LIM homeodomain transzkripciós faktor Isl1 irányítja normális pylorus fejlődését célzó Gata3

LIM homeodomain transzkripciós faktor Isl1 irányítja normális pylorus fejlődését célzó Gata3 katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa Abnormalitások a pylorus fejlesztés vagy összehúzó funkciója a pylorus oka reflux nyombél tartalmát a gyomor és növeli a gyomor metaplázia és a rák. Rendellenességei pylorus régió is kapcsolódnak veleszületett, mint a viszonylag gyakori újszülöttkori hipertrófiás pylorus stenosis, és az elsődleges duodenogastrikus reflux. Ezért a megértés pylorus fejlődés nagy klinikai jelentősége. Itt betöltött szerepét vizsgáltuk a LIM homeodomain transzkripciós faktor Isl1 a pylorus fejlődését. Katalógusa eredményei katalógusa vizsgálata Isl1 kifejezés a fejlődő egér gyomor immunhisztokémia egész szerelhető in situ hibridizáció katalógusa és a valós idejű kvantitatív PCR bizonyította hogy Isl1 erősen expresszálódik fejlődő egér gyomor, elsősorban a simaizom réteg a pylorus. Isl1 expressziót is vizsgáltuk immunfluoreszcens humán hipertrofikus pylorus stenosis, ahol a legtöbb simaizomsejtek találtuk, hogy kifejezze Isl1. Isl1 katalógusa funkció embrionális fejlődés gyomor vizsgáltuk felhasználásával tamoxifen-indukálható Isl1 katalógusa knockout egér modell. Isl1
hiányosság vezetett csaknem teljes hiánya a pylorus külső hosszanti izom réteg embrionális napon 18,5, ami összhangban van a Gata3
null egér fenotípus. A kromatin immunprecipitációs, luciferáz assay, és az elektroforetikus mobilitás eltolódását vizsgáló eljárások során kiderült, hogy Isl1 biztosítja normális pylorus fejlődés által közvetlenül megcélzó Gata3
.
Következtetések
Ez a vizsgálat azt mutatja, hogy a Isl1-Gata3
transzkripciós szabályozó tengely elengedhetetlen normál pylorus fejlődését. Ezek az eredmények nagyon klinikailag releváns, és segíthet, hogy jobban megértsék vezető pályákat pylorus betegség. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa α-simaizom aktin Gata3 Isl1 Pylorus Háttér katalógusa A gerinces bél egy figyelemre méltó szerkezet, amely beszívja és megemészti, étel, elnyeli a tápanyagok, és eltávolítja a salakanyagokat. A bél származik egy egyszerű cső alakú struktúrát, amely három csíralemezek beleértve az alatta endodermalis, a környező zsigeri mezodermából, és ectoderma [1-3]. Egér embrió, a bélben válik mintás mentén anterior-posterior, háti-hasi, bal-jobb, és radiális tengely. A bél cső áll előbél, középbél, és utóbél mentén anterior-posterior tengely [4, 5]. Ahogy fejlődés előrehaladtával, a előbél ad okot, hogy a nyelőcső, a gyomor, a máj, a tüdő és a hasnyálmirigy. A középbél képezi a vékonybélben, és a utóbél fejlődik a vastagbélbe [1, 5-8].
A gyomor származik posterior előbél. A gyomor morfológiailag megkülönbözteti a előbél cső körül embrionális napon 9,5 (E9.5) és bővítése a pregastricus mezenhimasejtek lehetővé teszi a domain a gyomor, hogy látható legyen kezdettel E10.5 [9]. Mesenchymális sejtek gyomor differenciálódnak négy különálló koncentrikus rétegeket, beleértve a lamina propria, muscularis nyálkahártya, és a körkörös és hosszanti simaizom különböző szakaszaiban az embrionális fejlődés [10]. Által E11.5, a gyomor határozottan kibővült. A gyomor simaizom különbözteti meg E13, egy külön réteg α-simaizom aktin (α-SMA) pozitív sejtek megjelenését és egy körkörös izom réteg kialakítására az egész gyomor [11]. A simaizom réteg megvastagszik a szűkített leendő pylorus záróizom régió körülbelül E14.5 [2, 9]. A E18.5, a pylorus záróizom kezd működni, hogy megakadályozzák a reflux a nyombél tartalmának a gyomorba [9].
A hátsó vagy pylorus része a gyomor az anatómiai csomópont között a gyomor és a duodenum. A terminális pylorus, a különböző szívbillentyű szárnyak a pylorus záróizom látható [2]. Normál fiziológiás körülmények között, a gyomor függ perisztaltikus összehúzódás őrölni és tolóerő a részlegesen emésztett étel, és a pylorus támaszkodik megvastagodott pylorus záróizom, hogy ellenőrizzék a áramlását élelmiszer a vékonybélbe. Abnormalitásait pylorus fejlesztés vagy a kontraktilis funkció a pylorus okozhat reflux duodenális tartalmát a gyomor és növeli a gyomor metaplázia és a rák [12, 13]. Rendellenességei pylorus kapcsolatos veleszületett [14-16]. Ezért sok figyelmet fordítani a szabályozó elemek és útvonalait gyomor fejlődés, különösen pylorus és a pylorus záróizom fejlődését.
Korábbi adatok csirke javasolta, hogy a csont morfogenetikus protein (BMP) jelátvitel szabályozza mesenchymalis kifejezése Nkx2.5 katalógusa és Sox9
, amely befolyásolja a karakter a pylorus epithelium de nincs hatással a pylorus simaizom [5, 17], ami arra utal, hogy a mesenchymalis jelátvitel által ismeretlen tényezőt befolyásolja a pylorus epiteliális fenotípust. Az egér, molekuláris mechanizmusok gyomornyílásának képződés kevéssé értett, viszonylag kevés olyan tényező szükséges a normális pylorus fejlődés miután azonosították. Azok, amelyek már tartalmazzák Sox9 katalógusa [17], Six2 katalógusa [9], Bapx1 katalógusa [18], Nkx2.5 katalógusa [3, 17], gonosz szellem katalógusa [9], és Gata3
[19, 20]. Abláció homeodomain transzkripciós faktor, Six2 katalógusa kifejezve, hátsó gyomorban, megzavarja megvastagodása a pylorus simaizom réteg és csökkenti a szűkület a pylorus záróizom. Ezen kívül, a veszteség Six2 katalógusa kiküszöböli Sox9 katalógusa kifejezés, és csökkenti Nkx2.5 katalógusa és gonosz szellem katalógusa kifejezést a pylorus, bár ez a kifejezés később visszanyeri [9], ami arra utal, hogy a Six2 katalógusa, Sox9 katalógusa, Nkx2.5 katalógusa, és gonosz szellem katalógusa szükséges pylorus fejlődését. Ezen túlmenően, Nkx2.5
, Sox9
, és Gata3
együttes kifejezve a dorzális pylorus külső hosszanti izom (OLM) réteg, amely érlelődik között E14.5 és E16.5. Következő törlését Nkx2.5 katalógusa vagy Gata3 katalógusa, a háti pylorus OLM szinte hiányzik, és szűkület a pylorus záróizom legyengített [20].
A LIM homeodomain (LIM-HD) transzkripciós faktor Isl1 eredetileg talált működni, mint egy inzulin gén enhancer-kötő fehérje [21]. Isl1 áll két tandem LIM domain és a homeodomain. A homeodomain, annak hélix-kanyar-hélix szerkezet, kötődik a szabályozó DNS-szekvenciák a megcélzott gének, míg a LIM-doménokat főként részt vesz a fehérje-fehérje kölcsönhatások, amelyek szabályozzák a tevékenység a LIM-HD [22]. Isl1 játszik kritikus szerepet sejt meghatározása, proliferációja és differenciálódása az idegrendszerben [23, 24], a szív [25], és az agyalapi mirigy [26]. Ezen túlmenően, Isl1 expresszióját kimutatták a gyomor mesenchyma [27, 28], valamint gastrointestinalis epithelium mindkét embrionális és felnőtt egerekben [29]. Ugyanakkor a szerepe Isl1 gyomor fejlődés még meg kell vizsgálni. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, Isl1 expresszióját a gyomorban. Isl1 ben erősen expresszálódik a hátsó gyomorba fejlesztés korai szakaszában és elsősorban korlátozódik a simaizom sejtek a pylorus. Annak vizsgálata Isl1 katalógusa funkciót gyomor fejlesztés, felhasználtuk a tamoxifen-indukálható knockout egér modell. Indukálható modell volt szükség, mert Isl1 - /- www.Booked.hu mutánsok die körülbelül E10.5 miatt hibák szív kialakulását. Eredményeink azt mutatják, hogy Isl1 létfontosságú megalakult a pylorus OLM réteg alatt gyomor organogenesis. Katalógusa Eredmények katalógusa Isl1 fejezik embrionális egér gyomor katalógusa Megvizsgáltuk Isl1 katalógusa mRNS szintek embrionális egér gyomor valós idejű kvantitatív PCR (RT-qPCR) és whole mount in situ hibridizáció katalógusa (Kívánság). Isl1 katalógusa mRNS-t kezdetben észlelt E11.5 RT-qPCR. Isl1 katalógusa elérte a legmagasabb szintet E13.5, majd éles csökkenése a E14.5, és nem volt jelentős változás a felnőttkorig (Plusz fájl 1: Ábra S1A). Ez az eredmény hasonló volt a korábbi jelentésben [29]. A lokalizáció Isl1 katalógusa mRNS expresszióját vizsgáltuk kívánsága. Végeztünk Isl1 katalógusa Kívánság embrionális gyomorban E11.5, E13.5, és E14.5. Abban E11.5, Isl1 katalógusa lokalizálták a hátsó fele a gyomor (Plusz fájl 1: Ábra S1B). Azonban a Isl1 katalógusa Kívánság jel sokkal erősebb volt, és lecsapódik a pylorus által E13.5 (1A). Mivel a gyomor fejlődés előrehaladtával, a pylorus továbbra kifejezni Isl1 katalógusa és kifejezése Isl1 katalógusa terjeszteni a leendő pylorus záróizom meg E14.5 (Plusz fájl 1: Ábra S1B). Azonban a Isl1 katalógusa Kívánság jel gyengült jelentősen E13.5 a E14.5. Ezek Isl1 katalógusa Kívánság eredmények egyetértett Isl1 katalógusa RT-qPCR eredmények. 1. ábra Isl1 fejezik fejlődő egér gyomorban. (A) Embrionális gyomor Kívánság elemzése kimutatta, hogy Isl1 katalógusa kifejezés volt, csak a pylorus a E13.5 (nyíl). (B) Az immunhisztokémiai festést Isl1 a gyomorban. Metszetet embriókat elrendezve rostralisan caudalis szekvenciáját E11.5 és E13.5, és Isl1 kifejezés elsősorban lokalizált mezenhimasejtek a hátsó gyomorban. A E14.5 és E18.5, Isl1 volt, nagyon kifejezett simaizom sejtek a pylorus, bár volt néhány Isl1-pozitív sejteket a lamina propria (nyílhegyek). Nagyított kép a dobozos régiók alábbi eredeti képeket. D, nyombél; Liv máj Pa, hasnyálmirigy; St, gyomor. Scale bárok képek eredeti: 100 nm; skála rudak kinagyított képek: 50 um. katalógusa Ezután értékelni Isl1 fehérje expresszióját immunhisztokémiai. Eredmények igazolták, hogy Isl1 főként lokalizálódik a hátulsó gyomor mezenhima származó E11.5 a E13.5, majd Isl1 fejeztük simaizom sejtek a pylorus (1B és további fájl 1: ábra S1C) volt, és szintén kimutatható az lamina propria (1B, nyílhegyek). A felnőtt egér gyomor, csak néhány Isl1-pozitív sejtet figyeltünk meg a simaizom réteg (Plusz fájl 1: ábra S1C).
Isl1-pozitív sejteket együtt expresszálva α-simaizom aktin embrionális egér gyomor
hogy lássuk Isl1 kifejezést kapcsolatos simaizom fejlesztés a pylorus, megvizsgáltuk expresszióját Isl1 és a legkorábbi simaizom marker α-SMA immunfluoreszcenciával. Eredmények igazolták, hogy az arány a Isl1-pozitív expresszáló sejtek α-SMA fokozatosan növekedett (2. ábra). At E11.5, nem α-SMA-pozitív sejteket, bár Isl1 ben erősen expresszálódik a mesenchyma a hátsó gyomorban. A E14.5, egy részhalmaza Isl1-pozitív sejtek, főleg a belső körkörös izom (ICM) a pylorus, voltak α-SMA pozitív. By E16.5, pylorus OLM már átesett differenciálás [20]. A E18.5, a legtöbb Isl1-pozitív sejtek a pylorus voltak α-SMA-pozitív. Isl1 kifejezés kitartott érett pylorus ICM és OLM és lamina propria sejtek is kifejezte Isl1 (Plusz fájl 1: S2 kép). Ezen túlmenően, Isl1 expresszióját vizsgáltuk humán mintákban a hipertrófiás pylorus stenosis immunfluoreszcenciával, és az eredmények igazolták, hogy Isl1 is kifejezett humán simaizom sejtek a pylorus (Plusz fájl 1: ábra S3). Ezért ezek az eredmények azt sugallják, hogy Isl1 részt vehet a kialakulását gyomornyílásának záróizom. 2. ábra Dupla immunfestés Isl1 és α-simaizom aktin egér simaizom-sejtek a dorzális pylorus. Isl1 és α-SMA ko-expressziója simaizom sejtek E11.5, E14.5, és E18.5. Sárga szaggatott vonalakkal az epithelialis membrán, fehér vastag szaggatott vonal jelzi, ICM és OLM határ, és a fehér szaggatott vonal jelzi, OLM és hasnyálmirigy határán. Red festéssel Isl1, zöld festés a-SMA, és DAPI nukleáris counterstaining (DNA) kék. α-SMA, α-simaizom aktin; ICM, belső körkörös izom; OLM, külső hosszanti izom; Pa, hasnyálmirigy; St, gyomor. Scale bárok: 50 um. Katalógusa Isl1 kifejezés ténylegesen abláció a Isl1 katalógusa MCM /F katalógusa indukálható egerek katalógusa Vizsgálni hatásait Isl1 katalógusa ablációs gyomor fejlődés, mi hasznosított Isl1
MCM /F katalógusa indukálható Cre (Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa) egerek (3A) és Isl1 katalógusa F /+ m katalógusa jég volt alkalmaztunk kontrollként [30, 31]. Az embriókat genotipizált PCR meg E18.5 (Plusz fájl 1: Ábra S4) és ép vagy mutáns Isl1 katalógusa mRNS volt megkülönböztetni szemi-kvantitatív PCR (3B). 3. ábra hatékonysága Isl1 abláció gyomor Isl1 MCM /Del mutáns egér gyomor meg E18.5. (A) A tamoxifen-indukálható Cre rekombináz kivágott DNS-szekvenciák kétoldalt két loxP katalógusa oldalakon. (B) Isl1 katalógusa RNS-szinteket abláció a Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutáns gyomor által látott szemi-kvantitatív PCR. Isl1 katalógusa F /+ m katalógusa jég mutatott 592 bázispár termék mivel Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egerek generált 303 bázispár termék. (C) Isl1 szignifikánsan down-szabályozni a fehérje szint Isl1
MCM /Del
mutáns gyomor, amint azt a Western blot. Expression of embriók E11.5 alkalmaztunk pozitív kontrollként. (D) Isl1 fehérje expresszió Isl1 katalógusa F /+ egy fiatal nd Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa embrionális pylorus. Isl1 expresszió szignifikánsan csökkent Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa embrionális gyomor, ahogy immunfluoreszcenciával. Képek Isl1
F /+ egy fiatal nd Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa feldolgozása ugyanazon a lemezen, és fényképezett ugyanazon expozíciót. Nagyított képek a dobozos területek jelennek meg a jobb oldalon az egyesült képeket. Sárga nyílhegyek mutatják képviselője Isl1-pozitív sejteket, és fehér nyílhegyek mutatják képviselője Isl1-negatív sejtek. Sárga szaggatott vonalakkal az epithelialis membrán. Scale bárok: 50 um. Katalógusa Western blot analízis azt mutatta, hogy Isl1 fehérje szint embrionális gyomrában Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egerek szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az Isl1 katalógusa F /+ m katalógusa jég (3C, ábra). Immunfluoreszcens eredmények igazolták, jelentősen csökkent Isl1 festéssel pylorus a Isl1
MCM /DEL
egerekben, a kontrollokhoz képest (ábra 3D). Ezek az adatok azt mutatják, hogy Isl1 katalógusa expressziója hatékonyan lefelé szabályozni Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutáns gyomrot.
Pylorus rendellenességek Isl1 katalógusa MCM /F katalógusa mutánsok
Annak vizsgálatára hatásait Isl1 katalógusa ablációs gyomor fejlesztés, míg a morfológiai és szövettani különbségeket Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa és Isl1 katalógusa F /+ s katalógusa tomachs a E18.5. Abban E18.5, sárga folyadék volt megfigyelhető Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa gyomor, de nem gyomor Isl1 katalógusa F /+ l katalógusa ittermates (4A, csillag) . Szövettani vizsgálat bizonyította, hogy a dorzális pylorus simaizom réteg sokkal vékonyabb a pylorus a Isl1
MCM /Del
egerekben a kontrollokhoz képest (4b ábra). Megvizsgáltuk expressziója és eloszlása ​​α-SMA mindkét Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutánsok és Isl1 katalógusa F /+ p katalógusa ylorus. Immunfluoreszcenciás eredmények igazolták, hogy Isl1 hiányosság vezetett csaknem teljes hiánya a pylorus OLM réteg E18.5, és a maradék sejteket lazán szervezett (5A, csillagok). Emellett szűkület pylorus záróizom csillapodott a Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutáns gyomor képest beszűkülés Isl1 katalógusa F /+ s katalógusa tomachs (5B ábra) . Továbbá, elemeztük kifejezése a simaizom specifikus fehérje Calponin-1 E18.5, és immunfluoreszcencia eredmények azt mutatták, hogy a veszteség Isl1 is eredményezte közelében hiányában Calponin-1 expresszió a dorzális pylorus OLM réteg, hasonló a eredményezheti az α- SMA (Plusz fájl 1: ábra S5). Sox9 fejezik mind hám mezenhimasejtek [9] és a szükséges fejlesztés OLM és kialakulásának gyomornyílásának záróizom szűkület [20]. A immunfluoreszcens eredmények azt mutatták, hogy a Sox9 maradtak normális szinten a gyomorban hámjában Isl1
MCM /Del
egereknek E14.5 és E18.5 (6. ábra, nyílhegyek), de a terület gyomornyílásának simaizom kifejező Sox9 szignifikánsan csökkent a Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutánsok E14.5 (6A, csillag) és hiányzik a E18.5 (6B, csillagok). Így Isl1 katalógusa volt szükség Sox9 katalógusa kifejezést háti pylorus OLM sejteket. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy Isl1 kritikus a szabályozására fejlődését egér pylorus sima izom. 4. ábra morfológiai és szövettani elváltozások fejlődő gyomrában Isl1 MCM /Del mutánsok. (A) A bruttó és mikroszkópos bizonyíték gyomor hibák Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egerekben. Whole mount nézeteket E18.5 a Isl1 katalógusa F /+ egy fiatal nd Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egér gyomor. Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutáns gyomor hiányzott a funkcionális pylorus záróizom (nyílhegy), ami lehetővé teszi a folyadék reflux megfigyelt mutáns embriók. Sárga folyadék jelöli csillag. (B) hematoxilin és eozin-festés a Isl1 katalógusa F /+ egy fiatal nd Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egér pylorus a E18.5. A dorsalis pylorus simaizom (fekete dobozos régió) volt kiemelkedő a Isl1 katalógusa F /+ e katalógusa mbryos, de sokkal vékonyabb Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa embriók. A fennmaradó pylorus volt szövettanilag normális. Zöld szaggatott vonalakkal az epithelialis membrán. Nagyított kép a dobozos régiók alább láthatók az eredeti fotók. Scale bárok eredeti képpel: 200 nm; skála rudak kinagyított képek: 50 um. H &E, hematoxilin-eozin.
5. ábra elvesztése Isl1 megbontja kialakulását a dorzális pylorus külső hosszanti izom. (A) Immunfluoreszcenciás a Isl1 és α-SMA Isl1 katalógusa F /+ egy fiatal nd Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa embrionális pylorus a E18.5. Elvesztése Isl1 eredményezett csaknem teljes elvesztését α-SMA-pozitív sejtek a dorzális pylorus OLM (csillagok). Sárga szaggatott vonalakkal az epithelialis membrán és a fehér szaggatott vonal jelzi, ICM és OLM határán. Red festéssel Isl1, zöld festés a-SMA, és DAPI nukleáris counterstaining (DNA) kék. Scale bárok: 50 um. (B) α-SMA immunfluoreszcenciás Isl1 katalógusa F /+ egy fiatal nd Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa embrionális pylorus a E18.5. Összehasonlítva Isl1 katalógusa F /+ e katalógusa mbryos, a pylorus záróizom szűkület szélesebb volt Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa állatokat. Záróizom szűkület méréseket láthatók. Sárga sávok elhatárolják a pylorus és jelölje ki a különbség mutatkozna közötti szélesség Isl1 katalógusa F /+ egy fiatal nd Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mintákat. Az adatok átlag ± SEM (n
= 6 egér csoportonként), * P
< 0,05 (Student-féle t
próba). Scale bárok: 50 um. α-SMA, α-simaizom aktin; ICM, belső körkörös izom; OLM, külső hosszanti izom.
6. ábra elvesztése Isl1 megszünteti a háti pylorus külső hosszanti izom Sox9 kifejezést. (A) Kettős immunfestés Isl1 és Sox9 háti pylorus a E14.5. Hiányában Isl1, a domain a mezodermális sejtek (csillag) expresszáló Sox9 kisebb volt. (B) Kettős immunfestés Isl1 és Sox9 háti pylorus a E18.5. Indukálható Isl1 kieséses ténylegesen megszűnt Isl1 kifejezés egyidejű elvesztése Sox9 kifejezés háti OLM sejtek (csillag). Sox9 expresszióját normális volt a gyomor nyálkahártya mindkét szinten (nyílhegyek). Sárga szaggatott vonalakkal az epithelialis membrán és a fehér szaggatott vonalak külön ICM és OLM. Red festéssel Isl1, zöld festéssel Sox9, és DAPI nukleáris counterstaining (DNA) kék. Scale bárok: 50 um. ICM, belső körkörös izom; OLM, külső hosszanti izom. Katalógusa Expression és forgalmazása protein gén termék 9.5 (PGP9,5), egy enterális idegrendszer marker [32], sem változott a E18.5 a Isl1 katalógusa MCM /Del
mutáns gyomor (Plusz fájl 1: ábra S6). Hasnyálmirigy- és duodenális homeobox-gén 1 (Pdx1) van kifejezve hámsejtjeiben az antrális pylorus szegmens és a rostralis nyombél [33]. A immunfluoreszcens eredmények azt mutatták, hogy Pdx1 kifejezés hasonló volt Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egerek képest ellenőrzések E18.5 (Plusz fájl 1: Ábra S7). Ezen túlmenően, az egér gyomor és a nyombél epiteliális határvonal között alakult E14.5 és E16.5 [34], ez az időszak egybeesik fejlődés a OLM réteg [20]. Megvizsgáltuk a integritását a gyomorban vékonybél epithel pylorus határt E18.5 vizsgálatával kifejezése egy bél-specifikus epithelialis marker Cdx2 [19]. A immunhisztokémiai eredmények igazolták, hogy a helyzet a hámsejtek pylorus határ Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egerekben hasonló volt a kontroll (Plusz fájl 1: Ábra S8). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a veszteség Isl1 nem befolyásolja beidegzés vagy epiteliális fejlődését a pylorus.
Elvesztése Isl1 nem befolyásolja proliferációját vagy apoptózis gyomornyílásának belső körkörös izom és külső hosszanti izomsejtek
látni, hogy Isl1 expresszió volt kapcsolódó a sejtproliferáció a pylorus, megvizsgáltuk ko-lokalizációja Isl1 és a proliferatív marker bróm-dezoxiuridin (BrdU) alkalmazásával immunfluoreszcens Isl1
F /+ m
jég. Eredményeink azt mutatták, hogy a BrdU-pozitív sejtek sűrű a E11.5 és szétszóródtak az ICM és OLM régiók E14.5 és E18.5 (Plusz fájl 1: Ábra S9A). Ezen kívül ez az arány az osztódó ICM és OLM sejtek nem volt szignifikáns különbség a két Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa és Isl1 katalógusa F /+ m katalógusa jég E18.5 ( Kiegészítő fájl 1: ábra S9b).
, hogy értékeljék a lehetséges hatása az apoptózis, megvizsgáltuk hasított kaszpáz 3 expresszió E18.5, és a mi immunofluoreszcens eredmények azt mutatták, nem voltak kaszpáz 3-pozitív sejtek pylorus ICM vagy a OLM réteg a Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa és Isl1 katalógusa F /+ m katalógusa jég (Plusz fájl 1: ábra S10). Ezek az adatok azt jelzik, hogy Isl1 ablációs nem befolyásolja proliferációját vagy apoptózis gyomornyílásának ICM és OLM sejteket.
Elvesztése Isl1 eredményezi csökkent expressziója Gata3 katalógusa, Gremlin
, és Nkx2.5
Mivel a számok tényező, többek között Bapx1
[18], Barx1
[35], Gata3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] és Six2 katalógusa [9] számoltak be kell vonni a szabályozás gyomornyílásának fejlődés hatását vizsgáltuk elvesztésének Isl1 az ilyen gének expressziójának a E14.5 és E18.5. RT-qPCR eredmények azt mutatták, hogy a veszteség Isl1 katalógusa nem befolyásolja kifejezése Bapx1 katalógusa vagy Barx1 katalógusa bármelyik E14.5 vagy E18.5 (7A ábra, B). Abban E18.5, α-SMA katalógusa és Six2 katalógusa mRNS szintje szignifikánsan alacsonyabb Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egerekben a kontrollokhoz képest (7B ábra). Mindkét E14.5 és E18.5, Nkx2.5
, Gata3
, és Gremlin
mRNS szintek a gyomorban a Isl1
MCM /Del
egerekben alacsonyabb volt, mint kontrollok (7a ábra, B). Gata3 katalógusa mRNS szintje mintegy 70% -kal csökkent mindkét szakaszában vizsgált (7A ábra, B). Ezen eredmények alapján azt vizsgáltuk, Isl1 katalógusa, Gata3 katalógusa, gonosz szellem katalógusa, és Nkx2.5 katalógusa kifejezést Isl1 katalógusa MCM /F katalógusa mutáns és Isl1 katalógusa F /+ s katalógusa tomachs segítségével kívánsága. Eredmények igazolták, hogy expressziója minden egyes ilyen gének elsősorban korlátozódik a pylorus régió, amint az várható; Gata3 katalógusa expresszió nagyobb mértékben csökkent a mutáns gyomor; és gonosz szellem katalógusa és Nkx2.5
csak volt finom változások (7E ábra, F). Isl1 katalógusa és Gata3 katalógusa kifejezés volt a legerősebben érintett (ábra 7C, D). Ezek az eredmények összhangban voltak RT-qPCR adatok és arra utalnak, hogy Isl1 expresszióját szabályozza Gata3 katalógusa, gonosz szellem katalógusa, és Nkx2.5 katalógusa. 7. ábra aberráns génexpresszió hindstomach a Isl1 MCM /Del mutánsok. (A) RT-qPCR elemzése mRNS szintje hindstomach dúsított transzkripciós faktorokat E14.5 jelzi jelentős csökkenését α-SMA katalógusa, Six2 Nkx2.5 katalógusa, Gata3 katalógusa, és gonosz szellem katalógusa mRNS a Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutáns gyomor (n katalógusa = 4). Minden eredményt normalizált szintje GAPDH katalógusa mRNS. (B) RT-qPCR elemzése mRNS szintje hindstomach dúsított transzkripciós faktorok a E18.5 jelzi, jelentős csökkentését Nkx2.5 katalógusa, Gata3
, és Gremlin
mRNS Isl1
MCM /Del katalógusa mutáns gyomor (n katalógusa = 4). Minden eredményt normalizált szintje GAPDH katalógusa mRNS. Az adatok átlag ± SEM (n = 6
egér csoportonként). * P katalógusa < 0,05 versus Isl1 katalógusa F /+ katalógusa; ** P katalógusa < 0,01 versus Isl1 katalógusa F /+ katalógusa (Student-féle t katalógusa próba). (CF) Kívánság mRNS elemzés megerősítette elvesztése Isl1 katalógusa, Gata3 katalógusa, gonosz szellem katalógusa, és Nkx2.5 katalógusa mRNS expressziót E14.5 a Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa mutáns gyomor. Isl1 katalógusa és Gata3 katalógusa mRNS súlyosan lefelé szabályozni Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa egerekben, míg a gonosz szellem katalógusa és Nkx2.5 katalógusa kifejezés kissé csökkent. A nyilak a pylorus záróizom.
Isl1 célozza Gata3 katalógusa, és aktiválja a transzkripcióját
Gata3
szelektíven expresszálódik a pylorus a fejlődő egér embrió [19, 20]. Expressziója mindkét Isl1
és Gata3
mRNS-t figyeltünk meg a pylorus at E14.5, hanem az, hogy Gata3 és Isl1 vannak kifejezve azonos sejtekben még nem vizsgálták meg. Ezért megvizsgáltuk kifejezése Isl1 és Gata3 immunfluoreszcens analízissel. Eredmények igazolták, hogy Isl1 és Gata3 fehérjéket ko-expresszált belül ugyanazon sejtek a pylorus a E14.5 és E18.5 a Isl1
F /+ C
ontrol gyomor (8. ábra). Ezen túlmenően, a terület expresszáló Gata3 szignifikánsan kisebb volt Isl1
MCM /Del
mutáns pylorus simaizom réteg E14.5 (8a ábra), és ez is veszett E18.5 a pylorus OLM réteg (8b ábra). Így Isl1 katalógusa volt szükség Gata3 katalógusa kifejezést a háti pylorus OLM réteg. Annak vizsgálatára, hogy Isl1 szabályozza pylorus fejlődését közvetlenül szabályozzák Gata3 katalógusa végeztünk bioinformatikai elemzése Gata3 genomi lokusz. Az egér Gata3
gén tartalmaz számos feltételezett Isl1 válasz elemeket (ATTA /Taat) ba -2832 bázispár (bp) a 1002 bp-re a transzkripciós iniciációs hely [37]. Azonosítottunk 10 területeken, amelyek tartalmaztak egy feltételezett Isl1 kötőhely (9A ábra), és a 10 pár megfelelő primereket terveztünk amplifikálására ezek a régiók a következő kromatin immunprecipitációt (chip) tanulmányok felhasználásával antitest Isl1. Immunprecipitált genomiális DNS-t nyert pylorus régióiban egérembriók E14.5. A 10 feltételezett Isl1 kötelező területeken, két különálló régiókban, a -2558 bp -2303 bp (P1 régió) és -1081 bp -855 bp (P6 régió), megszálltak Isl1 fehérje. Ez az eredmény megerősítette félkvantitatív PCR (9B ábra), és a hajtás dúsítási módszerrel (ábra 9c). 8. ábra elvesztése Isl1 megszünteti a háti pylorus külső hosszanti izom Gata3 kifejezést. (A) Kettős immunfestés Isl1 és Gata3 háti pylorus a E14.5. A régió mesodermalis sejtek (csillag) kifejező Gata3 kisebb volt a Isl1 katalógusa MCM /Del katalógusa pylorus mint Isl1 katalógusa Fl + katalógusa. (B) Kettős immunfestés Isl1 és Gata3 háti pylorus a E18.5. Indukálható Isl1 kieséses ténylegesen megszűnt Isl1 kifejezés egyidejű elvesztése Gata3 kifejezés háti OLM sejtek (csillag). Sárga szaggatott vonalakkal az epithelialis membrán és a fehér szaggatott vonal jelzi, az ICM és OLM határán. Fehér nyílhegy jelzi a nem-specifikus foltot. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• A ritka oka a gyomor-bélrendszeri phytobezoars: Diospyros lotus
• A transzkripciós faktor FOXO4 le szabályozott és gátolja a tumor proliferációját és metasztázis gyomorrák