PLoS ONE: Affinity Maturazione di anticorpo monoclonale 1E11 dalla randomizzazione mirata in CDR3 regioni ottimizza anticorpo terapeutico Targeting di HER2-positivo gastrico Cancer

Estratto
attività anti-tumorale

Anti-HER2 murino anticorpo monoclonale 1E11 ha una forte e sinergico in HER2-overexpressing cellule di cancro gastrico quando usato in combinazione con trastuzumab. Noi attualmente ottimizzato per questo anticorpo umana terapeutica. In primo luogo, le regioni complementarità determinazione (CDR) dell'anticorpo murino sono state innestate su geni variabili germinale immunoglobulina umana. è stata osservata alcuna differenza di affinità e l'attività biologica tra chimerico 1E11 (ch1E11) e 1E11 umanizzato (hz1E11). Successivamente, la maturazione di affinità di hz1E11 è stata eseguita dalla randomizzazione dei residui di CDR-L3 e H3 seguita da selezione biopanning rigorosi. Milder pressione selettiva favorito la selezione di più diversi cloni, considerando maggiore selezione stringenza comportato la convergenza dell'uscita panning per un numero minore di cloni con una migliore affinità. Clone 1A12 aveva quattro aminoacidi sostituzioni nel CDR-L3, e ha mostrato un aumento di 10 volte in affinità rispetto al clone dei genitori e ha aumentato la potenza in un in vitro
anti-proliferativa saggio di attività con cancro gastrico HER2-overepxressing cellule. Clone 1A12 inibito la crescita tumorale del modello di xenotrapianto NCI-N87 con efficacia simile al solo trastuzumab, e il trattamento di combinazione di 1A12 e trastuzumab completamente rimosso i tumori stabiliti. Questi risultati suggeriscono che umanizzato e l'affinità maturata anticorpo monoclonale 1A12 è una molecola altamente ottimizzato per il futuro sviluppo terapeutico contro i tumori HER2-positivi

Visto:. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) Affinity Maturazione di anticorpo monoclonale 1E11 dalla randomizzazione mirata in CDR3 regioni Ottimizza terapeutico degli anticorpi Targeting di HER2-positivo il cancro gastrico. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10.1371 /journal.pone.0134600

Editor: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, Stati Uniti |

Ricevuto: 14 Aprile, 2015; Accettato: 12 Luglio 2015; Pubblicato: 30 luglio 2015

Copyright: © 2015 Ko et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

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Finanziamento:. Questo studio è stato sostenuto da AbClon Inc., e dalla Fondazione nazionale delle Ricerche di Corea (NRF) concessione di HS per i medicinali Bioconvergence Research center (NRF-2013M3A6A4044991) . Il finanziatore commerciale (AbClon Inc.) fornito sostegno sotto forma di stipendi per gli autori (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, e JSL), ma non ha avuto alcun ruolo aggiuntivo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. I ruoli specifici di questi autori sono articolati nella sezione 'autore contributi'

Conflitto di interessi:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, e JSL sono tutti impiegati da AbClon Inc. e può possedere la sua azione. HS è sulla consulenza a pagamento per AbClon Inc. e possiede anche la sua scorta. Abclon sta perseguendo brevetti e lo sviluppo del prodotto sui composti che sono menzionati in questo documento. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, e JSL sono tutti attualmente impiegati dal finanziatore commerciale di questa ricerca AbClon Inc. e possono possedere la sua scorta. HS è attualmente pagato consulenza per AbClon Inc. e possiede anche la sua scorta. AbClon ha un brevetto registrato in Corea (KR10-1453462, anticorpi in grado di legarsi specificamente per HER2) e ha presentato una domanda PCT (PCT /KR2014 /004.317, anticorpo specifico legame con HER2), in cui BKK, YHL, ISH, KTK, e JSL sono elencati come inventori. AbClon sta anche portando avanti lo sviluppo del prodotto sui anticorpi umanizzati, affinità stagionatura che sono menzionati in questo documento. Questi non alterano l'aderenza degli autori a tutte le politiche PLoS ONE su dati e la condivisione di materiale.

Introduzione

Gli anticorpi monoclonali sono trattamenti tradizionali in oncologia e le malattie autoimmuni, e sono destinati a svolgere un ruolo importante nel futuro del trattamento della malattia [1, 2]. Più di 30 anticorpi ricombinanti sono attualmente approvati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration, di cui circa la metà sono gli anticorpi anti-cancro. il cancro gastrico è uno dei tumori più comuni ed è la terza causa di morte per cancro in tutto il mondo [3]. Nel cancro gastrico, la sovraespressione del fattore di crescita epidermico (EGFR), fattore di crescita epidermico umano del recettore 2 (HER2) e HER3 è correlato con prognosi infausta [4, 5]. Recentemente, l'HER2 mira monoclonale trastuzumab anticorpo è stato approvato per il trattamento del carcinoma metastatico giunzione gastrico e gastroesofageo HER2-positivo sulla base dei risultati del Trastuzumab con la chemioterapia in avanzato studio clinico di HER2-positivo cancro gastrico (ToGA) [6].

particolari combinazioni di anticorpi reciprocamente non competitive di targeting l'attività anti-tumorale stesso aumento del recettore in vitro
e in vivo
. Combinazione di HER2 mira anticorpi, trastuzumab e pertuzumab, mostra maggiore efficacia in tumori al seno HER2-sovraesprimenti [7]. I benefici della combinazione pertuzumab e trastuzumab sono stati ulteriormente dimostrato in studi preclinici e clinici [8, 9]. Altri anticorpi HER2-targeting che mostrano una migliore efficacia in combinazione di agenti come singoli, e hanno dimostrato coerente down-regolazione dei livelli di HER2 e effetti combinati benefici in modelli di topo [10]. La maggiore efficacia di combinazioni di anticorpi è stata dimostrata anche con anticorpi EGFR-targeting [11, 12] e fattore di crescita vascolare endoteliale recettore 3 (VEGFR3) anticorpi -targeting [13].

anticorpi terapeutici in genere sono ampiamente progettati per possedere proprietà biologiche e chimico-fisiche desiderabili, come la bassa immunogenicità, elevata affinità e specificità, funzioni effettrici ottimali, e buona solubilità e stabilità [14]. Soprattutto, anticorpi umanizzazione ed affinità maturazione sono due dei processi di progettazione più applicati frequentemente durante lo sviluppo dei candidati anticorpi terapeutici. Immunogenicità di anticorpo terapeutico limita l'utilità clinica e l'efficacia per la produzione di anticorpi anti-droga [15], e l'umanizzazione degli anticorpi da mouse o altre specie è ormai una procedura standard per lo sviluppo di anticorpi terapeutici. Alcuni metodi di umanizzazione sono stati sviluppati che impiegano metodi o razionali o empirici [16]. La regione determinanti la complementarietà (CDR) innestando approccio come un metodo per superare la risposta anticorpale anti-chimerici (HACA) [17] è un metodo umanizzazione consolidata. Tuttavia, l'innesto diretto del CDR murine su un quadro sequenza accettore umano spesso si traduce in una perdita di affinità, in modo di back-mutazioni di regione quadro residui (residui di zona Vernier) che sostengono la struttura del CDR loop è spesso necessario [18]. Per in vitro
affinità maturazione, tre approcci di diversificazione sono tipicamente utilizzati: mutagenesi casuale per esempio error-prone PCR, la randomizzazione dei residui mirati utilizzando oligonucleotidi degenerati, e la catena rimescolamento. Nell'approccio randomizzazione mirato, CDR sono il bersaglio logico per la randomizzazione, nella maggior parte dei casi a causa mutazione somatica si è evoluto per favorire mutazioni CDR di anticorpi [19], e CDR-H3 e CDR-L3 tendono a dominare l'interazione antigene-anticorpo [ ,,,0],20]. Uno dei principali problemi connessi con la randomizzazione mirata sta selezionando le posizioni che non sono essenziali per il legame dell'antigene, ma che può migliorare l'affinità quando viene fatta la sostituzione ottimale di aminoacidi. scansione alanina può aiutare a determinare i residui di casuale, soprattutto quando CDR sono lunghi. A volte, la mutazione alanina si aumenta l'affinità di anticorpi [21].

Abbiamo precedentemente sviluppato un anticorpo murino mira HER2 (clone 1E11) che mostra attività antitumorale sinergico in combinazione con trastuzumab in iperespressione di HER2 linee di cellule di cancro gastrico [22 ]. In questo rapporto, descriviamo come abbiamo ottimizzato il 1E11 per un anticorpo terapeutico da CDR innesto di linea germinale immunoglobulina umana geni variabili e affinità maturazione attraverso randomizzazione mirata di CDR-H3 e CDR-L3. L'anticorpo 1E11 ottimizzata (clone 1A12) mostra attività antitumorale sinergica nei modelli tumorali da xenotrapianto gastrico HER2-positivo in combinazione con trastuzumab. È stato osservato che per la 1E11 clone, geni variabili germinali umane sono accettori adatti per umanizzazione senza riduzione affinità, e la sostituzione di residui CDR-L3 che non sono essenziali per il legame antigene è stato sufficiente a migliorare l'affinità di oltre 10 volte.

materiali e Metodi

linee cellulari e materiali

cellule NCI-N87 sono stati acquistati dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) e OE-19 cellule sono stati ottenuti dalla Collezione europea della cultura cellulare (ECACC, Porton Down, Regno Unito). Il terreno di coltura cellulare era RPMI-1640 supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS), e antibiotici e le cellule sono state coltivate a 37 ° C sotto 5% di CO _{2. Trastuzumab e palivizumab è stato prodotto da Genentech (South San Francisco, CA, USA) e MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), rispettivamente. ChromPure IgG umane (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) è stato utilizzato come anticorpo di controllo IgG umane per in vitro
saggi. anticorpi IgG sono state prodotte utilizzando il sistema Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e purificato utilizzando la proteina-A cromatografia di affinità (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotossine è stato rimosso con un kit di endotossina rimozione (GenScript, Piscataway, NJ, USA), e livelli di endotossine sono stati determinati utilizzando un Detection Kit endotossina (GenScript). proteine ​​ricombinanti sono state prodotte come proteine ​​secrete utilizzando il sistema Freestyle 293 e purificato utilizzando la proteina-A o Ni-NTA cromatografia (Qiagen, Valencia, CA, USA) per Fc-tag o His-tagged proteine, rispettivamente.}

mutagenesi alanina-scansione e Fab purificazione

mutagenesi sito-diretta per la scansione alanina è stata effettuata mediante PCR mutagenesi utilizzando QuickChange mutagenesi sito-diretta kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). proteine ​​Fab mutanti sono stati espressi e purificati per valutare l'importanza di ogni residuo per l'antigene attività di legame. In breve, Escherichia coli
cellule DH5α trasformate con il vettore pComb3X ospitare geni Fab mutanti sono state coltivate a 28 ° C in brodo SB. Expression è stata indotta con 1 mM isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside quando la densità ottica (600 nm) della coltura ha raggiunto 0,8. pellet cellulari sono stati risospesi in tampone di estrazione refrigerate (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA, e 300 mM saccarosio) e incubate in ghiaccio per 30 minuti per l'estrazione periplasmic. Magnesio cloruro (2,5 mM) è stato aggiunto all'estratto chiarito dopo centrifugazione per pulire EDTA libera prima immobilizzato ione metallico cromatografia di affinità (IMAC) purificazione. Purificati proteine ​​Fab sono stati utilizzati per ELISA saggio di legame e k
_{off analisi utilizzando risonanza plasmonica di superficie (SPR).}

Affinity maturazione

umanizzato 1E11 clonato nel vettore pComb3X come formato Fab è stato utilizzato come modello per l'estensione sovrapposizione reazione a catena della polimerasi (PCR) mutagenesi come descritto in precedenza [23]. Gli oligonucleotidi degenerati (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(indietro) e 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Avanti) sono stati utilizzati per L-NNK e H-XXS biblioteca, rispettivamente. N denota A, C, G o T; M è C o A; e S è G o posizioni base C. numerati indicano nucleotidi a mano misto composto da 70% di una base e il 10% ciascuno degli altri tre basi: 70% frequenza base è G, A, T, e C per 1, 2, 3 e 4, rispettivamente. Per la libreria H-2AA, una miscela equimolare dei seguenti oligonucleotidi avanti mutageni sono stati usati: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 'e 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K denota G o T. Dopo due turni di estensione sovrapposizione PCR, Fab DNA biblioteca un CDR randomizzato è stato tagliato con Street Fighter II, legatura nel vettore fagemide SFII digerito pComb3X, e elettroporate in E
. coli ceppo
ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

Alte leganti affinità sono stati selezionati utilizzando solubile biotinilato proteina HER2-ECD. leganti branello stati pre-esaurite incubando la libreria fagica anticorpale con 100 ml di pre-bloccato Dynabeads M-280 streptavidina (Invitrogen) per 1 ora con lenta rotazione a temperatura ambiente. Biotinilato HER2-ECD proteine ​​(100 Nm- 12:01) è stato aggiunto alla libreria pre-impoverito anticorpi e incubate per 1 ora con rotazione a temperatura ambiente. Poi, sono stati aggiunti ed incubati sul rotatore per 15 minuti 50 ml di perline streptavidina-magnetica bloccati. Beads sono stati lavati per 10 volte con 1 ml di Tris-buffered saline-Tween 20 (TBST) e due volte con 1 ml di PBS. fagi legati sono stati eluiti incubando le perline con 1 ml di 100 mm trietilammina per 8 minuti, poi neutralizzato con 0,5 ml di 1 M Tris, pH 7,4.

ELISA attività di legame prova

Gli anticorpi sono stati aggiunti a Costar piastre a 96 pozzetti la metà dell'area (Corning, Corning, NY, USA prodotto N. 3690) rivestiti con 1 mg /mL di antigene. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 1 ora, le piastre sono state lavate tre volte con TBST ed incubate con coniglio perossidasi anti-umano di anticorpi-rafano (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) per gli anticorpi IgG e di ratto anti-HA-HRP (Clone F10, Roche life Science, Basilea, Svizzera) per gli anticorpi Fab, rispettivamente. Le piastre sono state lavate tre volte, tetrametilbenzidina (TMB) substrato perossidasi (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) è stato aggiunto e le reazioni sono stati fermati con l'aggiunta di 1 N acido solforico (DukSan, Ansan, Corea). Assorbanza a 450 nm è stata misurata con uno strumento Victor X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

risonanza plasmonica di superficie analisi

per k
_{off analisi di proteine ​​Fab, HER2-ECD-His proteina era immobilizzato sulla superficie di un chip sensore CM5 (GE Healthcare) utilizzando il metodo di accoppiamento di ammina di circa 2.000 unità di risposta (RU). Purificata proteine ​​Fab sono stati iniettati a 2 mg di concentrazione /mL ed una portata di 50 ml /minuto. Per k
off analisi degli anticorpi IgG, capra anti-IgG umane (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) è stato immobilizzato sul chip del sensore CM5 con accoppiamento ammine, e gli anticorpi sono stati catturati a 1 mg /ml per 4 minuti e stabilizzato per 5 minuti ad una portata di 50 ml /minuto. HER2-ECD-His proteina è stata iniettata ad una concentrazione di 160 nM. Per le misure di affinità, gli anticorpi sono stati catturati a circa 50 RU da capra anti-IgG umane (γ) immobilizzata su un chip CM5. HER2-ECD-His proteina è stata iniettata a concentrazioni comprese tra 0 e 640 nm. Sensorgrams sono stati ottenuti per ogni concentrazione e valutati utilizzando il software BIAevaluation. Per epitopi binning, sotto forma di IgG hz1E11 è stato immobilizzato su CM5 superfici di chip sensore separato a circa 1000 unità di risposta. HER2-ECD-His (320 nM) e anticorpi (1 mg /ml) sono stati aggiunti sequenzialmente per 4 minuti e stabilizzato per 5 minuti ad una portata di 50 ml /minuto.}

vitalità cellulare dosaggio

le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti (Corning) nel FBS 10% contenente medio e pre-coltivate per 24 ore. Le cellule sono state trattate con anticorpi alle concentrazioni indicate e coltura per 4 giorni. WST-1 reagente (Dogen EZ-Cytox; Daeil Service Lab, Seoul, Corea) è stato utilizzato per misurare la vitalità cellulare. Relativa vitalità cellulare è stato calcolato dividendo l'assorbanza di ciascun pozzetto dal assorbanza media dei pozzetti PBS-trattati in ogni piatto.

dello xenotrapianto studio

atimici nudi topi di sesso femminile (Daehan Biolink, Chungbuk, Corea ) sono stati iniettati per via sottocutanea nella zona del fianco sinistro con 5 × 10 ^{6 delle cellule NCI-N87 in Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). I tumori sono stati autorizzati a crescere fino a circa 200 mm 3 in termini di dimensioni, e topi sono stati poi randomizzati in gruppi. Animali ricevuti somministrazione intraperitoneale di anticorpi alle dosi indicate due volte alla settimana. volumi tumorali sono stati calcolati utilizzando la formula (L x W x W) /2, dove L rappresenta il più grande diametro del tumore e W rappresenta il diametro del tumore più piccolo. A due vie per misure ripetute ANOVA seguita da test post Bonferroni è stata eseguita per l'analisi statistica dei growth.All studi sugli animali di tumore sono stati condotti in conformità con le linee guida della "Guida per la cura e all'uso degli animali" del NIH e un protocollo approvato ricevuto da Comitato Istituzione cura degli animali e Usa della società.}

Risultati

umanizzazione di 1E11 condotto da CDR-innesto di geni germinali umane

per sviluppare l'anticorpo umanizzato, il VH e VL sequenze del murino 1E11 sono stati confrontati con linea germinale umana V e J gene repertori usando IMGT V-Quest strumenti di analisi /[24]. Per la catena pesante, IGHV3-48 * 03 e IGHJ4 * 01 esposta la più alta omologia con le controparti 1E11, condividendo l'85% e il 87% di identità, rispettivamente. Per la catena leggera, umani IGKV1-39 * 01 e IGKJ1 * 01 geni visualizzati identità del 80% e 81%, rispettivamente. Questi geni umani sono stati selezionati come sequenze accettori per l'innesto dei REC murini. Tra la zona Vernier, che consiste di residui della regione quadro che sono coinvolti nella presentazione di strutture CDR sostenendo il CDR loop [18, 25], un solo residuo in posizione 49 _{H della catena pesante diversa tra murino e sequenze umane. Di conseguenza, umanizzato 1E11, hz1E11, ha un solo residuo murina nelle regioni di supporto (Fig 1).}

attività di legame di hz1E11 a regione extracellulare (ECD) di HER2 è equivalente a quella di ch1E11 (Fig 2A), e l'affinità di trastuzumab, ch1E11, e hz1E11 era 3 nm, 23 nm e 23 nm. Abbiamo anche confermato che hz1E11 legato a sub-dominio IV come il ch1E11 dei genitori. Il trastuzumab si lega anche ai sub-dominio IV [26]. in vitro
attività anti-proliferativa di hz1E11 come singolo agente e in associazione con trastuzumab sono stati anche equivalenti a quelli di ch1E11 (Fig 2C). Nello studio precedente [22] E 'stato riferito che ch1E11 aveva in vivo
attività antitumorale paragonabile a quella di trastuzumab come singolo agente, e la combinazione di ch1E11 e trastuzumab ha provocato l'indice di regressione del tumore (TGI) di 95,1%. Allo stesso modo, hz1E11 come agente singolo ha avuto simile in vivo
attività antitumorale di trastuzumab (S1 Fig) e la combinazione di hz1E11 con trastuzumab ha anche mostrato attività anti-tumorale dose-dipendente nel modello NCI-N87 xenotrapianto mouse ( Fig 2D). Anticorpo trattamento di combinazione a 1 mg /kg ciascuno dei hz1E11 e trastuzumab provocato simile attività anti-tumorale con singolo trattamento trastuzumab a 10 mg /kg, ea 2,5 mg /combinazione kg e sopra il tumore stabilita stabilizzato o avviato regressione (n statisticamente è stato osservato tra 2,5, 5 e 10 mg /kg combinazioni); significativa differenza [0.05 P Hotel <]. Questi risultati dimostrano che hz1E11 ha l'affinità e l'attività biologica equivalente alla ch1E11, e che hz1E11 aumenta l'attività anti-tumorale di trastuzumab se usato in combinazione.

alanina scansione di CDR-H3 e CDR-L3

per identificare i residui critici per l'interazione antigene-anticorpo, alanina mutagenesi scansione è stata effettuata in regioni CDR3 di catene pesanti e leggere (CDR-H3 e CDR-L3). Gli effetti delle mutazioni sono stati valutati analizzando l'attività di legame di proteine ​​Fab purificati mediante ELISA indiretto. In CDR-H3, la sostituzione alanina alla posizione Gly98 _{H abolito il legame dei Fab di HER2, e G97 HA e T99 mutanti HA ha mostrato una ridotta attività di legame (Fig 3A). In CDR-L3, le sostituzioni alanina hanno avuto effetti molto più piccole (Fig 3B). Il k
off valori di mutanti di scansione alanina sono stati analizzati utilizzando SPR contro la proteina HER2-ECD immbolized. Abbiamo confermato che il G98a mutante catena pesante completamente perso attività vincolanti, e la vicina T99 HA e G97 mutanti HA portato a 32 volte e 17 volte più k
off valori rispettivamente (Fig 3C). Questi risultati indicano che pesante catena Gly98 H è funzionalmente critica e residui adiacenti sono anche funzionalmente importanti per l'interazione antigene-anticorpo.}

Affinity maturazione del hz1E11

la maturazione di affinità di hz1E11 è stata condotta dalla costruzione della catena pesante o leggero librerie CDR3 varianti, seguito dalla selezione dell'equilibrio delle librerie anticorpali fago. Per la catena leggera, residui di glutammina alle posizioni 89 _{L e 90 L non sono stati diversificati perché glutamina si trova comunemente in queste posizioni di nove aminoacidi sequenze di acido-longCDR-L3 a 59% e 73% delle frequenze, rispettivamente [ ,,,0],27]. Posizioni 91 L-94 L sono stati randomizzati con un codone NNK degenerato (L-NNK). Per la catena pesante, posiziona 95 H -100 H stati randomizzati utilizzando un XXS codone (H-XXS), progettato in modo tale che la prima e la seconda posizione nucleotidica del codone diversificata base wild type verificato con 70 % possibilità, ognuno degli altri tre basi verificato alla frequenza di 10%, e il terzo lettere dei codoni sono stati sintetizzati utilizzando una miscela equimolare di G e C (Fig 4A). leganti ad alta affinità sono stati selezionati da alta rigorosità o di bassa severità panning (Tabella 1).}

Rispetto alla bassa severità panning della libreria L-NNK in cui il 100% del secondo, terzo, e cloni uscita quarto turno schermati erano ELISA positivi, per l'alta stringenza panning all'uscita quarto turno dato alcun legante a tutti, e solo un terzo dei cloni uscita terzo turno erano ELISA positivo (Tabella 1). I cloni selezionati dalla libreria CDR-L3 incluso molte sequenze che avevano tutte e quattro le posizioni randomizzati CDR-L3 mutati, a differenza di librerie CDR-H3 da cui la maggior parte dei cloni selezionati mantenuto la sequenza di tipo selvatico in posizioni 97 _{H -100 H (vedi sotto). Differenti strategie panning ha prodotto diversi modelli di sequenza di arricchimento. Ad esempio, la variante clone catena leggera 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) è stato isolato da l'alta rigore panning, ma non dal basso rigore panning, e il pesante variante catena clone 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) è stato anche selezionato solo dal-alto rigore panning. È interessante notare che il 59% degli anticorpi unici in 4 ^{th uscita con pan di libreria L-NNK basso rigore ha avuto un alanina alla posizione 92 L, in linea con l'analisi di scansione alanina (Fig 4B).}}

Quasi tutti i cloni che sono stati isolati dalla libreria H-XXS avevano la stessa sequenza a 97 _{H -100 H come il clone dei genitori, e ha mostrato un chiaro arricchimento di sequenza Asn-Tyr a 95-96. Per valutare ulteriormente il contributo di residui di CDR-H3 antigene-anticorpo vincolante, un ulteriore biblioteca CDR-H3 è stato costruito con doppia NNK codone casuale scansione di CDR-H3 (H-2AA, Fig 4A). In basso rigore panning, mutanti alle posizioni 95 H, 96 H, 99 H, 100 H, e l'articolo 100 H sono stati selezionati nel panning primo turno, ma solo mutanti nelle posizioni 95 H e 96 H sono stati arricchiti in uscita quarto turno (Tabella 1). Non abbiamo potuto rilevare i mutanti in posizioni Gly97 H e Gly98 H in tutte le strategie e le uscite panning.}

Affinity e attività di legame di cloni selezionati

Per valutare l'effetto combinazione delle varianti pesante e leggero catena di affinità-maturato, anticorpi IgG con combinazioni di catene pesanti e leggere affinità stagionatura sono state prodotte e la loro k
_{off valori erano determinare utilizzando l'analisi SPR (Tabella 2). Tra due varianti di catena di luce e due varianti catene pesanti, 1A12 derivato da L-NNK ha mostrato il più grande miglioramento (16 volte). La combinazione della catena leggera della 1A12 con la catena pesante ottimizzata del clone 1B12 ha determinato un miglioramento di 24 volte in k
off sul hz1E11 dei genitori, mentre per le altre combinazioni k
off valori erano simili o superiore a quello della 1A12. Poiché il 1.5-fold ulteriore miglioramento dalla combinazione L-1A12 + H-1B12 non era significativamente grande, cloni 1A12 e 1F11 (varianti catena leggera) sono stati scelti per un'ulteriore caratterizzazione per minimizzare la differenza di sequenza degli anticorpi per affinità maturata dalla parentale clone. Le costanti di dissociazione per l'affinità maturati cloni, determinati anche mediante analisi SPR, erano più di 10 volte inferiore a quella del clone hz1E11 parentale e paragonabile a quella di trastuzumab (Tabella 3).}

Per determinare se affinità cloni hz1E11 -matured si legano allo stesso epitopo come il hz1E11 dei genitori, il legame di 1A12 e 1F11 al HER2-ECD, che è stato pre-destinata a hz1E11 è stata analizzata mediante SPR. Entrambi i cloni sono stati in grado di legarsi al monomero HER2-ECD-His proteine ​​catturato da immobilizzata 1E11, mentre trastuzumab potrebbe (Fig 4C). Inoltre, è stato confermato che l'epitopo 1A12 non si sovrapponga a quello di trastuzumab (Fig 4D). Cloni 1A12 e 1F11 anche legarsi a sub-dominio IV come il loro genitori clone hz1E11 (Fig 4E). Questi dati indicano che epitopi di 1A12 e 1F11 non sono state modificate dal processo di maturazione di affinità.

L'efficacia di affinità maturata hz1E11 cloni

Sia 1A12 e 1F11 anticorpi hanno mostrato un lieve aumento delle attività anti-proliferative come singolo agente rispetto al hz1E11 su linee cellulari di cancro gastrico che iperesprimono HER2 (Fig 5A e 5B) NCI-N87 e OE-19, mentre in combinazione con trastuzumab, la loro attività anti-proliferativa era superiore a quella trastuzumab da solo ed equivalente a hz1E11 più trastuzumab . L'attività anti-proliferativa di 1A12 e 1F11 è stata confermata in vivo
nel modello di xenotrapianto NCI-N87. attività antitumorale superiore era evidente in combinazione con trastuzumab a quella di ogni agente da solo in entrambi i modelli di xenotrapianto (Fig 5C).

Discussione

Nonostante gli incoraggianti risultati clinici ottenuti con il HER2 mira anticorpo trastuzumab nel trattamento del cancro gastrico, ci sono ancora esigenze di più potenti HER2 terapie mirate [6]. Combinazione di anticorpi non concorrenti di targeting recettori quali HER2, EGFR, e VEGFR3, può aumentare l'attività antitumorale in modelli preclinici [11-13, 28]. Pertuzumab, un altro anticorpo HER2-targeting, è approvato per l'uso in combinazione con trastuzumab nel trattamento del carcinoma mammario metastatico [29]. In uno studio precedente, abbiamo sviluppato un romanzo HER2 mira anticorpo, 1E11, che è stato dimostrato di avere una significativa attività antitumorale come agente singolo e effetto sinergico in combinazione con trastuzumab in vitro
e in vivo
[22]. L'attività anti-tumorale del 1E11 più in combinazione con trastuzumab è superiore non solo per singolo trattamento con trastuzumab, ma anche alla combinazione di pertuzumab e trastuzumab. In questo rapporto, l'umanizzazione e la successiva affinità maturazione del topo ibridoma di derivazione 1E11 anticorpo monoclonale è descritto.

approcci iniziali per ridurre il potenziale immunogenicità di regioni variabili non umani da parte del CDR-innestando in un contesto umano, ridurre significativamente l'immunogenicità di anticorpi terapeutici [15, 17]. Superhumanization utilizzando framework germinali umane come modello è stato proposto come metodologia umanizzazione superiore per evitare putativo effettrici epitopi T-cellulari derivate da hypermuations somatiche del quadro umano [30-32]. È stato suggerito che gli anticorpi codificati da segmenti genetici germinali sono strutturalmente flessibile e capace di ospitare vincolante di molti antigeni differenti [33-35]. I CDR di murino 1E11 anticorpi nonché un residuo nella zona Vernier di V _{H (Ala49 H) sono stati innestati sulla variabile di linea germinale umana e giunzione geni con alta omologia con l'anticorpo parentale (Fig 1). L'anticorpo umanizzato risultante, hz1E11, ha mostrato un'affinità quasi identico e l'attività biologica per l'anticorpo parentale (Fig 2).}

La selezione dei residui di randomizzazione è un passo fondamentale nell'approccio randomizzazione mirato di maturazione affinità a causa delle limitazioni pratiche di dimensioni biblioteca anticorpi e le tecnologie di selezione. scansione alanina e in silico
analisi della sequenza anticorpi, specialmente in CDRs, sono utili per la selezione dei residui bersaglio randomizzazione e facilitare il processo di maturazione di affinità. Nell'analisi scansione alanina di CDR-H3 di hz1E11, il mutante G98a completamente perso l'attività di legame e il mutante G97a ha mostrato una ridotta attività di legame (Fig 3A). alterazione diretta di un residuo essenziale paratope solito comporta la perdita totale della capacità dell'anticorpo [26, 33, 36] vincolante. Pertanto, un approccio più conservativo di CDR-H3 randomizzazione è stato impiegato, utilizzando un oligonucleotide a mano mista che è sbilanciata verso la sequenza dei genitori, o il gemello NNS casuale scansione codone di CDR-H3. Come previsto dall'analisi scansione alanina, quasi tutti i cloni che sono stati isolati dalle librerie CDR-H3 avevano la sequenza di 97 _{H-100 H stesso come il clone dei genitori (G 97HGTAS 100 Ah) .}

l'alanina risultati di scansione suggeriscono che tutti i residui di CDR-L3 sono indispensabili, anche se alcune delle mutazioni sembra abbassare l'affinità (Fig 3B). Pertanto, quattro posizioni di CDR-L3 (91 _{L-94 L) sono stati interamente assegnati in modo casuale utilizzando il codone NNK degenerato. L'analisi della sequenza dei cloni selezionati confermato l'analisi scansione alanina; la maggioranza dei cloni selezionati dalla libreria CDR-L3 aveva tutti quattro randomizzati posizioni CDR-L3 cambiato dal residuo parentale, contrariamente ai risultati di ottimizzazione CDR-H3 in cui la maggior parte dei cloni selezionati dalle librerie avevano la stessa sequenza come hz1E11 dei genitori nella parte centrale del CDR (Tabella 1). I cloni con la maggior miglioramento affinità provenivano dalla biblioteca CDR-L3. È probabile che il CDR-H3 di hz1E11 è già vicino alla ottimale e la maggior parte delle mutazioni, in particolare nella regione 97 H-100 H, sono deleteri per l'affinità di legame, mentre la sequenza CDR-L3 non è come ottimale e la mutazione in questa regione può comportare un miglioramento significativo nella affinità. Le uscite panning libreria L-NNK stati arricchiti con cloni con un amminoacido idrofobico nella posizione 91 L, un piccolo amminoacido a 92 L, e un aminoacido aromatico a 93 L. Questo modello è un po 'diversa da quella dei genitori sequenza di CDR-L3 di Q 89LQLYSTPWT 97L e di nuovo suggerisce che la sequenza di CDR-L3 dell'anticorpo genitori 1E11 era sub-ottimale e, quindi, ha avuto spazio per migliorare l'affinità.}