PLoS ONE: Affinity Modning af monoklonalt antistof 1E11 ved målrettet Randomisering i CDR3 Regioner Optimerer Terapeutisk antistof Målretning af HER2-positiv mavekræft

Abstrakt

Anti-HER2 murine monoklonale antistof 1E11 har stærke og synergistisk anti-tumor aktivitet i HER2-overekspression gastriske kræftceller, når de anvendes i kombination med trastuzumab. Vi i øjeblikket optimeret dette antistof for humane lægemidler. Først blev komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) af det murine antistof podet på human kimlinje immunoglobulinvariable gener. blev ikke observeret nogen forskel i affinitet og biologisk aktivitet mellem kimære 1E11 (ch1E11) og humaniseret 1E11 (hz1E11). Dernæst blev affinitetsmodning af hz1E11 udføres af randomisering af CDR-L3 og H3-rester efterfulgt af stringent biopanning markering. Mildere selektionstryk begunstiget udvælgelsen af ​​mere forskelligartede kloner, mens højere udvælgelse stringens resulterede i konvergensen mellem panorering output til et mindre antal kloner med forbedret affinitet. Klon 1A12 havde fire aminosyresubstitutioner i CDR-L3, og viste en 10-gange stigning i affinitet sammenlignet med den parentale klon og forøget styrke i en in vitro
antiproliferativ aktivitet assay med HER2-overepxressing mavekræft celler. Klon 1A12 hæmmede tumorvækst af NCI-N87 xenograftmodel med tilsvarende effekt for trastuzumab alene, og kombinationen behandling af 1A12 og trastuzumab helt fjernet de etablerede tumorer. Disse resultater antyder, at humaniserede og affinitetsmodnede monoklonale antistof 1A12 er en stærkt optimeret molekyle for fremtidig terapeutisk udvikling mod HER2-positive tumorer

Henvisning:. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) Affinity Modning af monoklonalt antistof 1E11 ved målrettet Randomisering i CDR3 Regioner Optimerer Terapeutisk antistof Målretning af HER2-positiv mavekræft. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10,1371 /journal.pone.0134600

Redaktør: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, UNITED STATES

Modtaget: 14. april, 2015; Accepteret: 12 juli 2015; Udgivet: 30 Juli 2015

Copyright: © 2015 Ko et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af AbClon Inc., og ved Grundforskningsfond Korea (NRF) tilskud til HS for Medicinal Bioconvergence Research center (NRF-2013M3A6A4044991) . Den kommercielle bidragyder (AbClon Inc.) ydet støtte i form af løn til forfattere (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, og JSL), men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, og JSL er alle ansat af AbClon Inc. og kan eje sin lager. HS er på betalt rådgivning til AbClon Inc. og også ejer sit lager. Abclon forfølger patenter og produktudvikling på forbindelser, der er nævnt i dette dokument. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, og JSL er alle i øjeblikket ansat i den kommercielle bidragyder af denne forskning AbClon Inc. og kan eje sit lager. HS er i øjeblikket på betalt rådgivning til AbClon Inc. og også ejer sit lager. AbClon har et registreret patent i Korea (KR10-1453462, Antistoffer kan binde specifikt til HER2) og indgivet en PCT-ansøgning (PCT /KR2014 /004.317, antistof specifikt binder til HER2), hvor BKK, YHL, ISH, KTK, og JSL er opført som opfindere. AbClon også forfølger produktudvikling på de humaniserede, affinitet-modnet antistoffer, der er nævnt i dette dokument. Disse ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

monoklonale antistoffer er mainstream behandlinger i onkologi og autoimmune sygdomme, og forventes at spille en vigtig rolle i fremtidens sygdomsbehandling [1, 2]. Mere end 30 rekombinante antistoffer er i øjeblikket godkendt af USA Food and Drug Administration, hvoraf omkring halvdelen er anti-cancer-antistoffer. Mavekræft er en af ​​de mest almindelige cancere og er den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan [3]. I mavekræft, overekspression af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2), og HER3 er korreleret med dårlig prognose [4, 5]. For nylig blev HER2 målrette monoklonale antistof trastuzumab godkendt til behandling af HER2-positiv metastatisk gastrisk og gastro krydset kræft baseret på resultaterne af Trastuzumab med kemoterapi i HER2-positiv fremskreden ventrikelkræft (ToGA) klinisk forsøg [6].

Særlige kombinationer af gensidigt ikke-kompetitive antistoffer rettet mod samme receptor stigning anti-tumor aktivitet in vitro
in vivo
. Kombination af HER2 målrette antistoffer, trastuzumab og pertuzumab, viser øget effektivitet i HER2-overekspression brystkræft [7]. Fordelene ved kombinationen pertuzumab og trastuzumab er yderligere blevet vist i prækliniske og kliniske forsøg [8, 9]. Andre HER2-targeting antistoffer viser bedre effekt i kombination end som enkelte midler, og har vist konsekvent nedregulering af HER2 niveauer og gavnlige kombinationseffekter i musemodeller [10]. Den øgede effektivitet af antistof-kombinationer er også blevet demonstreret med EGFR-targeting antistoffer [11, 12] og vaskulær endotelvækstfaktor-receptor 3 (VEGFR3) -targeting antistoffer [13].

Terapeutiske antistoffer typisk er udførligt manipuleret til besidde ønskelige biologiske og fysisk-kemiske egenskaber, såsom lav immunogenicitet, høj affinitet og specificitet, optimale effektorfunktioner, og god opløselighed og stabilitet [14]. Især antistof humanisering og affinitet modning er to af de hyppigst anvendte tekniske processer under udviklingen af ​​terapeutiske antistof kandidater. Immunogenicitet terapeutisk antistof begrænser den kliniske anvendelighed og effekt ved produktion af antistoffer mod lægemidlet [15], og humanisering af antistoffer fra mus eller andre arter er nu en standard procedure for udviklingen af ​​terapeutiske antistoffer. Enkelte humaniserings metoder er blevet udviklet, som beskæftiger enten rationelle eller empiriske tilgange [16]. Den komplementaritetsbestemmende region (CDR) podning tilgang som en metode til at overvinde det humane anti-kimært antistof (HACA) -respons [17] er en veletableret humanisering metode. Imidlertid direkte podning af murine CDR'er på et humant ramme acceptor sekvens resulterer ofte i tab af affinitet, så back-mutationer af rammeregion rester (Vernier zone rester) støtter strukturen af ​​CDR loops er ofte nødvendigt [18]. For in vitro
affinitetsmodning, tre diversificering metoder anvendes typisk: random mutagenese ved f.eks fejlbehæftet PCR, randomisering af målrettede rester anvender degenererede oligonukleotider og kæde blander. I den målrettede randomisering tilgang, CDR'er er den logiske mål for randomisering i de fleste tilfælde, fordi somatisk hypermutation har udviklet sig til at favorisere mutationer i CDR'er af antistoffer [19], og CDR-H3 og CDR-L3 tendens til at dominere antistof-antigen-interaktion [ ,,,0],20]. Et af de vigtigste problemer i forbindelse med den målrettede randomisering er at vælge de positioner, som ikke er essentielle for antigenbinding, men som kan forbedre affiniteten når optimal udskiftning af aminosyren er lavet. Alaninscanning kan hjælpe med at bestemme resterne til randomisering, især når CDR'er er lange. Nogle gange, alanin mutation sig selv øger affiniteten af ​​antistoffer [21].

Vi har tidligere udviklet en murine antistof rettet mod HER2 (klon 1E11), der viser synergistisk antitumor aktivitet i kombination med trastuzumab i HER2 overekspression gastrisk cancer cellelinjer [22 ]. I denne rapport beskriver vi, hvordan vi optimeret 1E11 for en terapeutisk antistof ved CDR-transplantation til human kimlinje immunglobulin variable gener og affinitet modning gennem målrettet randomisering af CDR-H3 og CDR-L3. Den optimerede 1E11 antistof (klon 1A12) viser synergistisk antitumoraktivitet i HER2-positiv mavekræft xenograftmodeller i kombination med trastuzumab. Det blev observeret, at for klon 1E11, human kimlinje variable gener er egnede acceptorer til humanisering uden affinitet reduktion, og erstatning af CDR-L3-rester som ikke er afgørende for antigenbinding var nok til at forbedre affiniteten med mere end 10-fold. Salg

materialer og metoder

cellelinjer og materialer

NCI-N87 celler blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og OE-19 celler blev opnået fra European Collection of Cell Culture (ECACC, Porton Down, UK). Celledyrkningsmediet var RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), og antibiotika og celler blev dyrket ved 37 ° C under 5% CO _{2. Trastuzumab og palivizumab blev produceret af Genentech (South San Francisco, CA, USA) og MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), hhv. ChromPure humant IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) blev anvendt som human IgG kontrol antistof i in vitro
assays. IgG-antistoffer blev fremstillet under anvendelse af Freestyle 293-systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og oprenses under anvendelse af protein-A-affinitetskromatografi (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoksin blev fjernet med et endotoksin Removal Kit (genscript, Piscataway, NJ, USA), og endotoksin blev bestemt under anvendelse af et Endotoxin Detection Kit (genscript). Rekombinante proteiner blev fremstillet som secernerede proteiner ved anvendelse af Freestyle 293 systemet og oprenses under anvendelse af protein-A eller Ni-NTA-kromatografi (Qiagen, Valencia, CA, USA) i Fc-mærket eller His-mærkede proteiner, henholdsvis.}

alaninscanningsmutagenese og Fab oprensning

steddirigeret mutagenese for alanin scanning blev udført ved PCR-mutagenese under anvendelse QuickChange mutagenese Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Mutante Fab-proteiner blev udtrykt og oprenset for at evaluere betydningen af ​​hver rest til antigenbindende aktivitet. Kort fortalt Escherichia coli
DH5a-celler transformeret med pComb3X vektoren, der huser mutant Fab-gener blev dyrket ved 28 ° C i SB bouillon. Ekspression blev induceret med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid når den optiske densitet (600 nm) af kulturen nåede 0,8. Cellepellets blev resuspenderet i afkølet ekstraktionsbuffer (120 mM Tris, pH 8,0, 0,3 mM EDTA og 300 mM saccharose) og inkuberet på is i 30 minutter for periplasmatisk ekstraktion. Magnesiumchlorid (2,5 mM) blev tilsat til den klarede ekstrakt efter centrifugering at opfange frie EDTA før immobiliseret metalion-affinitetskromatografi (IMAC) oprensning. Oprensede Fab-proteiner blev anvendt til ELISA binding assay og k
_{off-analyse under anvendelse af overfladeplasmonresonans (SPR).}

Affinitetsmodning

humaniseret 1E11 klonet i pComb3X vektor Fab format blev anvendt som template for overlap extension polymerasekædereaktion (PCR) mutagenese som tidligere beskrevet [23]. De degenererede oligonukleotider (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(revers) og 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Fremad) blev anvendt til L-NNK og H-XXS bibliotek hhv. N betegner A, C, G eller T; M er C eller A; og S er G eller C. nummererede basepositioner indikerer håndblandet nukleotider sammensat af 70% af en base og 10% hver af de andre tre baser: 70% frekvens base er G, A, T og C i 1, 2, 3 og 4, hhv. For H-2AA bibliotek, blev en ækvimolær blanding af følgende fremad mutagene oligonukleotider anvendt: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ', og 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K betegner G eller T. Efter to runder af overlappende ekstension PCR, Fab bibliotek DNA med et randomiseret CDR blev skåret med SfiI, ligeret ind i SfiI-fordøjet fagmidvektor pComb3X, og elektroporeret ind E
. coli
stammen ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

høj affinitet bindere blev udvalgt ved hjælp af opløselige biotinyleret HER2-ECD protein. Bead bindemidler blev præ-depleteret ved inkubering af antistoffet fagbiblioteket med 100 pi præblokeret Dynabeads M-280 Streptavidin (Invitrogen) i 1 time med langsom rotation ved stuetemperatur. Biotinyleret HER2-ECD protein (100 nM- 12:01) blev tilsat til den før-depleteret antistofbibliotek og inkuberet i 1 time med rotation ved stuetemperatur. Derefter blev 50 pi af blokerede streptavidin-magnetiske perler tilsat og inkuberet på rotator i 15 minutter. Kugler blev vasket 10 gange med 1 ml Tris-saltvand-Tween 20 (TBST) og to gange med 1 ml PBS. Bundne fager blev elueret ved inkubering af perlerne med 1 ml 100 mM triethylamin i 8 minutter og derefter neutraliseret med 0,5 ml 1 M Tris, pH 7,4.

ELISA bindingsaktivitet test

Antistoffer blev tilsat til Costar 96-brønds halv area plader (Corning, Corning, NY, USA Produkt No. 3690) overtrukket med 1 ug /ml af antigenet. Efter inkubation ved stuetemperatur i 1 time blev pladerne vasket tre gange med TBST og inkuberet med kanin-anti-humant antistof-peberrodsperoxidase (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) for IgG antistoffer og rotte-anti-HA-HRP (Klon F10, Roche Life Science, Basel, Schweiz) til Fab-antistoffer, hhv. Pladerne blev vasket tre gange, tetramethylbenzidin (TMB) peroxidasesubstrat (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) blev tilsat, og reaktionerne blev standset ved tilsætning af 1 N svovlsyre (DukSan, Ansan, Korea). Absorbansen ved 450 nm blev målt ved hjælp af en Victor X3 instrument (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

overfladeplasmonresonans analyse

For k
_{off analyse af Fab-proteiner, HER2-ECD-His-protein blev immobiliseret på overfladen af ​​en CM5 sensor chip (GE Healthcare) under anvendelse af aminen koblingsmetode ved ca. 2.000 responsenheder (RU). Oprensede Fab-proteiner blev injiceret ved 2 ug /ml koncentration og en strømningshastighed på 50 pl /minut. For k
off analyse af IgG antistoffer, gede-anti-humant IgG (γ) (Invitrogen, katalog nr. H10500) blev immobiliseret på CM5 sensor chip bruger aminkobling, og antistoffer blev opfanget ved 1 ug /ml i 4 minutter og stabiliseret i 5 minutter ved en strømningshastighed på 50 pl /minut. HER2-ECD-His protein blev injiceret ved en koncentration på 160 nM. For affinitet målinger blev antistoffer opfanget ved ca. 50 RU af gede-anti-humant IgG (γ) immobiliseret på en CM5-chip. HER2-ECD-His-protein blev injiceret i koncentrationer på mellem 0 og 640 Nm. Sensorgrams blev opnået ved hver koncentration og evalueret ved brug af BIAevaluation softwaren. For epitop binning blev IgG form af hz1E11 immobiliseret på separate CM5 sensor chip overflader på ca. 1000 responsenheder. HER2-ECD-His (320 nM) og antistoffer (1 pg /ml) blev successivt tilsat i 4 minutter og stabiliseret i 5 minutter ved en strømningshastighed på 50 pl /minut.}

Cellelevedygtighed assay

Celler blev podet i plader med 96 brønde (Corning) i 10% FBS indeholdende medium og præ-dyrket i 24 timer. Cellerne blev behandlet med antistoffer i de angivne koncentrationer og kultur i 4 dage. WST-1 reagens (Dogen EZ-Cytox; Daeil Lab service, Seoul, Korea) blev anvendt til måling af cellelevedygtighed. Relativ cellelevedygtighed blev beregnet ved at dividere absorbansen af ​​hver brønd ved gennemsnitlige absorbans af PBS-behandlede brønde i hver plade.

xenograft undersøgelse

athymiske nøgne hunmus (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea ) blev injiceret subkutant i den venstre flanke med 5 × 10 ^{6 af NCI-N87 celler i Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Tumorer fik lov til at vokse til ca. 200 mm 3 i størrelse, og mus blev derefter randomiseret i grupper. Dyrene modtog intraperitoneal administration af antistoffer i de angivne doser to gange ugentligt. Tumorvolumener blev beregnet ved anvendelse af formlen (L × B × W) /2, hvor L betegner den største tumordiameter og W betegner den mindste tumor diameter. To-vejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af Bonferroni indlæg blev udført for statistisk analyse af tumor growth.All dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra NIH s "Vejledning til pasning og anvendelse af dyr", og en godkendt protokol modtaget af selskabets Institution Animal Care og brug Udvalg.}

Resultater

menneskeliggoere 1E11 foretaget af CDR-podning til humane germliniegener

for at udvikle humaniseret antistof, VH og VL sekvenser af den murine 1E11 blev sammenlignet med human kimlinje V og J gen-repertoirer ved anvendelse IMGT /V-QUEST analyseværktøjer [24]. For den tunge kæde, IGHV3-48 * 03 og IGHJ4 * 01 udviste den højeste homologi med 1E11 modstykker, deling 85% og 87% identitet hhv. For den lette kæde, humane IGKV1-39 * 01 og IGKJ1 * 01-generne viste identitet 80% og 81%, hhv. Disse humane gener blev udvalgt som acceptor sekvenser til podning af de murine CDR'er. Blandt Vernier-zonen, som består af rester i skeletregionen, som er involveret i præsentationen af ​​CDR strukturer ved at støtte CDR loops [18, 25], kun én rest i position 49 _{H fra tung kæde afveg mellem murine og humane sekvenser. Derfor humaniseret 1E11, hz1E11, har kun én murine rest i rammeaftalerne regioner (figur 1).}

Bindende aktivitet af hz1E11 til ekstracellulære område (ECD) af HER2 var den samme som for ch1E11 (Fig 2A), og affiniteten af ​​trastuzumab, ch1E11, og hz1E11 var 3 nM, 23 nM og 23 nM. Vi bekræftede også, at hz1E11 bundet til sub-domæne IV ligesom forældrenes ch1E11. Trastuzumab binder også til sub-domæne IV [26]. in vitro
anti-proliferative aktiviteter hz1E11 som enkeltstof og i kombination med trastuzumab var også svarer til virkningerne af ch1E11 (Fig 2C). I den tidligere undersøgelse [22] blev det rapporteret, at ch1E11 havde in vivo
antitumoraktivitet sammenlignes med trastuzumab som enkeltstof, og kombinationen af ​​ch1E11 og trastuzumab resulterede i tumorregression indeks (TGI) af 95,1%. Tilsvarende hz1E11 som et enkelt middel havde lignende in vivo
antitumoraktivitet til trastuzumab (S1 Fig) og kombinationen af ​​hz1E11 med trastuzumab viste også dosisafhængig anti-tumor aktivitet i NCI-N87 xenograft musemodel ( fig 2D). Antistof kombinationsbehandling ved 1 mg /kg hver af hz1E11 og trastuzumab resulterede i tilsvarende antitumoraktivitet med trastuzumab enkelt behandling med 10 mg /kg, og på /kg kombinationen 2,5 mg og derover den etablerede tumor stabiliseret eller begyndt regression (Ingen statistisk signifikant forskel [ P
< 0,05], blev observeret blandt 2,5, 5 og 10 mg /kg kombinationer). Disse resultater viser, hz1E11 har affinitet og biologisk aktivitet svarende til ch1E11, og at hz1E11 forbedrer antitumoraktiviteten af ​​trastuzumab, når de anvendes i kombination.

alanin scanning af CDR-H3 og CDR-L3

for at identificere de kritiske rester for antigen-antistof-interaktion, blev alaninscanningsmutagenese udført i CDR3 regioner af tunge og lette kæder (CDR-H3 og CDR-L3). Virkningerne af mutationerne blev vurderet ved at analysere bindingsaktiviteten af ​​oprensede Fab-proteiner ved indirekte ELISA. I CDR-H3, alanin-substitution i position Gly98 _{H afskaffet binding af Fab til HER2, og G97 HA- og T99 HA-mutanter viste reduceret bindingsaktivitet (figur 3A). I CDR-L3, alaninsubstitutionerne havde meget mindre virkninger (Fig 3B). k
off værdier for alanin scanning mutanter blev analyseret ved hjælp af SPR mod immbolized HER2-ECD protein. Vi bekræftede, at den tunge kæde G98A mutant helt tabt bindende aktiviteter, og den nærliggende T99 HA og G97 HA mutanter resulterede i 32-fold og 17-fold øget k
off værdier henholdsvis (fig 3C). Disse resultater indikerer, at tung kæde Gly98 H er funktionelt kritisk og dens tilstødende rester er også funktionelt vigtige for antigen-antistof-interaktion.}

Affinitetsmodning af hz1E11

Affinitetsmodning af hz1E11 blev udført ved bygning af tung eller let kæde CDR3 variant biblioteker, efterfulgt af ligevægt udvælgelse af fag-antistofbiblioteker. For den lette kæde, glutaminrester ved positionerne 89 _{L og 90 L blev ikke diversificeret fordi glutamin er almindeligt forekommende i disse positioner af ni aminosyre-longCDR-L3 sekvenser ved 59% og 73% frekvenser henholdsvis [ ,,,0],27]. Positioner 91 L-94 L blev randomiseret ved hjælp af et NNK degenereret codon (L-NNK). For den tunge kæde, positionerne 95 H -100a H blev randomiseret under anvendelse af en XXS codon (H-XXS), udformet således, at i den første og anden nukleotidpositioner af diversificeret codon-vildtype basen forekom med 70 % chance, hver af de andre tre baser forekom ved 10% hyppighed, og den tredje bogstaver i codonerne blev syntetiseret under anvendelse af en ækvimolær blanding af G og C (figur 4A). Høj affinitet bindere blev udvalgt fra høj stringens eller lav stringens panorering (tabel 1).}

Sammenlignet med lav stringens panorering af L-NNK-biblioteket, hvor 100% af den andet, tredje og fjerde runde output screenede kloner var ELISA positive, for high-stringens panorering den fjerde runde output gav ingen bindemiddel overhovedet, og kun en tredjedel af de tredje runde-output kloner var ELISA positive (tabel 1). De valgte kloner fra CDR-L3 bibliotek inkluderet mange sekvenser, der havde alle fire randomiserede CDR-L3 positioner muteret modsætning CDR-H3-biblioteker, hvorfra de fleste af de udvalgte kloner tilbageholdt vildtypesekvensen i positionerne 97 _{H -100 H (se nedenfor). Forskellige panning strategier gav forskellige sekvens berigelse mønstre. For eksempel den lette kæde variant klon 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) blev isoleret fra høj stringens panorering men ikke fra lav-stringens panorering, og den tunge kæde variant klon 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) blev også valgt kun fra det høje stringens panorering. Interessant, 59% af unikke antistoffer i 4 ^{th output med lav stringens panorering af L-NNK-biblioteket havde en alanin i stilling 92 L i overensstemmelse med alanin-scanning analyse (Fig 4B).}}

Næsten alle kloner, som blev isoleret fra H-XXS bibliotek havde den samme sekvens ved 97 _{H -100 H som den parentale klon, og viste en tydelig berigelse af Asn-Tyr-sekvens på 95-96. For yderligere at vurdere bidraget af CDR-H3-rester på antigen-antistof-binding, blev en ekstra CDR-H3-bibliotek konstrueret med dobbelte NNK tilfældig codon scanning af CDR-H3 (H-2AA, Fig 4A). I lav-stringens panorering, mutanter i positionerne 95 H, 96 H, 99 H, 100 H, og 100 A H blev udvalgt i første runde panorering, men kun mutanter i position 95 H og 96 H blev beriget i den fjerde runde output (tabel 1). Vi kunne ikke finde mutanterne på positioner Gly97 H og Gly98 H i eventuelle panorering strategier og udgange.}

Affinity og bindende aktivitet af udvalgte kloner

For at vurdere kombinationen effekt de affinitetsmodnede tunge og lette kæder varianter, blev IgG-antistoffer med kombinationer af affinitetsmodnede tunge og lette kæder, og hver k
_{off værdier var fastlægge hjælp SPR analyse (tabel 2). Blandt to lette kæde varianter og to tunge kæde varianter, 1A12 afledt af L-NNK udviste den største forbedring (16 gange). Kombinationen af ​​den lette kæde af 1A12 med den optimerede tunge kæde af klon 1B12 resulterede i en 24-fold forbedring i k
off over forældrenes hz1E11, mens der for de andre kombinationer k
off værdier var lig eller større end 1A12. Fordi 1,5 gange yderligere forbedring af L-1A12 + H-1B12 kombination ikke var signifikant store blev kloner 1A12 og 1F11 (let kæde varianter) valgt til yderligere karakterisering at minimere sekvensforskel af affinitetsmodnede antistoffer fra forældrenes klon. Dissociationskonstanterne for affinitetsmodnede kloner, også bestemt ved SPR analyse var mere end 10 gange lavere end den for den parentale klon hz1E11 og sammenlignes med trastuzumab (tabel 3).}

For at bestemme om affinitet -matured hz1E11 kloner binder til den samme epitop som den parentale hz1E11, bindingen af ​​1A12 og 1F11 til HER2-ECD, der var præ-bundet til hz1E11 blev analyseret ved SPR. Begge kloner var ude af stand til at binde til den monomere HER2-ECD-His protein fanget af immobiliseret 1E11 henviser trastuzumab kunne (Fig 4C). Endvidere blev det bekræftet, at 1A12 epitopen ikke overlapper med den for trastuzumab (Fig 4D). Kloner 1A12 og 1F11 også binde sig til sub-domæne IV ligesom deres forældres klon hz1E11 (Fig 4E). Disse data indikerer, at epitoper af 1A12 og 1F11 ikke blev ændret af affinitet modningsprocessen.

Effekten af ​​affinitet modnet hz1E11 kloner

Både 1A12 og 1F11 antistoffer viste lidt øget anti-proliferative aktiviteter som enkeltstof i forhold til hz1E11 på NCI-N87 og OE-19 mavekræft cellelinjer, overekspression af HER2 (fig 5A og 5B), mens der i kombination med trastuzumab, deres anti-proliferative aktiviteter var bedre end trastuzumab alene og svarer til hz1E11 plus trastuzumab . Den anti-proliferative aktivitet af 1A12 og 1F11 blev bekræftet in vivo
i NCI-N87 xenograftmodel. Superior antitumoraktivitet var tydelig i kombination med trastuzumab til den for alene hver agent i begge xenograftmodeller (Fig 5C).

Diskussion

Trods opmuntrende kliniske resultater opnået med HER2 målrette antistof trastuzumab i behandling af gastrisk kræft, er der stadig behov for mere potente HER2 målrettede behandlinger [6]. Kombination af ikke-konkurrerende antistoffer rettet receptorer, såsom HER2, EGFR, og VEGFR3, kan øge anti-tumor aktivitet i prækliniske modeller [11-13, 28]. Pertuzumab, anden HER2-targeting antistof, er godkendt til brug i kombination med trastuzumab i behandlingen af ​​metastatisk brystkræft [29]. I en tidligere undersøgelse, vi udviklet en ny HER2 målrettet antistof, 1E11, der blev demonstreret at have væsentlig anti-tumor aktivitet som enkeltstof og synergistisk effekt i kombination med trastuzumab in vitro
in vivo
[22]. Anti-tumor aktivitet af 1E11 plus trastuzumab er overlegen, ikke blot at trastuzumab enkelt behandling, men også kombinationen af ​​pertuzumab og trastuzumab. I denne rapport er det humanisering og efterfølgende affinitet modning af muse hybridomafledte 1E11 monoklonalt antistof beskrevet.

De første metoder til at reducere potentiel immunogenicitet ikke-humane variable regioner af CDR-podning til et menneske rammer betydeligt mindske immunogenicitet af terapeutiske antistoffer [15, 17]. Superhumanization hjælp human kimlinje rammer som skabelon er blevet foreslået som en overlegen humanisering metode for at undgå formodede effektor T-celle epitoper, der er afledt af somatiske hypermuations af menneskelig ramme [30-32]. Det er blevet foreslået, at antistoffer kodet af germliniegensegmenterne er strukturelt fleksibel og i stand til at rumme binding til mange forskellige antigener [33-35]. CDR'erne af murint antistof 1E11 samt en rest i Vernier zone V _{H (Ala49 H) blev podet på human kimlinje variable og sammenføjning gener med højeste homologi med den parentale antistof (figur 1). Den resulterende humaniseret antistof, hz1E11 viste næsten identisk affinitet og biologisk aktivitet til den parentale antistof (figur 2).}

Udvælgelse af rester til randomisering er et afgørende skridt i målrettet randomisering tilgang af affinitet modning på grund af de praktiske begrænsninger af antistof bibliotek størrelse og udvælgelseskriterierne teknologier. Alaninscanning og in silico
analyse af antistoffet sekvensen, især i CDR'er, er anvendelige til at vælge randomiseringen målrester og lette modningsprocessen affinitet. I alaninscanning analyse af CDR-H3 af hz1E11, den G98A mutant helt tabt bindende aktivitet og G97A mutant viste reduceret binding aktivitet (figur 3A). Direkte ændring af en væsentlig paratop rest normalt resulterer i det samlede tab af bindingsevne af antistoffet [26, 33, 36]. Derfor blev en mere konservativ tilgang til CDR-H3 randomisering ansat, enten ved hjælp en hånd-blandet oligonukleotid, der er forudindtaget mod forældrenes sekvens, eller twin NNS tilfældige codon scanning af CDR-H3. Som forventet fra alanin-scanning analyse, næsten alle kloner, der blev isoleret fra CDR-H3-biblioteker havde sekvensen 97 _{H-100a H samme som forældrenes klon (G 97HGTAS 100Ah) .}

alaninscanning resultater antyder, at alle CDR-L3-rester kan undværes, selv om nogle af mutationerne forekommer at sænke affinitet (fig 3B). Derfor blev fire positioner af CDR-L3 (91 _{L-94 L) fuldt randomiseret hjælp af NNK degenererede codon. Sekvensen analyse af de udvalgte kloner bekræftede alaninscanning analyse; størstedelen af ​​de udvalgte kloner fra CDR-L3-biblioteket havde alle fire randomiserede CDR-L3 positioner ændret fra den parentale rest, i modsætning til de CDR-H3 optimering resultater, hvor hovedparten af ​​de udvalgte kloner fra bibliotekerne havde samme sekvens som parental hz1E11 i den midterste del af CDR (tabel 1). Klonerne med de fleste affinitetsforbedring kom fra CDR-L3-bibliotek. Det er sandsynligt, at det CDR-H3 af hz1E11 allerede er tæt på optimal og de fleste mutationer, især i regionen 97 H-100 H, er skadelige for bindingsaffinitet, mens CDR-L3 sekvens ikke så optimal og mutationen i denne region kan føre til betydelig forbedring i affiniteten. De L-NNK bibliotek panorering udgange blev beriget med kloner med en hydrofob aminosyre ved position 91 L, en lille aminosyre i 92 L, og en aromatisk aminosyre ved 93 L. Dette mønster er noget anderledes fra forældrenes CDR-L3 sekvens af Q 89LQLYSTPWT 97L og igen tyder på, at CDR-L3 sekvens af forældrenes 1E11 antistoffet var sub-optimale og dermed havde plads til affinitet forbedring.}