PLOS ONE: maturação de afinidade de anticorpo monoclonal 1E11 por Randomization alvejado na CDR3 Regiões Otimiza anticorpo terapêutico segmentação de HER2-positiva Câncer Gástrico

Sumário

anti-HER2 murino 1E11 anticorpo monoclonal tem uma actividade anti-tumoral forte e sinérgica em células gástricas cancerosas que sobre-expressam HER2 quando usado em combinação com trastuzumab. Nós temos presentemente optimizado este anticorpo para terapêutica humana. Em primeiro lugar, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo de ratinho foram enxertadas sobre os genes variáveis ​​de imunoglobulina humana da linha germinal. Não foi observada diferença na afinidade e atividade biológica entre 1E11 quimérico (ch1E11) e 1E11 humanizado (hz1E11). Em seguida, a maturação da afinidade de hz1E11 foi realizada pela randomização dos resíduos de CDR-L3 e H3, seguido de selecção rigorosas bioprospecção. pressão de selecção favoreceu mais suave a selecção de diversos clones de mais, ao passo que mais elevado rigor selecção resultou na convergência da saída de movimento para um número menor de clones com afinidade melhorada. O clone 1A12 tinha quatro substituições de aminoácidos na CDR-L3, e mostrou um aumento de 10 vezes na afinidade em comparação com o clone parental e uma potência aumentada em In vitro
ensaio de actividade anti-proliferativa com cancro gástrico overepxressing-HER2 células. O clone 1A12 inibiu o crescimento tumoral do modelo de xenoenxerto NCI-N87 com uma eficácia semelhante à sozinho trastuzumab, e o tratamento de combinação de 1A12 e trastuzumab completamente removidos os tumores estabelecidos. Estes resultados sugerem que humanizada e maturado por afinidade anticorpo monoclonal 1A12 é uma molécula altamente otimizado para o desenvolvimento terapêutico futuro contra tumores HER2-positivo

Citation:. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et ai. (2015) maturação de afinidade de anticorpo monoclonal 1E11 por Randomization alvejado na CDR3 Regiões Otimiza Therapeutic Antibody Segmentação de HER2-positivo câncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10.1371 /journal.pone.0134600

editor: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, Estados Unidos

Recebido: 14 de abril de 2015; Aceito: 12 de julho de 2015; Publicação: 30 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ko et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

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Financiamento:. Este estudo foi apoiado por AbClon Inc., e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) subvenção para HS para Medicinal Bioconvergence Centro de Pesquisa (NRF-2013M3A6A4044991) . O financiador comercial (AbClon Inc.) forneceu apoio sob a forma de salários para os autores (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, e JSL), mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção "autor contribuições '

Conflito de interesses:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, e JSL são todos empregados por AbClon Inc. e pode possuir a sua estoque. HS está em consultoria pagos aos AbClon Inc. e também possui suas ações. Abclon está buscando patentes e desenvolvimento de produtos em compostos que são mencionados neste artigo. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, e JSL são atualmente empregadas pelo financiador comercial desta pesquisa AbClon Inc. e pode possuir suas ações. HS está atualmente em paga de consultoria para AbClon Inc. e também possui suas ações. AbClon tem uma patente registada na Coreia (KR10-1453462, anticorpos capazes de se ligar especificamente a HER2) e apresentou um pedido de PCT (PCT /KR2014 /004317, anticorpo que se liga especificamente a HER2) em que BKK, YHL, ISH, KTK, e JSL são listados como inventores. AbClon também está buscando o desenvolvimento de produtos sobre os anticorpos humanizados, amadurecido por afinidade que são mencionados neste artigo. Estes não alteram a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Os anticorpos monoclonais são mainstream tratamentos em oncologia e doenças auto-imunes, e espera-se que desempenham um papel importante no futuro tratamento de doença [1, 2]. Mais de 30 anticorpos recombinantes são actualmente aprovado pelos Estados Unidos Food and Drug Administration, dos quais cerca de metade são anticorpos anti-cancro. O câncer gástrico é um dos cancros mais comuns e é a terceira principal causa de morte por câncer em todo o mundo [3]. No cancro gástrico, a sobre-expressão do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (HER2), HER3 e está correlacionada com mau prognóstico [4, 5]. Recentemente, o HER2 segmentação trastuzumab anticorpo monoclonal foi aprovado para o tratamento de câncer metastático junção gástrica e gastroesofágico HER2-positivo com base nos resultados do Trastuzumab com quimioterapia no câncer gástrico (ToGA) ensaio clínico avançado HER2-positivo [6].

combinações particulares de anticorpos mutuamente não competitivos que visam a actividade anti-tumoral mesmo aumento receptor in vitro
e in vivo
. Combinação do HER2 segmentação anticorpos, trastuzumab e pertuzumab, mostra maior eficácia em cânceres de mama HER2-superexpressão [7]. Os benefícios da combinação pertuzumab e trastuzumab foi ainda demonstrada em ensaios pré-clínicos e clínicos [8, 9]. Outros anticorpos de metas de HER2 que mostram melhor eficácia em combinação do que como agentes individuais, e têm mostrado consistente down-regulação dos níveis de HER2 e efeitos de combinação benéficos em modelos de ratos [10]. O aumento da eficácia das combinações de anticorpos também foi demonstrada com os anticorpos de EGFR segmentação [11, 12] e vasculares do receptor do factor de crescimento endotelial 3 (FCEVR3) anticorpos -targeting [13].

terapêuticas tipicamente anticorpos são extensivamente modificadas para possuem propriedades biológicas e físico-químicas desejáveis, tais como baixa imunogenicidade, uma elevada afinidade e especificidade, as funções efectoras óptimas, e uma boa solubilidade e estabilidade [14]. Especialmente, a humanização de anticorpos e maturação de afinidade são dois dos processos de engenharia mais frequentemente aplicados durante o desenvolvimento de candidatos de anticorpos terapêuticos. A imunogenicidade do anticorpo terapêutico limita a utilidade e eficácia clínica pela produção de anticorpos anti-droga [15], e a humanização dos anticorpos de rato ou outras espécies é agora um procedimento padrão para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos. Alguns métodos de humanização foram desenvolvidas abordagens que empregam racional ou empíricos [16]. A região determinante de complementaridade (CDR) de enxerto abordagem como um método para ultrapassar a resposta do anticorpo anti-quimérico humano (HACA) [17] é um método bem estabelecido a humanização. No entanto, a enxertia directa de RDCs de murino para uma sequência aceitadora estrutural humana, muitas vezes resulta numa perda de afinidade, de modo back-mutações de resíduos da região de estrutura (resíduos de Vernier zone) que suportam a estrutura de laços CDR é muitas vezes necessário [18]. Para in vitro
maturação de afinidade, três abordagens de diversificação são normalmente usados: mutagénese ao acaso, por exemplo PCR propensa a erro, randomização de resíduos-alvo usando oligonucleótidos degenerados e rearranjo de cadeias. Na abordagem randomização alvo, CDRs são o alvo lógico para a randomização na maior parte dos casos porque hipermutação somática evoluiu para favorecer mutações em CDRs de anticorpos [19], e CDR-H3 e CDR-L3 tendem a dominar a interacção anticorpo-antigénio [ ,,,0],20]. Um dos principais problemas associados com a randomização alvo é seleccionando as posições que não são essenciais para a ligação ao antigénio, mas que podem melhorar a afinidade quando a substituição óptima de aminoácidos é feita. varrimento de alanina pode ajudar a determinar os resíduos para randomizar, especialmente quando as CDR são longos. Algumas vezes, a própria mutação de alanina aumenta a afinidade de anticorpos [21].

anteriormente desenvolvido um anticorpo murino segmentação HER2 (clone 1E11) que mostra a actividade anti-tumor em combinação sinérgica com trastuzumab em que sobre-expressam HER2 linhas celulares de cancro gástrico [22 ]. Neste relatório, nós descrevemos como nós otimizamos o 1E11 para um anticorpo terapêutico por enxerto de CDR de genes variáveis ​​humana imunoglobulina da linha germinativa e maturação de afinidade através de randomização alvo de CDR-H3 e CDR-L3. O anticorpo 1E11 optimizado (clone 1A12) mostra a actividade anti-tumoral em modelos de xenoenxerto sinérgica cancro gástrico HER2-positivos em combinação com trastuzumab. Observou-se que para o 1E11 clone, os genes variáveis ​​de linha germinal humanos são aceitadores adequados para humanização sem redução de afinidade, e a substituição dos resíduos de CDR-L3 que não são essenciais para a ligação ao antigénio foi suficiente para melhorar a afinidade em mais de 10 vezes.

materiais e Métodos

linhas celulares e materiais

células NCI-N87 foram comprados da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e células OE-19 foram obtidas a partir da Colecção Europeia de Cultura celular (ECACC, Porton Down, Reino Unido). O meio de cultura celular foi RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), e antibióticos e as células foram cultivadas a 37 ° C sob 5% de CO _{2. Trastuzumab e palivizumab foi produzido por Genentech (South San Francisco, CA, EUA) e MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, EUA), respectivamente. IgG humana ChromPure (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA) foi utilizado como anticorpo de controlo de IgG humana para in vitro
ensaios. Os anticorpos IgG foram produzidos utilizando o sistema de Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e purificada utilizando uma proteína de cromatografia de afinidade (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). A endotoxina foi removida com um kit de endotoxina de remoção (GenScript, Piscataway, NJ, EUA), e os níveis de endotoxina foram determinados utilizando um kit de detecção de endotoxina (GenScript). As proteínas recombinantes foram produzidas como proteínas segregadas que utilizam o sistema 293 Freestyle e purificado utilizando proteína A ou cromatograf ia de Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EUA) para Fc-tag ou marcadas com His proteínas, respectivamente.}

mutagénese de varrimento de alanina e purificação de Fab

mutagénese dirigida ao local para o varrimento de alanina foi realizada por mutagénese por PCR utilizando QuickChange site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). proteínas Fab mutantes foram expressas e purificadas para avaliar a importância de cada resíduo de actividade de ligação ao antigénio. Em breve, Escherichia coli
células DH5a transformadas com o vector que alberga genes pComb3X Fab mutantes foram cultivadas a 28 ° C em caldo de SB. A expressão foi induzida com β-D-1-tiogalactopiranosido de isopropilo a 1 mM quando a densidade óptica (600 nm) da cultura atingiu 0,8. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em tampão de extracção frio (120 mM Tris, pH 8,0, EDTA 0,3 mM, e 300 mM de sacarose) e incubou-se em gelo durante 30 minutos para extracção periplasmática. Cloreto de magnésio (2.5 mM) foi adicionado ao extracto clarificado após a centrifugação para eliminar o EDTA livre antes da cromatografia de afinidade de iões metálicos imobilizados (IMAC) purificação. proteínas Fab purificados foram utilizados para ensaio de ligação ELISA e k
_{off análise utilizando ressonância de plasma de superfície (SPR).}

maturação Affinity

humanizado 1E11 clonado no vector pComb3X como formato Fab foi utilizado como molde para a extensão da sobreposição de reacção em cadeia da polimerase (PCR) de mutagénese, conforme descrito anteriormente [23]. Os oligonucleótidos degenerados (ADN tecnologias integradas, Coralville, IA, EUA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(inverso) e 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Para a frente) foram usadas para a L-NNK e H-XXS biblioteca, respectivamente. N indica A, C, G ou T; M representa C ou A; e S é G ou C. posições de bases numeradas indicam nucleótidos mão-misto, composto de 70% de uma base e 10% de cada uma das outras três bases: base de frequência 70% é G, A, T, C e durante 1, 2, 3, e 4, respectivamente. Para a biblioteca H-2AA, foram usadas uma mistura equimolar dos seguintes oligonucleótidos mutagénicos para a frente: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 ', 5'-e GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K indica a G ou T. Após dois ciclos de PCR de extensão de sobreposição, o ADN da biblioteca de Fab com uma CDR ao acaso foi cortado com SfiI, ligados no vector fagemídeo Sfil-digerido pComb3X, e electroporado em E
. coli
estirpe ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA).

ligantes de alta afinidade foram selecionados utilizando proteína HER2-ECD biotinilada solúvel. ligantes esfera foram pré-empobrecido através da incubação da biblioteca de fagos de anticorpos com 100 mL de pré-bloqueado Dynabeads M-280 com estreptavidina (Invitrogen) durante 1 hora com rotação lenta à temperatura ambiente. proteína biotinilada de HER2-ECD (100 NM- 12:01) foi adicionado à biblioteca de anticorpos pré-empobrecido e incubadas durante 1 hora com rotação à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 50 ul de pérolas de estreptavidina-magnético bloqueados e incubados no rotador durante 15 minutos. As pérolas foram lavadas 10 vezes com 1 mL de solução salina tamponada com Tris-Tween 20 (TBST) e duas vezes com 1 mL de PBS. Os fagos ligados foram eluídos por incubação das esferas com 1 mL de trietilamina 100 mM durante 8 minutos, depois, neutralizada com 0,5 mL de 1 M de Tris, pH 7,4.

ELISA teste de actividade de ligação

Os anticorpos foram adicionados para Costar placas de 96 poços (Corning meio da área, Corning, NY, EUA Produto No. 3690) revestidas com 1 ug /ml de antigénio. Após incubação à temperatura ambiente durante 1 hora, as placas foram lavadas três vezes com TBST, e incubado com coelho peroxidase de anticorpo de rábano anti-humano (HRP) (Pierce, Rockford, IL, EUA) para detecção de anticorpos e de rato de IgG anti-HA-HRP (clone F10, Life Science Roche, Basileia, Suíça) para os anticorpos Fab, respectivamente. As placas foram lavadas três vezes, tetrametilbenzidina (TMB) substrato de peroxidase (SurModics, Eden Prairie, MN, EUA) foi adicionado e as reacções foram paradas por adição de 1 N de ácido sulfúrico (DukSan, Ansan, Coreia). Absorvância a 450 nm foi medida utilizando um instrumento Victor X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).

análise de ressonância de plasma de superfície

Para k
_{off análise de proteínas Fab, HER2-ECD-His foi imobilizada na superfície de um chip sensor CM5 (GE Healthcare) utilizando o método de acoplamento de amina a aproximadamente 2.000 unidades de resposta (RU). proteínas Fab purificados foram injectados a 2 ug concentração /mL e um caudal de 50 uL /​​minuto. Para K
fora análise dos anticorpos IgG, de cabra anti-IgG humana (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) foi imobilizado no chip sensor de CM5 utilizando acoplamento de amina, e os anticorpos foram capturados em 1 ug /ml durante 4 minutos e estabilizadas durante 5 minutos a um caudal de 50 uL /​​minuto. HER2-ECD-His proteína foi injectada a uma concentração de 160 nM. Para medições de afinidade, os anticorpos foram capturados em aproximadamente 50 RU de anticorpo de cabra anti-IgG humana (γ) imobilizado num chip CM5. HER2-ECD-His proteína foi injectada em concentrações que variam de 0 a 640 nM. Sensorgramas foram obtidos para cada concentração e avaliados utilizando o software BIAevaluation. Para binning epitopo, IgG forma de hz1E11 foi imobilizada em CM5 superfícies chip sensor separados em aproximadamente 1000 unidades de resposta. HER2-ECD-His (320 nM) e anticorpos (1 ug /mL) foram adicionadas sequencialmente durante 4 minutos e estabilizadas durante 5 minutos a um caudal de 50 uL /​​minuto.}

A viabilidade celular ensaio

as células foram semeadas em placas de 96 poços (Corning) em FBS 10% e contendo meio pré-cultivadas durante 24 horas. As células foram tratadas com os anticorpos nas concentrações indicadas e cultura durante 4 dias. Reagente WST-1 (Dogen EZ-Cytox; Daeil Serviço Lab, Seul, Coreia) foi utilizado para medir a viabilidade celular. viabilidade celular relativa foi calculada dividindo-se a absorvância de cada poço pela absorvância média dos poços tratados com PBS em cada prato.

estudo Xenoenxerto

camundongos fêmeas atímicos (Daehan Biolink, Chungbuk, Coreia ) foram injectados por via subcutânea na área do flanco esquerdo com 5 x 10 ^{6 de células NCI-N87 em Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Os tumores foram deixados crescer até cerca de 200 mm 3 em tamanho, e os ratinhos foram depois divididos aleatoriamente em grupos. Os animais receberam a administração intraperitoneal de anticorpos nas doses indicadas, duas vezes por semana. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula (L x W x W) /2, onde L representa o maior diâmetro do tumor e W representa o diâmetro menor tumor. Two-way ANOVA de medidas repetidas seguido de Bonferroni pós-teste foi realizado para a análise estatística dos estudos com animais growth.All tumorais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do "Guia para o Cuidado e Uso de Animais" do NIH e um protocolo aprovado recebido pela Comitê animal Care Instituição e Uso da empresa.}

resultados

Humanização do 1E11 conduzido por enxerto de CDR de genes da linha germinativa humana

para desenvolver o anticorpo humanizado, o VH e VL sequências do murino 1E11 foram comparados com repertórios de linha germinal humana V e J gene usando /ferramentas de análise de V-QUEST IMGT [24]. Para a cadeia pesada, IGHV3-48 * 03 e * 01 IGHJ4 exibiu a mais alta homologia com os homólogos 1E11, partilha 85% de identidade e 87%, respectivamente. Para a cadeia leve, humanas IGKV1-39 * 01 e * 01 IGKJ1 genes apresentado identidade de 80% e 81%, respectivamente. Estes genes humanos foram seleccionados como sequências aceitadoras para o enxerto das CDR murinas. Entre a zona de Vernier, que consiste nos resíduos da região de estrutura que estão envolvidos na apresentação de estruturas de CDR, apoiando a ansas CDR [18, 25], apenas um resíduo na posição 49 _{H de cadeia pesada diferiram entre murino e sequências humanas. Consequentemente, humanizado 1E11, hz1E11, tem apenas um resíduo de murino nas regiões de estrutura (Fig 1).}

A actividade de ligação de hz1E11 a região extracelular (ECD) de HER2 foi equivalente à de ch1E11 (Fig 2A), e a afinidade de trastuzumab, ch1E11, e hz1E11 foi 3 nM, 23 nM e 23 nM, respectivamente. Nós também confirmou que hz1E11 obrigado a sub-domínio IV como o ch1E11 parental. Trastuzumab também se liga ao sub-domínio IV [26]. In vitro
actividades anti-proliferativas de hz1E11 como um agente único ou em combinação com trastuzumab também foram equivalentes aos dos ch1E11 (Fig 2C). No estudo anterior [22], foi relatado que tinha ch1E11 In vivo
actividade antitumoral comparável à da trastuzumab como um agente único, e a combinação de ch1E11 e trastuzumab resultou no índice de regressão do tumor (TGI) de 95,1%. Da mesma forma, hz1E11 como um único agente tinha semelhante In vivo
actividade anti-tumoral para o trastuzumab (Fig S1) e a combinação de hz1E11 com trastuzumab também mostrou actividade anti-tumor dependente da dose no modelo de xenoenxerto de NCI-N87 rato ( Figura 2D). Anticorpo tratamento de combinação de 1 mg /kg de cada um dos hz1E11 e trastuzumab resultou em actividade anti-tumoral semelhante com trastuzumab tratamento único de 10 mg /kg, e na combinação de 2,5 mg /kg e acima do tumor estabelecido estabilizado ou começou a regredir (n estatisticamente foi observado entre 2,5, 5 e 10 mg /kg combinações); diferença significativa [0,05 P Art <]. Estes resultados mostram que hz1E11 tem a afinidade e a actividade biológica equivalente a ch1E11, e que hz1E11 aumenta a actividade anti-tumoral de trastuzumab, quando usado em combinação.

varrimento de alanina das CDR-H3 e CDR-L3

para identificar os resíduos críticos para a interacção antigénio-anticorpo, mutagénese de varrimento de alanina foi realizada nas regiões CDR3 de cadeias pesadas e leves (CDR-H3 e CDR-L3). Os efeitos das mutações foram avaliadas por análise da actividade de ligação das proteínas purificadas de Fab por ELISA indirecta. Em CDR-H3, substituição de alanina na posição Gly98 _{H aboliu a ligação do Fab de HER2, e G97 HA e T99 mutantes HA mostrou reduzida actividade de ligação (Fig 3A). Em CDR-L3, as substituições de alanina tiveram efeitos muito menores (Fig 3B). O k
off valores de mutantes de varrimento de alanina foram analisados ​​usando SPR contra a proteína HER2-ECD immbolized. Nós confirmamos que o mutante G98A cadeia pesada completamente perdido actividades de ligação, ea vizinha T99 HA e G97 mutantes HA resultou em de 32 vezes e 17 vezes maior k
off valores , respectivamente (Fig 3C). Estes resultados indicam que a cadeia pesada Gly98 H é crítica e funcionalmente dos seus resíduos adjacentes, também são funcionalmente importantes para a interacção antigénio-anticorpo.}

maturação de afinidade de hz1E11

maturação de afinidade de hz1E11 foi conduzido por a construção de cadeia pesada ou leve variante bibliotecas CDR3, seguida por selecção do equilíbrio das bibliotecas de anticorpos em fagos. Para a cadeia leve, os resíduos de glutamina na posição 89 _{L e 90 L foram não diversificada porque a glutamina é vulgarmente encontrado nestas posições de sequências de nove aminoácidos de longCDR-L3 em 59% e 73% frequências, respectivamente [ ,,,0],27]. Posições 91 L-94 L foram randomizados usando um códon NNK degenerada (L-NNK). Para a cadeia pesada, as posições 95 H -100 H foram aleatorizados usando um codão XXS (H-XXS), concebido de modo que as primeira e segunda posições de nucleótido do codão diversificada a base do tipo selvagem com 70 ocorreu % acaso, cada uma das outras três bases ocorreu em 10% de frequência, e os terceiros letras dos codões foram sintetizados usando uma mistura equimolar de L e C (Figura 4A). ligantes de alta afinidade foram seleccionados a partir de elevado rigor ou baixo rigor panning (Tabela 1).}

Em comparação com a baixa restringência panning da biblioteca NNK-L em que 100% do segundo, terceiro, e clones de saída quarta rodada pesquisados ​​foram ELISA positivo, para a alta severidade deslocar a saída de quarta rodada não rendeu nenhuma pasta em tudo, e apenas um terço dos clones de saída na terceira rodada foram ELISA positivo (Tabela 1). Os clones seleccionados a partir da biblioteca de CDR-L3 incluídos muitas sequências que tinham todas as quatro posições CDR-L3 randomizados mutada, ao contrário de bibliotecas de CDR-H3 a partir do qual a maior parte dos clones seleccionados retidos a sequência de tipo selvagem nas posições 97 _{H -100 H (ver abaixo). Diferentes estratégias de panning produziu diferentes padrões de enriquecimento sequência. Por exemplo, o clone variante de cadeia leve 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) foi isolado a partir do alto rigor panning, mas não a partir do baixo rigor panning, ea pesada clone variante de cadeia 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) também foi selecionado apenas do alto rigor panning. Curiosamente, 59% dos anticorpos únicos em 4 ^{th saída com visão panorâmica da biblioteca de L-NNK baixo rigor teve uma alanina na posição 92 L, de acordo com a análise de varrimento de alanina (Fig 4B).}}

Quase todos os clones que foram isolados a partir da biblioteca de H-XXS tinham a mesma sequência de 97 _{H -100 H como o clone parental, e mostrou um enriquecimento claro de sequência Asn-Tyr na 95-96. Para avaliar ainda mais a contribuição dos resíduos de CDR-H3 a ligação antigene-anticorpo, uma biblioteca adicional de CDR-H3 foi construído com NNK duplo codão de varrimento aleatório de CDR-H3 (H-2AA, Fig 4A). Em baixo rigor panning, mutantes nas posições 95 H, 96 H, 99 H, 100 H, e o artigo 100º H foram selecionados no panning primeira rodada, mas apenas mutantes nas posições 95 H e 96 H foram enriquecidos na saída quarta rodada (Tabela 1). Não foi possível detectar os mutantes em posições Gly97 H e Gly98 H em todas as estratégias e saídas panning.}

Afinidade e atividade de ligação de clones selecionados

Para avaliar o efeito da combinação as variantes de cadeia pesada e leve amadurecido por afinidade, anticorpos IgG com combinações de cadeias pesada e leve amadurecido por afinidade foram produzidas e sua K
_{fora valores eram determinar usando análise de SPR (Tabela 2). Entre duas variantes de cadeia leves e duas variantes de cadeia pesada, 1A12 derivada a partir da L-NNK apresentou a maior melhoria (16 vezes). A combinação da cadeia leve de 1A12 com a cadeia pesada otimizada do clone 1B12 resultou em uma melhoria de 24 vezes em k
off sobre o hz1E11 parental, enquanto que para as outras combinações do k
off valores foram semelhantes ou até maiores do que a de 1A12. Uma vez que a melhoria adicional de 1,5 vezes pela combinação de L-1A12 + H-1B12 não foi significativamente grande, os clones 1A12 e 1F11 (variantes de cadeia leve) foram escolhidos para posterior caracterização para minimizar a diferença na sequência dos anticorpos maturados por afinidade a partir do parental clone. As constantes de dissociação para os clones maturados por afinidade, também determinado por análise de SPR, foram mais de 10 vezes mais baixa do que a do clone parental e hz1E11 comparável à de trastuzumab (Tabela 3).}

Para determinar se a afinidade os clones hz1E11 -matured se ligam ao mesmo epitopo como o hz1E11 parental, a ligação de 1A12 e 1F11 para o HER2-ECD que foi pré-ligado a hz1E11 foi analisada por SPR. Ambos os clones foram incapazes de se ligar ao monomérica de HER2-ECD-His capturado por 1E11 imobilizado enquanto que o trastuzumab poderia (Figura 4C). Para além disso, confirmou-se que o epitopo 1A12 não se sobrepõe com o do trastuzumab (Fig 4D). Clones 1A12 e 1F11 também se ligam a sub-domínio IV como seu parental hz1E11 clone (Fig 4E). Estes dados indicam que epitopos de 1A12 e 1F11 não foram alteradas pelo processo de maturação de afinidade.

Eficácia de afinidade maturada clones hz1E11

Ambos 1A12 e 1F11 anticorpos mostraram ligeiramente aumento das atividades anti-proliferativa como um agente único em comparação com hz1E11 em NCI-N87 e OE-19 linhas celulares de cancro gástrico que sobreexpressam HER2 (Fig 5A e 5B), enquanto que em combinação com trastuzumab, as suas actividades anti-proliferativas foi superior ao que o trastuzumab sozinho e equivalente a hz1E11 mais trastuzumab . A actividade anti-proliferativa de 1A12 e 1F11 foi confirmado in vivo
no modelo de xenotransplante NCI-N87. actividade anti-tumoral superior foi evidente em combinação com trastuzumab para o de cada agente por si só, em ambos os modelos de xenoenxerto (figura 5C).

Discussão

Apesar encorajando resultados clínicos obtidos com o anticorpo trastuzumab HER2 segmentação no tratamento do cancro gástrico, ainda há necessidades para HER2 alvo terapias mais potentes [6]. Combinação de anticorpos não concorrentes como alvo os receptores HER2, tais como, o EGFR, e VEGFR3, pode aumentar a actividade anti-tumoral em modelos pré-clínicos [11-13, 28]. Pertuzumab, um outro anticorpo de direccionamento HER2, está aprovado para utilização em combinação com trastuzumab no tratamento do cancro metastático da mama [29]. Em um estudo anterior, desenvolvemos um romance HER2 alvo de anticorpos, 1E11, que foi demonstrado ter actividade antitumoral significativa como um agente único e efeito sinérgico em combinação com trastuzumab in vitro
e in vivo
[22]. A actividade anti-tumoral do 1E11 mais a combinação é superior trastuzumab, não só para o trastuzumab tratamento único, mas também para a combinação de pertuzumab e trastuzumab. Neste relatório, é descrito a humanização e afinidade subsequente maturação do anticorpo monoclonal 1E11 derivado de hibridoma mouse.

abordagens iniciais para reduzir o potencial imunogenicidade de regiões variáveis ​​não-humanos por enxerto de CDR em uma estrutura humana diminuir significativamente a imunogenicidade de anticorpos terapêuticos [15, 17]. Superhumanization utilizando estruturas da linha germinativa humana como molde tem sido proposto como uma metodologia humanização superior a evitar epítopos de células T efectoras por derivados putativo hypermuations somáticas de estrutura humana [30-32]. Tem sido sugerido que os anticorpos codificados por segmentos de genes da linha germinal estão estruturalmente flexível e capaz de acomodar a ligação a muitos antigénios diferentes [33-35]. Os CDRs de 1E11 anticorpo murino, assim como um resíduo na zona de Vernier de V _{H (Ala49 H) foram enxertados na variável da linha germinal humana e juntando os genes com maior homologia com o anticorpo parental (Fig 1). O anticorpo humanizado resultante, hz1E11, mostrou afinidade praticamente idêntica e actividade biológica do anticorpo parental (Fig 2).}

Selecção de resíduos para a randomização é um passo crítico na abordagem orientada randomização de maturação por afinidade, devido às limitações práticas tamanho de biblioteca de anticorpos e as tecnologias de selecção. varrimento de alanina e in silico
análise da sequência do anticorpo, especialmente em CDR, são úteis para a selecção dos resíduos alvo de aleatorização e facilitar o processo de maturação de afinidade. Na análise de varrimento de alanina de CDR-H3 de hz1E11, o mutante G98A completamente perdido atividade de ligação e o mutante G97A mostraram redução da atividade de ligação (Fig 3A). alteração directa de um resíduo paratopo essencial normalmente resulta na perda total da capacidade do anticorpo [26, 33, 36] de ligação. Por isso, foi utilizada uma abordagem mais conservadora para CDR-H3 randomização, utilizando um oligonucleotídeo mão-misturado que está inclinado para a sequência parental, ou o gêmeo NNS digitalização códon aleatória de CDR-H3. Como esperado a partir da análise de varrimento de alanina, quase todos os clones que foram isolados a partir das bibliotecas de CDR-H3 tinha a sequência 97 _{H-100A H mesmo que o clone parental (L 97HGTAS 100Ah) .}

a alanina resultados da verificação sugere que todos os resíduos de CDR-L3 são dispensáveis, embora algumas das mutações parece diminuir a afinidade (Fig 3B). Portanto, quatro posições da CDR-L3 (91 _{L-94 L) foram totalmente distribuídos aleatoriamente usando o códon NNK degenerada. A análise da sequência dos clones seleccionados confirmou a análise de varrimento de alanina; a maioria dos clones seleccionados a partir da biblioteca de CDR-L3 tinha todas as quatro posições CDR-L3 randomizados alterado a partir do resíduo parental, ao contrário dos resultados da optimização de CDR-H3 em que a maior parte dos clones seleccionados a partir de bibliotecas tiveram a mesma sequência que o hz1E11 parental na parte do meio da CDR (Tabela 1). Os clones com maior melhoria de afinidade veio a partir da biblioteca de CDR-L3. É provável que a CDR-H3 de hz1E11 já está próxima do ideal e a maioria das mutações, especialmente na região 97 H-100 H, são prejudiciais para a afinidade de ligação, enquanto que a sequência CDR-L3 não está como óptima e a mutação nesta região podem resultar em melhoria significativa na afinidade. As saídas de panning da biblioteca L-NNK foram enriquecidos com clones com um aminoácido hidrófobo na posição 91 L, um aminoácido pequeno, com 92 L, e um aminoácido aromático em 93 L. Este padrão é um pouco diferente da sequência parental CDR-L3 de Q 89LQLYSTPWT 97L e novamente sugere que a sequência CDR-L3 do anticorpo 1E11 parental foi sub-óptima e, portanto, tinha um quarto para a melhoria de afinidade.}