde ACP synergetische activiteit tegen kanker in combinatie gebruikt met andere conventionele geneesmiddelen tegen kanker [8-10] te produceren.

De algemene mechanisme van door peptide geïnduceerde celdood celmembraan verstoring via micellering of porievorming hoewel sommige van ACP naar verluidt apoptose door dood receptor route en /of mitochondriale pathway [8, 11] te activeren. Bovendien kan de poriënvorming op de celmembraan en de verandering van de membraanpermeabiliteit beter kanaal voor de toevoeging van andere middelen tegen kanker drugs in cellen, alsook aan hun antikanker activiteiten [8, 12].

Onze eerdere studie heeft bewezen dat HPRP-A2 celdood gelijktijdig verbeterde DOX /epirubicine (EPI) geïnduceerde apoptose kan induceren in HeLa- en HepG2-cellijnen [12]. Bovendien, als gevolg van de D-aminozuursamenstelling, HPRP-A2 is bestand tegen proteolytische splitsing en behoudt gelijk antikanker activiteiten zijn L enantiomeren [6, 12]. Op basis van de eerdere studies, willen we twee doelen in dit onderzoek te volbrengen: het onderliggende kanker mechanisme van HPRP-A2 af te bakenen en de synergetische antikanker effect op BGC-823 en SGC-7901-cellen te onderzoeken in combinatie HPRP-A2 met DOX.

Materialen en Werkwijzen

cellijnen en celkweek

Human maagkanker cellijnen BGC-823 en SGC-7901 werden verkregen van de American Type Culture Collection waarin de cel verifieert lijnen door korte tandem repeat DNA testen, werden binnen 6 maanden na reanimatie en gekweekt in DMEM met foetaal runderserum (FBS, 10% v /v), penicilline (100 U /ml) en streptomycine (100 U /ml) in een vochtige atmosfeer bij 37 ° C met 5% CO _2.

peptide synthese en zuivering

het peptide werd gesynthetiseerd door vaste fase peptidesynthese met behulp van Fmoc (9-fluorenyl -methoxycar-nyl) chemie zoals eerder beschreven [13]. Verdere karakterisering werd gedetecteerd door middel van massaspectrometrie en aminozuuranalyse. DOX-HCl werd gekocht van Meilun Biologie Technology Co, Ltd (Dalian, China).

cellevensvatbaarheidsassays

BGC-823 en SGC-7901-cellen (5 x 10 ^{3) werden in drievoud uitgeplaat in 96-well microtiterplaten. Volledig medium werd vervangen na 24 uur met 100 pl vers medium dat verschillende concentraties van geneesmiddelen. Na nog eens 24 uur werden de cellen geïncubeerd met 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) bij 37 ° C gedurende 4 uur. Daarna dimethylsulfoxide (DMSO) werd toegevoegd aan de formazan kristallen en de absorptie bij 492 nm werd gemeten met een microplaat reader te (GF-M3000; Gaomi CaiHong Analytical Instruments Co, Shandong). Jin formule werd gebruikt om het synergistische effect van de combinatiebehandeling van HPRP-A2 en DOX verder kwantificeren. De formule is: Q = Ea + b /(Ea + Eb-Ea × Eb), waarin Q is de combinatie-index; Ea + b staat voor de celproliferatieve remming tarief van de gecombineerde drug; Ea en Eb zijn tekenen van de celproliferatieve remming snelheid van elk geneesmiddel. Na de berekening:. Q < 0,85, Q > 1,15 en 0,85 < Q < 1.15 geven antagonisme, synergie en additief effect, respectievelijk [14]}

Hemolyse activiteit test

Hemolyse activiteit analyse was uitgevoerd zoals eerder beschreven [13]. Om rode bloedcellen te verkrijgen, vers menselijk bloed gestabiliseerd met EDTAK werd gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten, tweemaal gewassen met PBS en verdund tot een eindconcentratie van 2% in PBS. 70 pi van 2% humane erytrocyten werden toegevoegd aan een ronde bodem 96-well plaat, gevolgd door 70 pi van verschillende concentraties van HPRP-A2. Na incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur werd de plaat vervolgens gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 10 minuten en 90 pl supernatant werd overgebracht naar een platbodem 96-well plaat. De afgifte van hemoglobine werd bepaald door de absorptie van de supernatant bij 540 nm. Erytrocyten in PBS en gedistilleerd water (dH _{2O) werden als negatieve en positieve controles, respectievelijk. De hemolytische activiteit werd berekend als het percentage van experimentele en positieve controle, na aftrek van de negatieve controle respectievelijk. Gegevens zijn het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten.}

PI test

BGC-823 cellen (1 x 106 cellen /putje) werden geënt in platen met zes putjes. Na incubatie met HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) gedurende 1 uur werden de cellen verzameld en vervolgens behandeld met 5 ug /ml PI bij 4 ° C gedurende 10 minuten in het donker. Cellen werden gewassen met PBS driemaal en detecteren dan de fluorescentie-intensiteit van PI middels flowcytometrie (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA).

LDH-afgifte

LDH-afgifte werd gemeten door LDH assay kit (Jiancheng Bioengineering, Ltd., China) volgens de instructies van de fabrikant. BGC-823 cellen werden geënt bij 5 x 10 ^{3 cellen /putje in een plaat met 96. Na incubatie met HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) gedurende 1 uur werd het vrijkomen van LDH in de supernatant gemeten met een microplaat reader (GF-M3000; Gaomi CaiHong Analytical Instruments Co., Ltd. Shandong) en 450 nm. Cellen zonder behandeling of gelyseerd met triton X-100 werd gebruikt als negatieve en positieve controles, respectievelijk. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud uitgevoerd. LDH activiteit werd berekend als het percentage experimentele en positieve controle, na aftrek van respectievelijk negatieve controle.}

ROS assay

ROS testkit (BestBio, Co. Shanghai, China) werd gebruikt om detecteren generatie van ROS. Cellen (1 x 106) werden behandeld met HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) gedurende 1 uur. De volgende procedures werden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. In het kort, cellen verteerd door trypsine werden gecentrifugeerd bij 1500 rpm gedurende 3 minuten, drie keer gewassen met PBS en vervolgens gesuspendeerd in 500 pi PBS. Na incubatie met 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetaat (DCFH-DA) fluorescente probe gedurende 20 minuten bij 37 ° C werden de cellen gewassen met PBS driemaal en merken op dat de groene fluorescentie-intensiteit (in GEOMEAN) door flowcytometrie. De groene fluorescentie-intensiteit positief gecorreleerd aan het niveau van ROS.

Meting van MMP

MMP werd bepaald door de mitochondriale membraanpotentiaal testkit met 5,5 ', 6,6'-tetrachloor -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodide (JC-1), die een sonde van mitochondriale activiteit (BestBio, Co, Shanghai, China). JC-1 wordt altijd gebruikt om mitochondriale depolarisatie zich in de vroege stadia van apoptose te detecteren. Wanneer cellen met hoge MMP, JC-1 verzameld in de mitochondriale matrix, vorming van J-aggregaten en rood fluorescentie. Omgekeerd, cellen die JC-1 monomeer monomeer monomermonomer lage MMP en toon groene fluorescentie. Mitochondriale depolarisatie werd bepaald door een afname in het rode (590 nm, FL-2 kanalen) /groen (530 nm, FL 1-kanaal) fluorescentie-intensiteit ratio. Kort na behandeling met HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) gedurende 1 h, BGC-823 cellen werden verzameld en geïncubeerd met 0,5 ml JC-1 werkoplossing gedurende 20 minuten bij 37 ° C, daarna tweemaal gewassen met PBS, gesuspendeerd in PBS en geanalyseerd door flowcytometrie (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA).

Caspase activiteit test

De cellen werden behandeld met HPRP-A2 (10, 15 uM) gedurende 24 uur en vervolgens niveaus van caspase-activiteiten werden gemeten met de overeenkomstige caspaseactiviteit detectie kits (BestBio, Co., Shanghai, China), volgens instructies van de fabrikant. Gemiddelden worden weergegeven als het gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten.

celcyclusanalyse

BGC-823 cellen (1 x 10 ^{6) werden uitgezaaid in 6-well platen gedurende 24 uur. Na inductie met HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) gedurende 24 uur werd celcyclusverdeling bepaald door een FACScan cytometer en Cell Quest software (FACS Calibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Alle experimenten werden uitgevoerd in triplo.}

Statistische analyse

De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke bepalingen. De statistische significantie van de verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van t
-test, met een significantie geaccepteerd op P
< 0.005 (*) en P
< 0.001 (**).

Resultaten

Peptide en cytotoxiciteit

Zoals weergegeven in figuur 1, peptide HPRP-A2 is een 15-residu α-helix amfipathische membraan-actief peptide samengesteld uit alle D-aminozuren. Vergelijking van de selectieve toxiciteit van HPRP-A2 richting maagkanker en normale cellen (humane rode bloedcellen), kunnen we gemakkelijk vinden dat de IC _{50 (de concentratie geneesmiddel waarbij cellevensvatbaarheid werd verminderd met 50% in vergelijking met onbehandelde cellen) waarden zijn veel minder dan de minimale hemolytische concentratie (de concentratie geneesmiddel die resulteerde in 20% cel hemolyse) van de HPRP-A2. Deze resultaten gaven aan dat HPRP-A2 selectief doden de maag kankercellen en reserveonderdelen normale cellen (figuren 2 en 3). Vertaald antikanker activiteiten van de twee cellijnen (BGC-823 en SGC-7901) gaf aan dat er een breed spectrum effect in de antikanker werking van HPRP-A2. Door de membraan-actieve kenmerk, HPRP-A2 toont de antikanker therapeutische mogelijkheden, omdat het meer selectief toxisch richting tumorcellen dan normale cellen.}

HPRP A2-geïnduceerde verhoging van de membraanpermeabiliteit

om de verandering van membraanpermeabiliteit na incubatie met HPRP-A2, de cellulaire opname van PI en extracellulaire vrijkomen van LDH verifiëren werden onderzocht met flowcytometrie en microplaatlezer richting BGC-823 cellen. Zoals getoond in figuur 4, de flowcytometrische grafieken van de PI verplaatst geleidelijk aan de richting van hoge fluorescentie-intensiteit op een concentratieafhankelijke wijze, en de verhoogde afgifte van LDH werd ook waargenomen in de cellen geïncubeerd met HPRP-A2. Dat wil zeggen, HPRP-A2 kan de schade van celmembraan veroorzaken en leiden tot de versterking van celmembraan permeabiliteit.

HPRP-A2 veroorzaakt de schade van mitochondriale functie

De intracellulaire reactieve zuurstof species (ROS) vrijkomen en mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) werden gedetecteerd met FACS naar de mitochondriën functie van BGC-823 cellen weerspiegelen in vitro
. Zoals getoond in figuur 5A, de flowcytometrische histogram van de cellen geïncubeerd met hogere concentratie HPRP-A2 geopenbaarde hogere fluorescentie-intensiteit na incubatie gedurende 1 uur. De bijbehorende flowcytometrische kwantitatieve vergelijking van fluorescentie-intensiteit in GEOMEAN deze verschillende concentraties vertoonde een soortgelijke trend, namelijk dat de verhoogde afgifte van ROS in BGC-823-cellen in de aanwezigheid van HPRP-A2 was concentratieafhankelijk. Vertaald concentratieafhankelijke veranderende trend werd ook waargenomen in figuur 5B, de verhouding van FL2-H /FL1-H aanzienlijk afgenomen, hetgeen een depolarisatie van MMP.

caspase activering en celcyclus analyse

activatie van caspase-3, -8 en -9 in HPRP-A2-geïnduceerde cellen werd gemeten met een met een microplaat reader bij 405 nm. Zoals getoond in figuur 5C, caspase-3, -8 en -9 werden alle verhoogd na behandeling met HPRP-A2 gedurende 24 h in BGC-823 cellen, hetgeen suggereert dat de inductie van apoptose door de HPRP-A2 caspase-afhankelijke kan . Zoals getoond in figuur 6, BGC-823 cellen behandeld met verschillende concentraties van HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) gedurende 24 uur resulteerde in de toename in sub-G1 arrest en G1 arrest. Deze bevindingen ook versterkt de verhoogde caspase-3-activiteit na de behandeling van HPRP-A2.

HPRP-A2-geïnduceerde toename in DOX cytotoxiciteit

BGC-823 en SGC-7901-cellen werden geselecteerd om bestuderen van de synergetische antikanker effect van HPRP-A2 en chemotherapeutische geneesmiddelen DOX. Cellen werden behandeld met HPRP-A2 (6 uM) en /of Dox (1,6 ug /ml) gedurende 4, 24 en 48 uur. MTT-assays werden gebruikt voor de combinatorische antikanker effecten op cellen te beoordelen. De geneesmiddelconcentraties gekozen in deze studie waren gebaseerd op de IC _{50 waarden van elk geneesmiddel alleen. Er was geen duidelijke cytotoxiciteit of groei korting bij elk geneesmiddel alleen werd gebruikt. Daarentegen, indien gebruikt in de peptide /geneesmiddelcombinaties (HPRP-A2 /DOX) en dezelfde doses als monotherapie, de combinatie vertoonde significante cytotoxiciteit (figuur 7). Het is ook duidelijk dat antikanker activiteit van HPRP-A2 was niet sterk beïnvloed door de incubatietijd; in tegenstelling met de toename van de incubatietijd tot 48 uur, DOX toont veel groter antikankeractiviteit dan 4 uur en geeft de dramatisch verschillende werkingsmechanismen tussen ACS- en chemotherapeutisch geneesmiddel. Volgens formule Jin, die allemaal Q (combinatie index) waarden waren groter dan 1,15, wat aangeeft dat er aanzienlijke synergistische effecten tussen de α-helische peptide HPRP-A2 en conventionele geneesmiddelen tegen kanker DOX in BGC-823 en SGC-7901-cellen .}

Discussie

tegen kanker peptiden (ACS-landen) heeft onlangs hebben veel aandacht als veelbelovende chemotherapeutische middelen die de nadelen van de huidige drugs te vermijden ontvangen. Vele studies hebben bevestigd dat een aantal natuurlijke en synthetische kationische peptiden bezitten een snelle en breed spectrum van antikanker activiteit voor tumorcellen in plaats van normale cellen zoals humane rode bloedcellen [4, 15]. Bovendien ACP's werden ook onderzocht op het vermogen om de multidrug-resistentie mechanisme overwinnen en synergistische effecten combinatietherapie [11] hebben.

HPRP-A2 bezit een snelle en breed spectrum van antikankeractiviteit echter enkele verschillen ook in de gevoeligheid van de HPRP-A2 verschillende cellijnen. Op basis van de verschillende IC _{50 waarden voor HPRP-A2 BGC-823 (8,65 ± 0,38 uM), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 uM), PC3 (21,38 ± 0,56 uM) en B16 (19,16 ± 0,38 uM ), kozen we BGC-823 en SGC-7901 cellen als research doelen. Bovendien zijn de anti-kanker activiteiten van HPRP-A2 naar andere kanker cellijnen zoals HeLa en HepG2 gepubliceerd in onze vorige document [12]. Beide BGC-823 en SGC-7901 cellen behoren tot de maag cellijnen, dus we gekozen BGC-823 als een voorbeeld voor de anti-kanker mechanisme van HPRP-A2 In vitro
.}

onderzoeken in deze studie hebben we aangetoond dat HPRP-A2 is een amfipathische α-helische peptide met significante antikanker activiteit BGC-823 en SGC-7901 cellijnen. Onze studies hebben aangetoond dat HPRP-A2 vertoonden een kanker-selectieve toxiciteit, vooral omdat kankercellen bestaan ​​uit meer anionische fosfolipiden bevatten en O-geglycosyleerd mucine, waarvan de negatieve lading op het celoppervlak kanker [16, 17] vergroot. Bovendien kan meer microvilli op kankercellen van de concentratie van bindend peptide vergroten door uitbreiding van het membraanoppervlak en daarmee sterkere cytotoxiciteit vertonen tegen kanker celmembranen [11, 18].

ACP kunnen verstoren celmembraan, die al veroorzaken celmembraan permeabiliteit veranderingen. In deze studie, de verandering van BGC-823 celmembraan waargenomen door detectie van PI-permeabilisatie en LDH-afgifte. De geleidelijke verhoging van de PI permeabilisatie en LDH-afgifte in de concentratie-afhankelijke manieren na de behandeling met HPRP-A2. Bovendien HPRP-A2-geïnduceerde celdood is geassocieerd met de productie van reactieve zuurstofsoorten, de depolarisatie van MMP, de activatie van de caspase activiteiten en het blok G1 fase van de celcyclus.

Naast de cytotoxiciteit van HPRP-A2, bewezen we dat het de werkzaamheid van DOX tegen BGC-823 en SGC-7901 cellen, hetgeen consistent is met onze vorige studie kunnen verhogen. In onze vorige studie hebben we combinatorische antikanker therapie onderzocht met behulp van α-helix peptiden HPRP-A1 en HPRP-A2 met de chemische drugs DOX en EPI in HeLa en HepG2-cellijnen [12]. De getoonde synergie maakt het gebruik van relatief lage concentraties van peptiden en drugs om significante antikanker effecten te bereiken In vitro Kopen en In vivo
. Dit minimaliseert dosisverlaging drug bijwerkingen op normale cellen en maakt een effectieve apoptose gemedieerde antikanker effect. Onze huidige studie heeft gevolgen in dat HPRP-A2 kan een veelbelovende tegen kanker therapeutisch middel met een hoge antikanker selectiviteit en sterk synergetisch effect in combinatietherapie worden. Onze studies vooral illustreren het mechanisme van HPRP-A2-geïnduceerde celdood en kunnen nuttig zijn bij het ontwerpen van chemotherapeutische middelen tegen de maag cellijnen zijn.

Conclusies

HPRP-A2 toont sterke antikanker activiteit BGC- 823 en SGC-7901 cellijnen en lage toxiciteit tegen menselijke rode bloedcellen. HPRP A2-geïnduceerde kanker celdood zowel via directe membraan-destructief effect en intracellulaire mechanismen, waaronder een dramatische toename van caspase-3, -8 en -9 activatie, een reductie van de mitochondriale membraanpotentiaal (MMP), en het genereren van ROS en celcyclus arrestatie in G1. Daarnaast HPRP-A2 sterk verwoven met DOX de effectiviteit doden gastrische tumorcellen versterken in vitro
. Onze resultaten onderstrepen de brede anti-kanker potentieel van HPRP-A2 en verhelderen zijn werkingsmechanisme. Wij zijn van mening dat de ACS-landen kennen die met een effectiever en tumor targeting eigenschappen met succes zal leiden tot nieuwe manieren om kanker te bestrijden.

• PLoS ONE: intratumorale heterogeniteit van de HER2, FGFR2, CMET en ATM bij maagkanker: het optimaliseren van gepersonaliseerde gezondheidszorg door middel van innovatieve Pathologische and Statistical…
• PLoS ONE: Kwantificering van het jodiumgehalte van Perigastric VetWeefsel door Dual-Energy CT: een nieuwe methode voor preoperatieve Diagnose van T4-Stage Gastric Cancer