PLoS ONE: skaičiavimo metodas prognozuojant šalinimo baltymų ir taikymo identifikavimo skrandžio vėžio žymenų šlapime

Abstract

pateiktas Naujų skaičiavimo metodas prognozuojant baltymų išsiskiria su šlapimu. Metodas yra pagrįstas dėl skiriamųjų funkcijų sąraše tarp baltymų, rastų sveikų žmonių ir baltymų kaip manoma, nėra šlapimo ekskrecinis šlapime identifikavimo. Šios savybės yra naudojami mokyti klasifikatorių atskirti dviejų klasių baltymų. Kai naudojamas kartu su informacijos, kurią baltymai yra skirtingai, išreikštą apkrėstų audinių tam tikros rūšies , lyginant su
kontrolės audinių, šis metodas gali būti atliekami, siekiant numatyti galimas šlapimo žymekliai ligos. Čia mes pranešti išsamią algoritmą šio metodo ir paraišką nustatymo šlapime žymekliai skrandžio vėžio. Iš apmokyti klasifikatorių apie 163 baltymų pasirodymas buvo eksperimentiškai patvirtinti naudojant antikūnų matricos, pasiekti > 80% tiesa, teigiamas kursas. Taikant klasifikatorių ant diferencijuotai išreikštų genų skrandžio vėžio, vs
normaliomis skrandžio audinių, buvo nustatyta, kad endotelio lipazės (EL) buvo iš esmės slopino šlapime mėginiais 21 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams , palyginti
21 sveiki asmenys. Apskritai, mes parodėme, kad mūsų prognozuoti šlapimo ekskreciniais baltymų yra labai veiksminga ir potencialiai galėtų būti galingas įrankis paieškų ligų biologinių žymenų šlapime apskritai

nurodomoji dalis:. Honkongas AP Cui J Ni Z S Y, Puett D, Li F, ir kt. (2011) skaičiavimo metodas prognozuojant šalinimo baltymų ir taikymo identifikavimo skrandžio vėžio žymenų šlapime. PLoS ONE 6 (2): e16875. Doi: 10,1371 /journal.pone.0016875

redaktorius: Vladimiras Brusic Dana-Farber vėžio institutas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo rugsėjo 22, 2010; Priėmė: Gruodžio 31 ", 2010; Paskelbta: Vasario 18, 2011

Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Visuomenės Domenų deklaraciją, kurioje nurodoma, kad, patekęs į viešo požiūriu, šis darbas gali būti laisvai kopijuojami, platinti, perduoti, keisti, pastatytas ant, ar jos kitaip nenaudojamos niekam bet kuriam teisėtam tikslui

finansavimas:. Šis tyrimas buvo iš dalies remiamą nacionalinio mokslo fondo (CCF-0.621.700, DBI0542119004, 1R01GM075331), Jilin universiteto, universitetas Gruzijoje, Gruzija vėžio koalicija, Gruzijos mokslinių tyrimų sąjunga ir Nacionalinė sveikatos institutų (1R01GM075331, DK69711). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

greitas paaukštinimas, omic
metodai pastaraisiais metais tapo įmanoma ieškoti biologinių žymenų dėl konkrečių ligų sistemingai ir visapusiškai, kuri iš esmės pagerinti mūsų gebėjimą aptikti ligas ne Ankstyvosiose stadijose. Dauguma ankstesnių žymenų tyrimai buvo sutelktas į žymenų kraujo serume [1], ypač dėl to, kad žinomas turtingumą serume, kurių sudėtyje signalus dėl įvairių fiziologinių ir patofiziologinių sąlygomis.

Palyginti su žymekliais serumo, esamų šlapimo žymekliai dažniausiai susijusi su šlapimo trakto arba glaudžiai susijusių ligų. Tik per pastaruosius kelerius metus pagerėjo proteominiai analizė šlapimo mėginių parodė, kad, pavyzdžiui, serumais, šlapimas taip pat turtingas informacijos šaltinis aptikti žmogaus ligų, tokių kaip graft- versus pervežimas -host ligos ir širdies vainikinių arterijų ligos [2], [3], [4]. Atkreipkite dėmesį, kad šlapimas yra suformuotas nufiltravus kraujas teka pro inkstus; taigi kai kurie kraujo baltymai gali praeiti per filtrus ir būti išskiriamas į šlapimą. Kaip rezultatas, šlapimo takų baltymai ne tik atspindi inkstų sąlygas ir urogenitalinio, bet taip pat ir kitų organų, kurie gali būti distalinio iš inkstų, kaip ne mažiau kaip 30% iš šlapimo baltymų yra ne iš pradžių iš urogenitalinės sistemos [5], [6]. Informacijos šlapime gausybė daro jį patraukliu šaltinis žymenų tikrinimo, nes, palyginti su serumu, šlapimo sudėtis yra palyginti paprasta, ir šlapimo kolekcija yra lengviau ir neinvazinis [7], [8].

Žymeklis identifikavimo šlapime potencialiai gali būti daroma per lyginamųjų proteominius analizės šlapimo mėginiuose pacientams, sergantiems tam tikros ligos ir kontrolines grupes. Į tokių paieškų šlapimo žymekliai iššūkis aklas mados yra dvejopas. (A) Šlapimo gali turėti daug baltymų /peptidų (priešingai nei ankstesnio supratimo [8]) su santykinai žemos gausa. (B) dinaminis diapazonas šių baltymų gausa gali apimti keletą eilėmis, platesnes nei diapazone paprastai teikiamos pagal masės spektrometru [9]. Dėl šių priežasčių, lyginamąsias analizes, ypač (pusiau) Kiekybiniai tyrimai, kurių proteominius duomenimis šlapimo mėginiuose gali būti labai sudėtinga. Tai gali būti pagrindinė priežastis, kad nėra patikimų šlapimo žymekliai vėžio diagnozę.

Mūsų tyrimas dėmesys skiriamas plėtros skaičiavimo metodas tiksliai prognozuoti baltymų, kurie yra šlapimo Šalinimo (žr 1 pav už požiūrį metmenų ). Šie baltymai turi specifinių savybių, kurios leidžia jiems būti išskiriami iš ląstelių ir tada turi būti filtruojamas pro glomerulas membrana inkstus. Neseniai PROTEOMIKOS tyrimas nustatė, kad daugiau nei 1500 baltymus /peptidus, kurie išskiriami į šlapimą per sveikų glomerulų membranas [8]. Naudojant šią baltymų ir baltymų nelaikomi šlapimo šalinimo rinkinį, mes nustatėme tam atskirti funkcijas tarp šių dviejų klasių baltymų sąrašą ir apmokyti parama vektoriaus mašina (SVM), remiantis klasifikatorių numatyti, ar tam tikras baltymas gali būti išskiriamas į šlapimą , Prognozuojama metodas buvo eksperimentiškai patvirtinti naudojant antikūnų masyvus kartu su Vakarų dėmės, ir rezultatai yra labai džiuginantys.

klasifikatorius buvo taikoma prognozuoti baltymus, kurie gali būti išskiriamas į šlapimą, remiantis nustatytais skirtingai išreikštas genų skrandžio vėžio , palyginti
pagalbos skrandžio audiniai; ir buvo nustatyta keletas potencialių šlapimo žymekliai skrandžio vėžiu skaičius. Pagrindinis indėlis į šį darbą yra tai, kad ji suteikia naują ir efektyvų būdą nukreipti PROTEOMIKOS studijas šlapime rodo kandidatas baltymus žymenis, todėl leidžia tikslingai žymeklių paieškas naudojant antikūnų sukeltos metodus, pavyzdžiui, Vakarų dėmės ir Elisa, kurie yra iš esmės labiau tikėtinas nei didelio masto lyginamieji proteominiai analizė šlapimo mėginių be jokių tikslų, su kuriais dirbti. O ši prognozė programa buvo taikoma skrandžio vėžio duomenų šiame tyrime, ne skrandžio vėžys-specifinė informacija buvo naudojamas šioje programoje; taigi, jis gali būti naudojamas šlapimo žymeklių ieško kitų ligų

metodai

Šis tyrimas susideda iš trijų pagrindinių dalių:. (i) statybai, skirtas numatyti šlapimo ekskreciniais baltymų klasifikatoriuje; (II) vertinimas klasifikatoriaus našumą, ją taikant baltymų, dėl kurių Šalinimo statusas baltymų yra žinomas rinkinį; ir (iii) taikant patvirtintą klasifikatorių į genų ekspresijos duomenimis skrandžio vėžio įrodyti savo veiksmingumą sprendžiant šlapimo žymeklis identifikavimo problema.

Šis tyrimas buvo patvirtinta Gruzijos universiteto institucinės ekspertizės valdyba, Atėnai, Džordžija, Jungtinės Amerikos Valstijos (Prezidento kanceliarija pavaduotojas mokslinių tyrimų DHHS užtikrinimo ID NO. FWA00003901, projekto numeris 2009-10705-1) ir Kinijos institucinis ekspertizės valdyba prižiūrėti žmogaus objektus prie Jilin universiteto medicinos koledžo, Changchun, Kinija. Sutikimo formą, kurią IRB patvirtino Gruzijos ir Kinijos IRB universiteto, buvo surinkta iš kiekvieno dalyko. Visi dalykai yra žinoma, kad bet kokie duomenys iš tyrimų gali būti naudojamas dokumentuose ar leidiniuose kaip nurodyta sutikimo forma.

a. Algoritmas prognozuoti šalinimo baltymus

bendras supratimas baltymų išsiskyrimą iš audinių šlapime yra tai, kad kai kurie baltymai išskiriami ar nutekėjo iš ląstelių į kraujotaką, tada iš šių baltymų dalis, kartu su kai gimtoji baltymų kraujas, gali būti išskiriamas į šlapimą. Mūsų tikslas yra pirmą kartą nustatyti skiriamieji bruožai tokių šlapimo ekskreciniais baltymų ir tada statyti klasifikatorių remiantis šių funkcijų nuspėti, kurios baltymų ląstelių gali būti išskiriamas į šlapimą. Kiek mums žinoma, nebuvo bet paskelbti darbai siekiama išspręsti šią problemą. Į turintys tokią galimybę svarba yra ta, kad ji suteikia veiksmingą nuorodą jungiantis omic
analizė audinių žymeklio paiešką šlapime teikiant kandidates žymekliai šlapime, kad gali būti tiriamas naudojant antikūnų grindžiamus metodus.

pirmasis žingsnis kuriant tokį nuspėjimo galimybes, ty, klasifikatorių, yra turėti mokymo rinkinį, kuriame yra baltymų, kurie gali ir kurie negali būti išskiriamas į šlapimą, kuriais remiantis galėtų būti nustatyti tam tikri skiriamieji bruožai rinkinys. Laimei, mes turime rasti vieną didelę proteo rinkinį šlapimo mėginių iš sveikų žmonių neseniai paskelbtą tyrimą [8], kuriame yra daugiau nei 1500 unikalių baltymų, iš kurių 1313 turi SWISSPROT stojimo ID. Mes naudojome šias 1,313 baltymų, kaip teigiamus mokymo duomenimis į-bus apmokyti klasifikatorių. Tokia tvarka tada buvo naudojamas generuoti neigiamą mokymo rinkinį: pasirinktinai pasirinkti bent vieną baltymą iš kiekvienos Pfam šeimos, kad nėra jokių teigiamą mokymo duomenis, ir pasirinktų baltymų iš kiekvienos šeimos skaičius yra proporcingas šeimos dydžiu [ ,,,0],10], [11]. Kaip rezultatas, 2,627 baltymai buvo pasirinktas ir naudojamas kaip neigiama mokymo rinkinys.

išnagrinėjo 18 fiziniai bei cheminiai funkcijas skaičiuojamas nuo baltymų sekų, kurios yra potencialiai naudinga klasifikavimo problema, remiantis bendrą supratimą apie šlapimo išsiskyrimą baltymų , Iš 18 funkcijų ir kompiuterines programas jiems apskaičiuoti naudojamos detalės yra įtrauktos į S1 lentelėje. Kai kurie iš šių funkcijų yra atstovaujama keliais yra: vertybių, pvz, amino rūgščių sudėtis į baltymų sekos yra atstovaujama 20 yra: verčių; Apskritai 18 funkcijų yra atstovaujama naudojant 243 vaidybinius vertybes. Mes tada nustatė funkcijų reikšmių iš 243, kurie gali atskirti teigiamas ir neigiamas mokymo duomenų, naudojant SVM-paremtą klasifikatorių poaibis. RBF branduolys buvo naudojamas mūsų SVM mokymo, atsižvelgiant į jo galimybes dirbti netiesines savybes [12], [13].

Jei išsiaiškinti, kuris iš pradžių laikytas funkcijos yra iš tikrųjų naudinga, funkcija parinkimas numatytas įrankis į LIBSVM [12] buvo naudojamas pasirinkti išrankiausių funkcijų tarpe 243. Kiti funkcija atrankos įrankius galėtų būti naudojama, tačiau turime nemažą patirtį naudojant šią priemonę ir nustatė, kad jis būtų tinkamas. Kodai, naudojami šiame yra viešai prieinami iš LIBSVM svetainėje (http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm/); mes taip pat padarė atitinkamą programą prieinamą ne http://seulgi.myweb.uga.edu/files. F-rezultatas [12], kuris apibrėžiamas taip, naudojamas išmatuoti reiklų galią kiekvieną funkciją vertės mūsų klasifikavimo problema,

kur kalbama apie mokymą yra: vertybėmis (K = 1, ..., m); N
<sub>+ ir N
- yra baltymų skaičius teigiamas (+) ir neigiamo (-) mokymo rinkinys, atitinkamai; ,, Yra vidurkių Aš
oji funkcija vertę visoje mokymo rinkinį, teigiamas rinkinį ir neigiamo rinkinį, atitinkamai; ir ir yra Aš
oji funkcija K
oji baltymų teigiamus ir neigiamus mokymo duomenų, atitinkamai. Paprastai, tuo didesnis F-balas, tuo labiau skiriamasis atitinkama funkcija yra. Mūsų atrankos, visos funkcijos F-taškų viršija iš anksto pasirinkta riba buvo saugomi ir naudojami mokant galutinę klasifikatorių. Norėdami rasti optimalų F rezultatą slenkstį, mūsų nuomone, galimų ribų sąrašą ir tada parinkti geriausią remiantis mokymo rezultatus.</sub>

Mūsų SVM pagrindu klasifikatoriaus apmokymas atliekamas naudojant standartinę procedūrą, numatytą LIBSVM [12] rasti vertės dviejų parametrų , C parsisiųsti ir γ, kad duoti optimalų klasifikaciją mokymo duomenų, kai , C
kontroliuoja kompromisą tarp mokymo klaidas ir klasifikavimo maržų, o γ nustato branduolio naudotų [12] plotį. Mūsų mokymo procedūra apibendrinti taip [12]:

Gauti F-rezultatą kiekvieną funkciją vertę;

Už kiekvienas iš anksto atrinktų ribas, atlikite šiuos veiksmus

Pašalinti funkcija vertės F-taškų mažesnis nei nustatyta riba;

atsitiktinai padalinti mokymo duomenis į pietus mokymo ir sub-tvirtinimo komplektai su vienodo dydžio;

Train žinutę SVM su RBF branduolio ant sub-mokymu ieškoti optimalių reikšmių C
ir gama, o tada taikyti jį į sub-patvirtinimo duomenis ir apskaičiuoti klasifikavimo klaida;

Pakartokite žingsnius (i) - (III) penkis kartus ir apskaičiuojamas vidutinis patvirtinimo klaidą;

Pasirinkite šią ribą, kuri suteikia mažiausią vidutinės patvirtinimo klaidą, ir išlaikyti savybes su F-taškų virš pasirinkto ribos; ir

perkvalifikuoti žinutę SVM remiantis pasirinktų funkcijų, kaip galutinio klasifikatorių.

B. Duomenis, naudojamus siekiant įvertinti klasifikatorius
našumą

nepriklausoma duomenų rinkinys buvo naudojamas įvertinti apmokyti klasifikatorių, kurių Šalinimo statusas kiekvieno baltymo yra žinomas efektyvumą. Teigiamas sutrumpinti šį rinkinį yra 460 žmogaus baltymų rastus sveikų asmenų šlapime trys šlapimo proteomikai tyrimų [14], [15], [16], ir neigiamas poaibis yra 2,148 baltymus pasirinkti naudojant aprašyta anksčiau ta pati procedūra, bet daro nesutaptų su neigiamu rinkinys naudojamas mokymo

buvo naudojamos šios priemonės vertinti klasifikavimo tikslumas. jautrumas, specifiškumą, tikslumą, kad Mato koreliacijos koeficientas, o AUC [17]. 1 lentelėje apibendrinta klasifikavimo tikslumas apmokyto klasifikatoriaus iš abiejų mokymo ir bandymų duomenų rinkinius [17]. Nuo klasifikavimo tikslumas dėl dviejų duomenų rinkinių, mes tikime, kad mūsų kvalifikuoti klasifikatorius perimta pagrindinius skirtingas savybes ekskreciniais baltymų šlapime.

Be to, mūsų klasifikatorius buvo išbandyta ant atskiro rinkinį, iš 274 pogrupyje baltymai, fiksuotų ant gatavų baltymų antikūnų masyvo (toliau RayBio žmogaus G-serijos masyvas 4000 (RayBiotech, Inc., Norcross, GA)). Iš 274 baltymų, 111 yra žinoma, kad Šalinimo ir buvo įtrauktas į mūsų mokymo ar nepriklausomoje bandymų rinkinį. Mes taikė klasifikatorių dėl likusių 163 baltymų, dėl kurių Šalinimo statusas buvo nežinoma (žr rezultatai ir lentelė S2),. Šis baltymas matrica suteikia santykinį ekspresijos lygį kiekvienam baltymų dėl masyvo, jeigu bandymas atliekamas (šlapimo) bandinio, kuris po nustatomą pagal signalo intensyvumo, kiekybiškai įvertinti taikant densitometrija. Masyvo fono buvo naudojamas kaip valdymo pulte, kad nustatyti faktinę buvimą baltymo į (šlapimo) mėginio. Signalas intensyvumas baltymo buvo laikomas tikru signalu, jei jis buvo bent 5 kartus didesnis nei kontrolės, kaip siūlė gamintojo rekomendaciją. Aptarėme mūsų eksperimentinį patvirtinimą apie patvirtinantis teigiamų prognozių tik, nes ji yra beveik neįmanoma įrodyti baltymą neatvyksta į šlapimo mėginį dėl apribojimų aptikimo jautrumą dabartinės technologijos, kai baltymai yra labai mažos koncentracijos mėginyje.

c. Šlapimo mėginio surinkimo /paruošimas

Šlapimo mėginiai iš skrandžio vėžiu sergančių pacientų ir sveikų buvo renkami ne medicinos mokyklos Jilin universitetas, Changchun, Kinija. Skrandžio vėžiu pacientams, PSO mėginiai buvo surinkti, yra visi vėlai pacientams (žr Stalo S3 pacientų informaciją). Šie mėginiai buvo tuoj pat liofilizuojamas ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol tolesniam naudojimui po jų chirurginio pašalinimo iš pacientų. Tada jie buvo ištirpinti ir centrifuguoti (3000, XG
25 min, esant 4 ° C) pašalinti ląstelių komponentus. Supernatantq buvo surinkti ir dializuojamas 4 ° C temperatūroje prieš MILLIPORE Ypač grynas vanduo (trijų buferinių pokyčius, po kurių vienos nakties dializės), naudojant skaidrių-A-Lyzer dializės kasetės (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant Bio-Rad baltymų tyrimas (Bio-Rad, Hercules, CA) su galvijų serumo albumino, kaip standartą.

D. Identifikavimas genų, kurie skirtingai išreikštas skrandžio vėžio ir kontrolės audinių

80 skrandžio vėžiu audinių ir jų gretimų noncancerous audinių iš 80 pacientų buvo renkami ne medicinos mokyklos Jilin universitetas. Mikrogardeliq eksperimentai buvo atliekami šių audinių, naudojant Affymetrix GeneChip Žmogaus Exon 1.0 ST masyvas, kuris apima 17,800 žmogaus genų. PLIER algoritmas [18] buvo naudojami apibendrinti probe signalus genas lygio išraiškos. Už kiekvieną geną, mes išnagrinėjo ekspresijos kartų kaita tarp suporuotų vėžio ir kontrolės audinių visose 80 porų audinių pasiskirstymą. Tegul K _{EXP, UAB, būti porų audinių, kurių sulankstomomis kaita bent 2. genas laikomas , skirtingai išreiškiama
jei P
-Pridėtinės stebimas K Tinka
yra mažesnis nei 0,05. Naudojant šį kriterijų, buvo nustatyta iš 715 genų viso reikia skirtingai išreikštas skrandžio vėžio visose žmogaus genų, o 715 genų pavadinimai, kartu su susijusiais K Tinka parsisiųsti ir p
k dydžiai, pateikiami S4 lentelėje. Išsamus tyrimas mikrogardeliq duomenimis buvo pranešta kitur [19].}

El. Funkcija ir kelias sodrinimo analizuoja

DAVID Bioinformatika ištekliai ir Kobas žiniatinklio serveris [20], [21] buvo naudojami padaryti funkcionalią ir kelias sodrinimo analizę, atitinkamai, visiems prognozuojama šlapimo ekskreciniais baltymų, naudojant visas komplektas žmogaus baltymų kaip fonas. Mes vadiname skaitytojus [20], [21] Išsamesnės informacijos apie už funkcionalus ir kelias sodrinimo analizuoja būdus. Naudojant DAVID bioinformatikos išteklių, sodrinimas rezultatas tam tikrą grupę baltymų nulėmė lengvumas rezultatas [20], [22]. Kobas yra papildoma priemonė Dovydui, nes jis plečia genų anotaciją naudojantis KEGG Orthology (ko) sąlygas. Kobas žiniatinklio serveris, kartu su KO-paremtą anotacijos sistemos [21], [23], buvo naudojama ir siekiant rasti statistiškai praturtinti ir nepakankamai atstovaujamai kelius tarp numatomų šlapimo išsiskiria baltymų. Kobas trunka baltymų sekų rinkinį ir annotates juos naudojant KO sąlygas. Tuomet komentuojami KO sąlygos buvo lyginami su visų žmogaus baltymų kaip fonas rinkinį vertinant, jei jie yra praturtinti arba per mažai.

F. Vakarų dėmės

Šlapimo baltymams, iš kiekvieno mėginio (iš viso 2 mikrogramų) buvo sujungti su 3x mėginio dažų. Kiekvienas vamzdis mišinys buvo virinamas 5 min ir pakrauti į SDS-PAGE gelyje, kartu su 10 mikrol, standartų ir įjungti 1 h 200 voltų. Membrana buvo aktyvuota su 100% metanolio, po perdavimo iš gelio membranos (100 voltų įtampos 1 h). Po to, kai perdavimas buvo baigtas, membrana buvo leidžiama išdžiūti, rewetted 100% metanolio ir plauti 2x 5 min kiekvienas su tri-buferinio tirpalo (TBS). tada to membraną 3% pieno blokuojančiu tirpalu 2 valandas kambario temperatūroje. Kitas to membraną pirmą antikūnų tirpalo (1:200 atskiedimus 1,5% pieno blokavimo) 1 val kambario temperatūroje, ir laisvoji antikūno buvo pašalintas, plaunant membraną 3X su TBS Tween-20 (TBST) tirpalo 10 minutės kiekvienam. Tada membrana buvo inkubuojami 1:10,000 praskiedus antrinio antikūno 1,5% pieno blokuojančiu tirpalu 1 valandą, o esant kambario temperatūrai. Membrana buvo plaunami 3 kartus su TBST ir 2x su TBS (kiekvieną 10 min.) Galiausiai, membrana buvo visiškai padengta vienodo dydžio, stipriklis ir peroksido tirpalo iš Pierce Imunoblotingo rinkinys, skirtas 5 min ir veikiami prie plėvelės. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas kelis kartus, siekiant užtikrinti atkuriamumo [24]. Signalo intensyvumas buvo nustatomas naudojant ImageJ programą [25]. Už kiekvieną membrana, tuščią juostos buvo normalizuoti signalo intensyvumas visoje membranų. Spektaklis buvo tiriama naudojant ROC ir Ūsas dėžutė sklypą.

Rezultatai ir jų aptarimas

a. Signalinis peptidas ir antrinės struktūros pagrindiniai bruožai šlapimo išsiskiria baltymų

pradinis funkcijų sąrašas buvo kruopščiai atrinktos įtraukti tai, ką mes manoma, kad baltymų savybes, susijusius su šlapimo išsiskyrimą remiantis literatūros paieška ir mūsų dabartinį supratimą šlapimo baltymai. Pavyzdžiui, neigiamą krūvį turintis glomerulų siena inkstų leis tik teigiamai arba neutraliai krūvį baltymų filtravimą. Tokiu būdu, mokestis už baltymų yra vienas iš funkcijų mes pasirinktų. Atsižvelgiant į turimą informaciją į tai, iš viso surinktų yra: vertybių pradžių buvo 243, tai sudaro pagrindinius sekos savybes, motyvus, fizikines ir chemines savybes, ir struktūrines savybes (lentelė S1). Nustatant funkcijas, kurios yra veiksmingos diskriminuoti šlapimo šalinimo baltymus nuo ne ekskreciniais tie, paprastas ir veiksmingas būdas pašalinti funkcijas, parodyti mažai arba jokio reiklų galia mūsų klasifikacija problema buvo įdarbintas; 74 vaidybiniai vertės buvo parinktos naudojant aprašytą skyriuje metodus (lentelė S5) procedūrą. Šie funkcija vertės buvo naudojamas mokyti galutinį klasifikatorių.

Tarp pasirinktų funkcijų, labiausiai diskriminuojantis vienas buvo Signalinių peptidų buvimą. Suprantama, kad baltymai, kurie yra išskiriami per ER turi signalo peptidai ir nelegaliai į jų paskirties vietą, atsižvelgiant į konkrečius signalo peptidų; Taigi, nenuostabu, kad dauguma išsiskiria baltymai turi šią funkciją. Kitas požymis buvo antrinė struktūra tipas; Konkrečiau, alfa spiralės procentas baltymo sekoje buvo klasifikuojama kaip numeris 2 funkcija vertės tarp pasirinktos 74 (S5 lentelė). Kaip ir tikėtasi, baltymo mokestis buvo tarp geriausių pateko funkcijų išsiskiria baltymų. Tai atitinka bendrą supratimą, kad mokestis yra veiksnys nustatant, kurie baltymai gali būti filtruojamas per glomerulų membranos [26], kaip baltymai viduje glomerulų membranas ir podocyte plyšių yra neigiamo krūvio, taigi neigiamo krūvio baltymai turės mažai galimybių filtruoti per inkstus. Iš tiesų, šią funkciją vertės teigiamų amino rūgščių ir nemokamai buvo tarp geriausių reitingą yra: vertybėmis.

Įdomu, tačiau molekulinis svoris, kuris užėmė 232 iš 243, nebuvo įtraukta į galutines 74 funkcijų reikšmes. Tai galima paaiškinti taip. Baltymai esančios serume gali jau atlikta skilimo arba iš dalies buvo nevisavertis, todėl gali būti ne jų sveika arba užpildyti formą, kai jos įvežamos į inkstus. Jis, tiesą sakant, buvo nustatyta, kad baltymų šlapime aptinkamų dauguma yra plačiai nevisavertis [27]. O sveikas baltymas gali būti ne gali filtruoti per glomerulas dėl savo dydžio ar formos baltymas gautas peptidas gali lengvai praeiti per podocyte plyšių. Kaip rezultatas, molekulinė masė sveikas baltymas, yra ne-veiksnys prognozuoti, jei baltymas yra šlapimo ekskrecinis.

Reikia pažymėti, kad šlapimo išsiskiria su baltymų ir išskiriami baltymai tą tam tikrų bendrų bruožų kaip kai kurie iš požymiai, kuriais nustatyti kraujo-išskiriami baltymų mūsų ankstesniame tyrime [10] buvo atrinktos į šlapimo baltymų prognozavimas šiame tyrime. Pavyzdžiui, tokios funkcijos kaip tirpiklio prieinamumą, poliariškumo ir signalų peptidų buvo įtraukti į abiejų klasifikatorių. Tačiau yra aiškus skirtumas tarp funkcijų, naudojamų dviejų klasifikatorių. Nors funkcijų, tokių kaip beta-Strand-turinį, yra susijęs su beta barelį transmembraniniu baltymų ir baltymų santykis, TatP motyvas, transmembraninę, baltymų dydžio ir ilgiausią netvarkingai regione buvo tarp geriausių savybių prognozavimo kraujo sekrecijos baltymų [10 ], jie nebuvo įtraukti į galutines funkcijų šlapimo baltymų prognozavimas. Be to, funkcijos, susijusios su teigiamu krūviu, pavyzdžiui, siekiant teigiamo krūvio amino rūgščių sudėtį, buvo išsikišusi į šlapimo baltymų prognozavimas bet neparinktas kraujo sekrecijos prognozavimas. Panašiai, alfa-spiralės-turinys ir ritė-turinys baltymų buvo tarp funkcijų šlapimo baltymų prognozavimas, bet jie nebuvo pasirinktas kraujo-sekrecijos baltymų prognozavimas. Įdomu pažymėti, kad, priešingai nei išvada, kad beta-gijos yra dažna antrinė struktūra tipas tarp kraujo sekrecijos baltymų, šlapimo baltymų linkę turėti aukštąjį alfa spiralės ir ritė turinį, kuris rodo, kad šlapimo baltymų turi tokių savybių neturi bendrų kraujo sekrecijos baltymų apskritai.

b. Atlikimas klasifikatorius

Norėdami nustatyti galutinę klasifikaciją tikslumą, mes išbandyti jį ant nepriklausomos bandymų rinkinys, kurį sudaro 460 eksperimentiškai patvirtinti šlapimo ekskreciniais baltymų ir 2,148 ne šlapimo ekskreciniais baltymų. Mūsų klasifikatorius turi savo prognozavimo jautrumą ir specifiškumą šiuo nepriklausomoje bandymų nustatyti 0,78 ir 0,92, atitinkamai (1 lentelė).

tada bėgo klasifikatorių apie 163 iš 274 baltymų, fiksuotų ant iš anksto pagaminti antikūnų masyvas (žr metodus), už kurį Šalinimo statusas buvo nežinoma. Iš 163 baltymų, 112 baltymai buvo prognozuojama, kad šlapimo šalinimo mūsų klasifikatoriaus. Norėdami įvertinti šio prognozavimo rezultatus, antikūnų masyvo pagrindu eksperimentai buvo atliekami 14 šlapimo mėginių, septyni iš sveikų asmenų ir septynių nuo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Iš 112 prognozuojama šlapimo ekskreciniais baltymų, 92 Buvo nustatyta, bent vieną iš šlapimo mėginių (lentelė S6), suteikiant teigiamą numatymo normą 0,81, kuris yra suderinamas su veikimo lygio dėl pirmojo bandymų rinkinys.

Pažymėtina, kad vienas apribojimas šį klasifikatorių yra tai, kad kai kurie baltymai galėjo būti iš dalies pažeista prieš išsiskiria su šlapimu ar šlapime, todėl sunku mūsų klasifikatorius aptikti taip susiformavo peptidai, nes jis buvo mokomi visai sveikoms baltymų. Šis klausimas bus sprendžiamas ateityje per kylančių vaidybinius vertybes grindžiamas faktinėmis baltymų /peptidų, nustatytų ankstesnėse šlapimo proteominius tyrimus, o ne jų atitinkamų pilnametražis baltymų kaip tai daroma šiame tyrime. Nors aiškiai yra galimybių toliau tobulinti, kad prognozavimo rezultatai dabartinės klasifikatorių yra labai džiuginantys.

C. Taikymas klasifikatoriaus skrandžio vėžio duomenų

Mūsų Ankstesnis tyrimas dėl 160 komplektų microarray genų ekspresijos duomenimis skrandžio vėžio nustatė 715 diferencijuotai išreikštus genus su bent 2 kartus pokyčių skrandžio vėžio prieš
valdymo audinio mėginiai [19]. Nors būtų geriau turėti PROTEOMIKOS duomenis audinių pavyzdžių, turime pateikiamos tik šio tyrimo genų ekspresijos duomenis. Taigi, genų ekspresijos duomenys yra naudojami kaip suderinimo su baltymų raiškos šios metodikos orientuotos studijos. Mūsų klasifikatorius buvo taikomas šių 715 baltymų, ir prognozuojama, kad 201 iš 715 baltymai šlapime Šalinimo. S7 lentelė suteikia išsamią informaciją apie 201 baltymų. Kadangi tai yra nerealu patikrinti visus 201 baltymų šiame tyrime siekiant nustatyti, ar jie yra šlapimo Šalinimo, ar ne, mes padarėme analizę susiaurinti šį sąrašą. Tiksliau, mes turime atlikti šiuos tyrimus: (I) funkcinės ir kelias sodrinimo analizuoja įgyti geresnį supratimą apie baltymų rūšių, esančių šlapime (II) Literatūra Paieška šlapimo baltymų rinkti informaciją apie paskelbtus šlapimo baltymus žymenis ( iii) nagrinėja genų ekspresijos duomenis pašalinti genus, kurie nėra iš esmės skirtingai išreikštas tarp vėžio ir kontrolė audinių mėginius; ir (iv) Vakarų dėmės ant parinktais iš susiaurinta sąrašą 201 baltymų baltymų. Ši procedūra parodė aukštą sėkmės rodiklis ir buvo įdomus atradimas galimo biologinis žymuo skrandžio vėžio.

(I), mes turime atlikti funkcionalus ir kelias sodrinimo analizuoja visų 201 baltymų, naudojant David [20 ] ir Kobas [21] serveriai, atitinkamai. Mes nustatėme, kad praturtintas funkcinės grupės įtraukti tarpląsteliniame (ECM), ląstelių sukibimą ir plėtrą, ląstelių judrumą, gynybos reakcija, angiogenezę, kurie visi yra žinoma, kad dalyvauja ar gynybos vėžio (S1A paveikslas) plėtrą. Labiausiai Pagerinti būdai buvo ECM-receptorių sąveika ir neorganinio jono transporto ir metabolizmo keliai (S1B pav)

šis kriterijus buvo naudojami siekiant sumažinti 201 baltymų sąrašą žingsnių (ii) - (iii):. nebuvo pranešta baltymai turi būti susijęs su kokia nors vėžio remiantis mūsų plataus literatūra paieška
, kuris sukelia iki 71 baltymų. Sąrašas buvo dar labiau sumažintos remiantis iš anksto pasirinktą nukirpimas Diferencialinė išraiškos ir funkcinių anotacijos (potencialiai atitinkamos skrandžio vėžio, o ne imuninio atsako).

D. Endotelio lipazės iš esmės mažinama šlapimo mėginių skrandžio vėžio pacientai

Mes pasirinkome šešis baltymus (MUC13, COL10A1, AZGP1, LIPF, MMP3 ir EL) eksperimentinio patvirtinimo iš aukščiau susiaurinta sąrašą. Norėdami tai padaryti, mes turime surinkti šlapimo mėginius iš 21 skrandžio vėžiu sergančių pacientų ir 21 sveikų asmenų. Iš šešių pasirinktų baltymų, penkių baltymų, MUC13, COL10A1, LIPG, AZGP1 ir EL buvo aptikta Vakarų dėmės bent vienoje šlapimo mėginį. Iš penkių, MUC13, COL10A1, EL buvo aptikta net už labai mažą kiekį visų šlapimo baltymų (1-2 ľg). MMP3 nerastas mėginių mes patikrinome, kurios gali būti dėl mažo koncentracijos MMP3 šlapime ar klaidingų prognozių mūsų klasifikatoriaus.

Tai ypač įdomu pažymėti, kad mes galėjome aptikti nuoseklius skirtumus į EL gausa (užkoduotas LIPG
) tarp dviejų 21 šlapimo mėginių. Vakarų dėmės El parodė iš esmės sumažinti jo gausa šlapimo mėginių iš 21 skrandžio vėžiu sergančių pacientų, lyginant su kontroliniais bandiniais. Kaip parodyta 2A paveiksle, iš kontrolinių mėginių dauguma parodė EL buvimą, o dauguma skrandžio vėžio mėginiai buvo palyginti mažas sumas El. Šis modelis buvo stebimas pakartotinai

molekulinė masė šio baltymo buvo nustatyta, kad 68 kDa [28].; Taigi, homo-dimeras Tikimasi, kad 134 kDa. Vakarų dėmės, tačiau, juostos buvo aptikta beveik 100 kDa. Tai tikriausiai atitinka dalinai suskaldyti homo-dimerų, aktyvus forma, kuri buvo patvirtinta ankstesniame tyrime [29], nors monomerinio forma EL, susijusių su kito baltymo galimybė negali būti atmesta. http://csbl.bmb.uga.edu/~juancui/Publications/GC2009/Additional_material.pdf.
doi:10.1371/journal.pone.0016875.s005
(XLS)
Table

• PLoS ONE: Sonic the Hedgehog Kelias yra būtina priežiūra vėžio kamieninių ląstelių Kaip žmogaus skrandžio Cancer
• PLoS ONE: genų ekspresija Parašas įgytų Atsparumas cheminėms cisplatinos ir fluorouracilu kombinuotos chemoterapijos skrandžio vėžio Patients