PLoS Genetics: mir-218 Slopina invazija ir metastazių skrandžio vėžio nukreipiant Robo1 receptorius

Abstract

mikro RNR vaidina pagrindinius vaidmenis naviko metastazių. Čia mes aprašome reguliavimą ir funkcijos PPN-218 skrandžio vėžio (GC) metastazių. ir miR-218 išraiška yra sumažėjo kartu su vieno iš jos šeimininko genus, Slit3 metastazių GC išraiška. Tačiau Robo1, vienas iš kelių plyšiai receptorių, neigiamai reglamentuoja miR-218, taip sukuriant neigiamą grįžtamąjį ryšį. Sumažėjęs Pasaulis-218 lygiai pašalinti Robo1 represijas, kuris aktyvuoja plyšio Robo1 kelią per tarp Robo1 ir Slit2 sąveika, taip sukeliant naviko metastazių. Iš miR-218 restauravimas slopina Robo1 išraišką ir slopina auglio ląstelių invaziją ir metastazes in vitro parsisiųsti ir vivo
. Kartu paėmus, mūsų rezultatai apibūdinti plyšio Pasaulis-218-Robo1 reguliavimo grandinę, kurios sutrikimas gali prisidėti prie GC metastazių. Nukreipimas MIR-218, gali pateikti blokavimo naviko metastazių strategiją.

Autorius Santrauka

mikro RNR buvo įvardyti kaip žaisti svarbų vaidmenį navikų metastazių, tačiau jų poveikis GC metastazių buvo prastai ištirta. Mes atradome, miR-218, kuris veikia kaip naviko metastazių slopintuvas ir susijusiam su klinikinės etape, limfmazgių metastazių, ir prognozės pacientams, sergantiems GC. Mūsų rezultatai rodo, kad miR-218 yra dalis reguliavimo grandinė, susijusia su prapjovos Robo1 kelią. Sergančių metastazavusiu naviko ląstelių, miR-218 buvo nuslopinta kartu su Slit3, vieno iš jo šeimininko genus. Tuo tarpu, Robo1, vienas iš kelių plyšio receptorių, yra aktyvinama į reaguojant į miR-218, kuris, savo ruožtu, sukeltos reaktyvioji ląstelę plyšio-Robo1 keliu per sąveikos su Slit2, tokiu būdu palengvinant naviko ląstelių migraciją ir invazija sumažėjimas. Tokie faktai ne tik suteikia naujų įžvalgų į metastazavusiu mechanizmų GC, bet taip pat pateikti įrodymus naują Mirna tarpininkaujant reguliavimo būdas receptorių signalizacijos

nurodomoji dalis. Tie J Visos Y Zhao L, VU K Liu J, nuo saulės S, ir kt. (2010) MIR-218 Slopina invazija ir metastazes skrandžio vėžio nukreipiant Robo1 receptorius. PLoS Genet 6 (3): e1000879. Doi: 10,1371 /journal.pgen.1000879

redaktorius: Bruce E. Clurman Fred Hutchinson vėžio tyrimų centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Lie 15, 2009 m Priėmė: Vasario 10 ", 2010; Paskelbta: Kovo 12, 2010

Visos teisės saugomos: © 2010 Kaklaraištis ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 30.670.970, Nr 30.873.026, Nr 30.672.369, Nr 30.530.780) ir nacionalinio pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (No.2010CB529300). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

pažanga diagnostikos ir gydymo metodus lėmė puikus lūkesčius ilgalaikiam išlikimui ankstyvo skrandžio vėžiu (GC). Tačiau Išplėstinė GC su plataus invazija ir metastazių prognozė išlieka prasta [1]. Siekiant metastazuoja, naviko ląstelės turi praeiti per nuosekliųjų ir rinktinių renginių, įskaitant būrys, migracijos, vietos invazijos, angiogenezę, intravasation, išlikimo kraujotakos sistemos, kraujo išsiliejimo ir atauga įvairių organų serijos. Esant metastazėms, kaskados, invazija į GC į aplinkinių audinių yra esminis anksti žingsnis [2] - [4]. Tačiau invazijos mechanizmai dar nėra visiškai ištirtas.

Daug microribonucleic rūgščių (mikro RNR ar miRNAs) neseniai buvo susijęs vėžio metastazių [5], įskaitant miR-10b, MIR-21, ir miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520C, ir miR-205 į krūties vėžio [6] - [11]; ir miR-224 ir miR-21 prostatos vėžio [12], [13]; Pasaulis-29c iš nosiaryklės karcinoma [14]; ir miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7, ir miR-452 į urotelinis karcinomų [15]; Pasaulis-182 melanomos [16]; ir miR-92b ir miR-09/09 * smegenų navikų [17]; ir Pasaulis-21 į gaubtinės žarnos vėžio [18]. Tačiau buvo pranešta apie labai nedaug miRNAs žinomiems dalyvauja GC metastazių. miRNAs yra natūraliai, trumpas, Be kodavimo RNR molekules, kurios neigiamai reguliuoti genų ekspresiją. [19] Žinduolių, brandžios miRNAs yra generuojami iš pri-miRNAs ir iš anksto miRNAs per paeiliui tvarkymą Drosha ir Kauliukų žaidimai ir randamas daugelyje organizmų. Jie susideda iš 21-24 nukleotidų, integruotis į RNR skatinančius triukšmo slopinimo kompleksų, bei su jais susieti 3 'neišverstų regionuose (3'-UTR) konkrečių tikslinių žinučių RNR (iRNR) slopinti vertimą arba sukelti degradaciją tikslinių mRNR [20 ]. Kylančios duomenys rodo, kad miRNAs vaidina pagrindinius vaidmenis įvairių biologinių procesų, įskaitant ląstelių diferenciacijos, dauginimosi, apoptozės, atsparumas stresui, riebalų metabolizmo, Tumorigenesis ir metastazių [21] - [23]. Geresnis supratimas iš Mirna raiškos pokyčių metu GC invazijos gali padėti geriau suprasti GC plėtros, taip pat galimų patobulinimų diagnozuojant ir gydant Išplėstinė GC.

Šiame tyrime mes sukūrėme aukštos (MKN28-M SGC7901-M) ir žemos invazinės mobilieji sublines (MKN28-NM ir SGC7901-NM), naudojant pasikartojantis transwell testą in vitro
. tada mes išnagrinėjo pasaulinio Mirna išraiška profilį kiekvienoje ląstelių SubLine naudojant Mirna mikrogardeliq nustatyti diferencijuotai išreikštas miRNAs susijusius su žmogaus GC invazijos. Iš viso 45 miRNAs buvo įrodyta, kad būti skirtingai išreikšti invazinės vs neinvazinių GC ląsteles. Tarp jų, PPN-218, gerokai downregulated Mirna į labai invazinių ląsteles, buvo įrodyta, kad būti glaudžiai koreliuoja su GC Tumorigenesis ir metastazių pacientams. Visai neseniai į miR-218 sumažėjimas buvo pranešta kelių rūšių solidinių navikų, įskaitant prostatos vėžio, GC, plaučių vėžio ir gimdos kaklelio vėžio [24] - [27], tačiau šio sumažėjimo Mirna-218 buvo tiesiog tikrinami iš kaip viena iš potencialių miRNAs susidomėjimą pirmiau aprašytų vėžio dešimtys. neatlikta tolesni tyrimai siekiant įvertinti PPN-218 reikšmę naviko metastazių. Čia, mes nustatėme, kad sumažėjo ir miR-218 išraiška buvo susietas su pažangius klinikinius etape, limfmazgių metastazių, ir blogos prognozės pacientams, ir iš naujo ekspresija miR-218 sergančių metastazavusiu ląstelių galėjo slopinti migracijos, invazijos, ir jo metastazių formavimo tiek in vitro parsisiųsti ir vivo
. Naudojant bioinformatikos paiešką MIR-218 tikslų, mes iškeltas receptorių Robo1 kaip mir-218 funkcinės tikslą, ir mes patvirtino, kad tarp miR-218 ir Robo1 sąveika buvo labai svarbus GC ląstelių judrumui parodant, kad buvo atvirkštinė koreliacija tarp miR -218 ir Robo1 GC ląstelių linijų, taip pat GC pacientams. Be to, mes atrado intriguojantį neigiamo grįžtamojo ryšio kilpa dalyvauja plyšiai, MIR-218, ir Robo1, kurioje Pasaulis-218 gali būti gauta iš vienos iš dviejų genų, esančių dviejų skirtingų narių plyšiai baltymų šeimos intronai. Be to, nariai šios šeimos yra ligandų iš Robo1 receptorius. Mes parodė, kad išraiška dviejų Mirna pirmtakų genų (MIR-218-1 ir mir-218-2) koreliuoja su išraiškos iš šeimininko genus (Slit2 ir Slit3, atitinkamai), ir kad brandus miR-218 buvo iš esmės kilęs iš Mir -218-2 pirmtakas, su kartu mažinant priimančiosios Slit3 bet ne Slit2 metastazių GC ląsteles. Taigi ląstelę Robo1 reaguojant į į miR-218 sumažėjimas sukeltas reaktyvioji ląstelę su plyšine Robo1 keliu per jos sąveiką su Slit2, tokiu būdu palengvinant auglio ląstelių invaziją ir metastazes. Mūsų išvados ne tik suteiks naujų įžvalgų į metastazavusiu mechanizmų GC, bet jie taip pat atskleidė romano reguliavimo mechanizmą receptorių signalizacijos.

Rezultatai

kūrimo ir apibūdinimo ląstelių sublines su kitokia invazinė ir metastazavusiu potencialai

Jei nustatyti GC metastazių modelius, mes sukūrėme invazinės ir neinvazinės mobiliuosius sublines iš žmogaus GC ląstelių linijų SGC7901 ir MKN28 naudojant pakartotinai transwell požiūrį (1A pav žr medžiagos ir metodai). Trumpai tariant, pasikartojantis invazija tyrimas buvo atliktas, ir tos ląstelės kad nepavyko įsiveržti į membranas ir ląsteles, kurios turėjo galimybę migruoti per kolageno dengtos membranos visų atrankos etapuose buvo atskirtos. Po dešimties turų atrankos gavome invazinių (MKN28-M SGC7901-M) ir neinvazinės mobiliuosius sublines (MKN28 nm ir SGC7901-NM). Metastazėms savybės Kiekviena ląstelė SubLine tada buvo būdingas in vitro parsisiųsti ir vivo
. Kaip parodyta 1B ir 1C pav, migracija gebėjimas MKN28-M ląstelėse buvo maždaug 4-kartų didesnė negu iš MKN28-NM ląstelių. Taip pat, invazinė potencialas buvo apie 5 kartus didesnis už MKN28-M ląstelių, palyginti su MKN28-NM ląstelių. Be in vivo
tyrimų, naviko ląstelių metastazės buvo pastebėtas nuogas pelių. Kaip parodyta 1D paveiksle 1E, beveik nėra metastazių GC ląstelės buvo aptikta plaučių ar kepenis nuogas pelių 10 savaičių po injekcijos MKN28 nm ląstelių, o dauguma pelių liejamo su MKN28 M ląstelių rodomas akivaizdus plaučių ar kepenų metastazėmis. Panašūs rezultatai buvo stebimi SGC7901-M ir SGC7901 nm ląstelių (duomenys neparodyti). nebuvo pastebėta jokių reikšmingų skirtumų ląstelių dauginimasis ar ląstelių ciklo paskirstymo tarp šių ląstelių sublines (Tekstas S1 paveiksluose S1 ir S2),.

Cheminės metastazės susijusių miRNAs iki masyvo pagrindu hibridizacijos

Norėdami nustatyti miRNAs galimai susijusiais GC invazija, mes išanalizavome pasaulio Mirna išraiška kiekvienoje ląstelių SubLine naudojant MicroRNA array (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Danija), kurį sudaro 847 surinkimo zondinių brandaus žmogaus miRNAs. Mikrogardeliq rezultatai parodė, kad 124 miRNAs išraiška tarp labai invazinės variantu MKN28-M ir neinvazinis ląstelių SubLine MKN28 nm labai skyrėsi. Iš jų 83 buvo aktyvinama ir 41 buvo downregulated. Palyginti su SGC7901 nm, 62 miRNAs buvo skirtingai išreikšta SGC7901-M ląstelių SubLine, įskaitant 47 downregulated ir 15 aktyvinama miRNAs. Iš viso buvo rasta 11 miRNAs būti aktyvinama ir 34 miRNAs buvo downregulated tiek MKN28-M ir SGC7901 M ląstelių, palyginti su tais, atitinkamuose neinvazinių sublines (lentelė S1).

Iš 45 diferencijuotai reguliuojami miRNAs, PPN-218 buvo vienas iš tų, kuriuose rodomi žymiai diferencinė ekspresija. Pasaulis-218 buvo pranešta, kad downregulated gimdos kaklelio vėžio [25], GC [26], plaučių vėžys [27] ir prostatos vėžio [28], nurodant galimą dalyvavimą tiek onkogeninė transformacija ir naviko metastazių. Tačiau Mirna-218 buvo tik vienas iš daugelio galimų miRNAs susidomėjimą vėžio. Šiame darbe, PPN-218 buvo tiriama daug išsamiau. Norėdami patvirtinti mikrogardeliq rezultatus, įvertino Pasaulis-218 išraišką anksčiau minėtų GC ląstelių sublines ir nemirtingas skrandžio epitelio ląstelių linijos GES naudojant KRL PGR, [29]. Pasaulis-218 išraiška buvo žymiai sumažėjo MKN28-M ir SGC7901 M ląstelių ir buvo mažesnis visose keturiose GC ląstelių sublines palyginti su imortalizuotų žmogaus skrandžio epitelinių ląstelių GES (2a pav.) Be to, mes palyginti Pasaulis-218 išraišką pirminėje GC naviko vs metastazių limfmazgiuose iš 10 pacientų, sergantys III stadijos /IV GC naudojant KRL PGR. Kaip parodyta 2B pav, brandus Pasaulis-218 lygis buvo žymiai sumažėjo 7 iš 10 metastazių limfmazgiuose, nurodant, kad Pasaulis-218 gali atlikti priežastinį vaidmenį GC metastazių.

Sumažėjo Pasaulis-218 išraišką GC buvo susijęs su pažangiomis klinikinės stadijos, limfmazgių metastazių, ir prastos pacientas prognozių

Norėdami nustatyti potencialius klinikos pasekmes pakeisti Pasaulis-218 raiškos, mes ištirti raiškos lygį PPN-218 40 GC audinių (T), ir ne-navikas gleivinė (N) atliekant KRL-PGR. Terminas -ΔCt buvo naudojamas apibūdinti ekspresijos lygį miR-218. Sutampa su pirmiau pateiktais duomenimis, rezultatai patvirtino, kad Mir-218 išraiška lygis GC (-13,81 ± 0,15, vidurkis ± SE) audiniai buvo gerokai mažesnis nei ne neoplastiniu gleivinės (-11,62 ± 0,15, vidurkis ± SE) ( P
< 0,0001, t = 10.62, suporuotas , T
-test) (3a pav.) Koreliacija tarp Mir-218 raiškos lygį ir clinicopathologic charakteristikas GC apibendrinti lentelėje buvo pastebėtas 1. Statistiškai reikšmingi asociacijos tarp Mir-218 raiškos lygį ir klinikinės stadijos ir tarp Mir-218 raiškos lygį ir GC metastazių šiame tyrime. Mediana išraiška miR-218 buvo -14,25 ± 0,17 ir 22 atvejais išplitusiam (III etapas ir IV) ligos, o mediana išraiška buvo -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney testas) ir 18 atvejų su ankstyvos stadijos (etapai I ir II) ligos. Per 29 atvejais GC su limfmazgių metastazių, vidutinė išraiška miR-218 buvo -14,09 ± 0,16, kuris buvo gerokai mažesnis nei vidutinis išraiškos (-13,07 ± 0,24) tarp 11 nemetastazavusį GC atvejais ( P
= 0,0036). Iš miR-218 išraiška GC pacientų nebuvo koreliuoja su amžiumi, lytimi, naviko dydį, arba ląstelių diferenciacija. Be to, mes tikrinama, ar yra miR-218 raiškos lygis buvo susijęs su išlikimo pacientams, sergantiems GC. Pacientai vėliau buvo suskirstyti į mažas išraiškos (n = 20) ir didelės raiškos grupes (n = 20), remiantis Pasaulis-218 lygių didesnis arba mažesnis už vidurkį (-13.81) (3b pav.) Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė parodė, kad pacientams, kurių pirminis navikas rodomas mažas išraišką PPN-218 turėjo trumpesnį vidutinis išgyvenamumo laikas. Trejų metų išgyvenamumas pacientų su žemu Pasaulis-218 išraiškos buvo 30%, kuris buvo gerokai mažesnis nei išgyvenamumas ligonių, sergančių didelio Pasaulis-218 raiškos (65% P
= 0,0012, logoritminis rank testas;. Fig.3C)

negimdinis išraiška Pasaulis-218 inhibuoja naviko ląstelių invazija ir metastazių in vitro parsisiųsti ir vivo

Jei studijuoti iš miR-218 vaidmenį GC metastazių, MKN28-M ląstelės buvo pernešta su pGenesil-1-Pasaulis-218 arba kontrolės vektorius išreiškia nespecifinį Mirna, Cel-Pasaulis-67, naudojant Lipofectamine 2000 (INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA ). Po to ląstelės buvo atrinkti su 400 mg /L G418 generuoti MKN28-M-miR-218 ir MKN28-M-miR-kontrolės stabilias ląsteles. Mes nustatėme, kad negimdinis išraiška miR-218 lėmė maždaug tris kartus sumažinti migracijos ir invazijos. Norint nustatyti, ar miR-218 praradimas būtų skatinti migraciją ar invazija vėžinių ląstelių, mes nutildė MIR-218 su Priešprasminis oligonukleidų inhibitoriaus MKN28-NM ląstelių linijos, todėl trejų iki keturių kartų padidinti ląstelių migracija ir invaziškumo (4A pav ir 4B). Norėdami patikrinti, ar slopinimas naviko invazija miR-218 sukelia pažeidžiantis invazinių gebėjimas vėžinių ląstelių, mes atmetė PPN-218 poveikį proliferaciją ir ląstelės ciklo paskirstymo skrandžio vėžio ląsteles. Per išraiškos PPN-218 neturėjo įtakos plitimas ir ląstelės ciklo platinimas MKN28 M ląstelių in vitro
(S5A paveiksle S5D). Toliau tirti vivo pervežimas naviko metastazių pagal miR-218 slopinimas, mes implantuoti MKN28 M-Pasaulis-218 ląstelių, kurios buvo stabiliai ekspresuojančiam Pasaulis-218 arba kontrolės ląsteles į nuogas pelių per šoninio uodegos venos. Plaučių ir kepenų metastazių GC buvo akivaizdu, pelėms buvo sušvirkšta MKN28 M-Pasaulis-kontrolinių ląstelių. Priešingai, keletas metastaziniai navikų buvo aptikti pelių sušvirkšta MKN28 M-Pasaulis-218 ląstelių (4c paveikslą). Be to, mes vienu metu pastebėti pirminių navikų augimą ir tolimoje metastazių dažnis nuogas pelių švirkščiamas po oda MKN28 M-Pasaulis-218 ląstelių arba kontrolinių ląstelių. Rezultatai parodė, plaučių ar kepenų metastazės buvo matyti 3 iš 10 pelių sušvirkšta MKN28 M-Pasaulis-kontrolinių ląstelių; visiška priešingybė, ne metastazės buvo rasta pelių sušvirkšta MKN28 M-Pasaulis-218 ląstelių (s5e pav). Šie rezultatai sutampa su duomenimis, gautais iš uodegos venos tyrimams, kad įvertinti vėžio metastazių ir rodo, kad Pasaulis-218 turi galimybę slopinti metastazių nepaveikiant ląstelių proliferaciją.

Robo1 buvo tiesioginis funkcinis tikslas miR-218 GC metastazės

Jei vertinti kaip mažas Pasaulis-218 raiškos prisideda prie invazija ir metastazių GC, mes ieškoma galimų reguliavimo tikslus PPN-218, naudojant prognozavimo įrankius, įskaitant Miranda PicTar ir TargetScan. Nors šimtai skirtingų tikslų įgyvendinimo buvo prognozuojama, šie genų, susijusių su migracijos arba invazijos gali būti atitinkami tikslai, atsižvelgiant į biologinių funkcijų miR-218. Tada atliekamas funkcinis klasifikaciją prognozuojama tikslų naudojant David programą (http://david.abcc.ncifcrf.gov/~~HEAD=dobj). Šių genų, Robo1 laikomas prokalbės onkogeno ir uostų migracijos skatinimo veiklos [30] - [35]. Mertsch , et al.,
Parodė, kad Robo1 palengvina gliomos ląstelių migraciją procesų, kuriuose Slit2 [36]. Schmid, , et al.,
Nustatė, kad krūties naviko ląstelių migracija yra sukeliama dėl Slit2-Robo1 sąveikos in vitro
[37]. Šie rezultatai rodo, kad Robo1 gali būti tikslinė Mir-218. Toliau išbandyti mūsų hipotezę, mes išanalizavo PPN-218 ir Robo1 išraišką GES ir neinvazinė (MKN28-NM ir SGC7901-NM) ir invazinės (MKN28-M ir SGC7901-M) GC ląsteles. Rezultatai parodė neigiamą koreliaciją tarp PPN-218 ir Robo1 mRNR šių ląstelių (S3A pav) lygių. Be to, mes nustatėme, kad Robo1 iRNR (S3B paveikslas) ir baltymų (5B2 paveikslas) koncentracija sumažėjo, kai Pasaulis-218 buvo išreikšta pGenesil-1-miR-218 MKN28 M ląstelių (5B1 paveikslą). Atvirkštinis buvo pastebėta Robo1 išraiška, kai Pasaulis-218 buvo nuversta į MKN28 nm ląstelių (5C1 paveiksle 5C2 pav.) Atvirkštinis ryšys tarp miR-218 ir Robo1 išraiška buvo dar kartą patvirtino imunohistocheminiu (Tekstas S1) 40 atvejų skrandžio vėžiu, kad suderintų gretimuose normaliuose audiniuose, kurie taip pat buvo naudojami klinikos tyrimų ir 29 suderintų metastazių. Rezultatai rodo, kad Robo1 buvo aktyvinama GC, ypač metastazavusiu GC (S4 paveikslas), kurioje Pasaulis-218 turi santykinai mažą raišką.

Jei gauti daugiau tiesioginių įrodymų, kad Robo1 yra miR-218 tikslas , mes tyrė prijungimo vietą miR-218 į 3'-UTR iš Robo1 mRNR (5A pav). Mes sukonstravo liuciferazės reporteris (Luc Robo1), kuriame iš Robo1 3'-UTR papildomą PPN-218 nukleotidai (NT 971-978) buvo įdėta į pMIR-ataskaitos Mirna išraiška reporteris vektoriumi [38]. Atitinkamai, mes taip pat generuoja tiek mutantas reporteris (Luc Robo1-MU), kuriame pirmieji šeši nukleotidų Mir-218 sėklų regiono papildomų vietų buvo ištrintas, o kontrolės reporteris, kuriame buvo nesusiję fragmentas kDNR (Luc "Ctrl). Pasaulis-218-plazmidės buvo bendrai perkeltų su Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, ar Luc-Ctrl į MKN28 M ląsteles. Buvo atlikti parodė, kad liuciferazė aktyvumas Luc Robo1-perkeltų ląstelių buvo gerokai sumažėjo, palyginti su liuciferazės veiklos mutanto ir neigiamų kontrolinių ląstelių ( P
< 0,05), o tai rodo, kad Pasaulis-218 sumažintas liuciferazė veikla Luc-Robo1 bet neturėjo Luc-Robo1-mu (5d paveikslas) poveikį. Todėl mes padarė išvadą, kad įterpiamas fragmentas Robo1 (NT 971, - CR.LT 978). Buvo miR-218 tikslas

Robo1 buvo įrodyta, kad būti per išreikštas vėžinių ląstelių ir yra žinoma, kad skatinti naviko angiogenezę ir metastazes per sąveikos su plyšiai [39], [40]. Norėdami patikrinti, ar Robo1 yra funkciškai reglamentuoja miR-218, mums sukėlė Robo1 išraiška konstruktą, kuriame yra tik apie prognozuojamą Pasaulis-218 privalomą svetainėje ir Robo1 mutantas ekspresijos vektorių visiškai trūksta 3'-UTR fragmentą. Mes taip pat padarė Robo1 siRNA. MKN28 M-Pasaulis-218 ląstelių, kurios stabiliai išreikšti MIR-218 ectopically, buvo laikinai perkeltų su Robo1 statyti arba mutantas konstrukto (be Pasaulis-218 privalomą vietoje), ir MKN28-M ląstelės buvo pernešta su Robo1 siRNA arba neigiama kontrolė siRNR. MKN28-M-miR-218 ląstelės transfekuotos su Robo1 mutantas konstrukto parodė 3,8-kartus padidinti invazijos gebėjimui, palyginti su ląstelių, transfekuotų su Robo1 konstrukto. Šie rezultatai rodo, kad mutantas Robo1 kDNR įdiegimu, kad trūko Mir-218 privalomą svetainę į Mir-218-ekspresija ląstelių pasikeitė miR-218-tarpininkaujant slopinimo ląstelių invaziją poveikį. Tačiau Robo1 poveikis buvo represuoti pagal miR-218 atsižvelgiant į Robo1 3'-UTR, kurių sudėtyje yra miR-218 surišimo vietose buvimą. Nokdaunas iš Robo1 iki siRNA į MKN28 M ląstelių slopino ląstelių invaziją, kuri priklausė iki tokio lygio, panašių į tuos, kurie pasireiškė po transfekciją su Mir-218 ekspresija vektoriaus (5E ir 5F pav.) Šios pastabos rodo, kad Pasaulis-218 tiesiogiai slopina Robo1 tarpininkaujant ląstelių invaziją.

Slit2, bet ne Slit3, gali sąveikauti su Robo1, praturtintas miR-218 nėra, skatinti GC invazija

Yra du tipai miRNAs: intergenic ir intronic. Buvęs yra ne kodavimo regionus tarp genų ir jų atitinkamas pri-miRNAs paprastai transkripcija iš savo rėmėjams pagal RNR polimerazės II. Pastarasis yra per šeimininko genus intronai ir jų Biogenesis kontroliuoja priimančiosios genų vykdytojų [41], [42]. Pasaulis-218 yra intronic Mirna. Du genai kodas brandžiai miR-218, PPN-218-1 ir miR-218-2, kurioje yra per intronui 15 Slit2 ir intronui 14 Slit3, atitinkamai (6a pav). Intronic vietą iš dviejų Pasaulis-218 genų paskatino mus paklausti, ar Pasaulis-218-1 ir 218-2 Pasaulis-yra perrašoma kartu su savo šeimininko genų mRNR. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes panaudojome KRL PGR išnagrinėti Mir-218-1 pirmtakas išraišką, Mir-218-2 pirmtakas, brandus Pasaulis-218, Slit2 iRNR ir Slit3 iRNR į GC audinių naudojamų išlikimo analizė. Statistinė analizė koreliacijos koeficientas KRL-PGR rezultatai atskleidė didelį teigiamą koreliaciją tarp Slit2 mRNR ir miR-218-1 lygių ir tarp Slit3 mRNR ir miR-218-2 (6b pav ir 6c) lygių. Šie rezultatai rodo, kad miR-218 kodavimo genus, miR-218-1 ir miR-218-2, transkribuojami kartu su jų šeimininko genus, Slit2 ir Slit3, atitinkamai. Nemaža teigiama koreliacija tarp PPN-218 ir miR-218-2 (6d pav) lygių buvo pastebėtas GC; Tačiau toks ryšys buvo pastebėtas tarp PPN-218 ir miR-218-1 (6e pav) lygių. Šie rezultatai rodo, kad downregulation miR-218 GC yra skatinamas A IN miR-218-2 sumažėjimo, bet ne miR-218-1. Suderinamas su šia išvada, Slit3 išraiška gerokai sumažėjo GC (-22,43 ± 0,21, vidurkis ± SE), palyginti su normalaus skrandžio audinio (-20,79 ± 0,23, vidurkis ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7,67, suporuotas , T
-test) (6F pav), o Slit2 išraiška reikšmingai nesiskyrė ( P
= 0,0772, suporuotas , T
-test) ( 6G pav.) Apibendrinant, mūsų eksperimento rezultatai rodo, kad reikšmingas ląstelę iš Robo1 geno reaguojant į šalinimas PPN-218, gali sukelti tolesnį ląstelę su plyšine Robo1 keliu per jos sąveiką su Slit2, palengvinti naviko ląstelių migraciją ir invazija.

Diskusijos

Jei studijuoti ligą, labai svarbu statyti idealus modelis. Šiame tyrime mes izoliuoti invazinės ir neinvazinės mobiliuosius subpopuliacijas įsteigtų žmogaus GC ląstelių linijų, naudojant pakartotinio transwell metodą, kuris buvo sėkmingai taikomas daugelyje tyrimų tiriant naviko metastazių [43] - [48]. Išplitusiam nagrinėjimo in vitro, parsisiųsti ir rezultatai vivo
parodė, kad nustatyti ląstelių sublines turėjo skirtingas invazinės ir metastazavusiu galimybes. Čia mes tikrinami ne tik mobiliuosius sublines gautų iš GC ląstelių linijų su dideliu invazinės potencialo, bet ir tiems, su mažai invazinės potencialą. Su jų metastazių sugebėjimų, išskyrus pasirinkto langelio sublines abu buvo gana panaši, nes jie turi tą pačią genetinę fone. Kadangi pagrindinis skirtumas tarp šių dviejų tipų sublines yra metastazavusiu galimybes, genai, kurie skiriasi tarp jų turėtų gerai koreliuoja su metastazėmis. Be to, mūsų metodas galėtų atskirti invazija etapus nuo metastazių ir leidžia konkrečių žingsnių metastazių, kurios negali būti įvertintos pagal gyvojo gyvūnų modelio tyrimas.

Neseniai miRNAs buvo pranešta skatinti [49] , [50] arba slopinti [51] - [54] naviko metastazės, teikiant naują perspektyvą dėl metastazavusio proceso. Nepaisant to, miRNAs vaidmuo GC metastazių nėra. Šioje ataskaitoje, mes ištirti ir gavo pirmą kartą 45 metastazės susijusių miRNAs GC remiantis nusistovėjusią metastazės ląstelių modelį. Išvada, kad Pasaulis-218 buvo downregulated metastazių GC yra intriguojanti, nes sumažėjo Pasaulis-218 lygis buvo pranešta apie kelių tipų solidinių navikų [24] - [27], [55], rodo, kad miR-218 nuostoliai gali būti bendras renginys Tumorigenesis. Šiame tyrime, mes sutelktas į PPN-218 poveikio GC metastazių ir parodė, kad Pasaulis-218 veikia kaip naviko slopintuvas GC metastazių. Restauravimas Pasaulis-218 sumažėjo ląstelių migracijos ir invazijos in vitro parsisiųsti ir naviko metastazės vivo
. Norėdami gauti stabilias ląstelių linijas, kad per išreiškė Pasaulis-218, mes Transfekuoti MKN28-M ląstelių Pasaulis-218 plazmidžių ir tikrinami G418. Mes pasirinkome dvylika ląstelių kolonijų Mir-218-transfekuota grupės ir nustatė 10 iš 12 kolonijų eksponuojami visiškai vienodi, stabilus ir aukšto lygio išraiška miR-218. Be to, trys atsitiktinai pasirinktos monokloniniai ląstelių linijos eksponuojami panašių sumažinti invazinių ablility. Tačiau plazmidės transfekciją strategijos dažnai lemia mažesnę integracijos efektyvumą, palyginti su virusinės išraiškos pirmaujančių į stochastinio atrankos retų funkciškai nevienalyčių variantų nuo pradinio urmu gyventojų galimybės. Todėl ateityje naudojimas virusinių ekspresijos sistemas turėtų kurti daugiau nešališką pradžios gyventojų išbandyti mūsų hipotezę.

Kaip dalis mūsų mokslinių tyrimų apie tai, kaip miR-218 praradimas paveikia GC metastazių, mes parodė, kad Robo1 buvo kritinė pasroviui tikslas miR-218. Yra žinoma, kad robo yra AXON orientavimas receptorius plyšiai ir tausojama gyvūnams nuo vaisinių muselių žinduoliams. Žinduolių, trys įpjovos (Slit1-3) ir keturi robo (Robo1-4) genai buvo aprašyta [56], [57]. Plyšio-robo sąveika perduoti signalus tarpininkauti šlykštus užuominas apie aksonų ir augimo kūgelių per neuronų vystymuisi ir dalyvauti T ląstelių ir monocitų chemotaksio [58] - [64]. Kaip ir kitų raidos kelius, netipiškoms išraiška plyšiai - CR.LT robo genai buvo pastebėtas naviko tipų [65] įvairovė - [68]. Pavyzdžiui, krūties karcinoma audinių pavyzdžių, Robo1 buvo įrodyta, kad būti per išreiškė, ir tai buvo įrodyta, kad sukelti migracijos krūties vėžio ląstelių linijų [37]. Slit2-Robo1 signalizacijos palengvina glioma ląstelių migraciją [36] ir dalyvauja angiogenezę didinant kraujagyslių tankį ir auglio masę auglio ksenografiniuose modelį [30]. Wang , et al.,
Parodė, kad per išraiška Robo1 naujų kraujagyslių navikų sukelia vėžį neovaskuliarizacrjqin ir augimą per tarp Robo1 ir jo ligando, Slit2 sąveika. Jie taip pat nustatė phosphoinositide-3-kinazės (PI-3k) kaip vartotojų vykdymo elemento iš Slit2 /Robo1 signalizacijos. Tai rodo, kad egzistuoja plyšio Robo1-PI-3K kaskadą, kuri gali sukelti į phosphoinositol-3,4,5-trifosfato kartos ir vėliau aktyvavimo mažų GTPases kad tarpininkauti ląstelių judėjimą ir rekonstruoti aktino citoskeleto [30] [35]. Priešingai, kiti tyrimai teigė, kad Robo1 downregulation sukelia trynimų ar epigenetinių pakeitimai gali vaidinti svarbų vaidmenį navikų progresavimo [69] - [73]. Mes siūlome, kad audinių konkreti išraiška modelis egzistuoja už plyšio robo genuose.

dabartinės studijų, mes nustatėme, kad Robo1 buvo dažnai išreiškė didelės koncentracijos invazinių ląstelių ir esant žemai lygių neinvazinių ląstelių , tuo tarpu PPN-218 rodoma priešingą išraišką modelis. Kai mes perkeltų Mir-218-ekspresijos vektorių, ir slopina oligonukleotidai į MKN28-M ir MKN28 nm ląstelių, atitinkamai, atvirkštinis išraiška modelis buvo pastebėtas tarp miR-218 ir Robo1, tai yra, jei Pasaulis-218 išraiška buvo didelis, Robo1 išraiška buvo mažas ir atvirkščiai. Šis rezultatas buvo dar kartą patvirtino klinikinių mėginių ir liuciferazės veiklos tyrimus. Taip pat pastebėjome, kad išraiškos Robo1 indukcija pagal Robo1 mutantas konstruktą be Mir-218 privalomą svetainėje negalėjo pakeisti Pasaulis-218-tarpininkaujant slopinimas naviko ląstelių invaziją. Priešingai, triuškinantis ir Robo1 genų ekspresiją RNAi turėjo įtakos mažinant auglio ląstelių invaziją, panašų į tą, kad PPN-218 atkūrimo poveikį, nors vien Robo1 nokdaunas parodė silpną poveikį. Tai gali būti dėl Robo1 yra ne tik tikslinė miR-218, kuri yra susijusi su naviko metastazių. Šie rezultatai rodo, kad invazija slopinimo efektas miR-218 yra bent iš dalies tarpininkaujant per į Robo1 išraiškos sumažėjimas. Tai taip pat pirmasis tyrimas rodo, kad navikas susijęs genas Robo1 neigiamai reglamentuoja miR-218 per konkretaus taikinio (NT 971-978) per 3'-UTR. Robo1 receptorių yra labai svarbus atsakant į ekstraląsteliniuose signalų ir korinio fenotipo pokyčius; Todėl, stora reguliavimas Robo1 receptorių pagal miR-218, gali palengvinti tvirtesnį signalo perdavime. Anti-Robo1 monokloninis antikūnas buvo pranešta, kad veiksminga gydyti Robo1 ekspresija vėžio [30], [33]. Šioje studijoje, mes nustatėme naują inhibitoriaus Robo1, PPN-218, kurie potencialiai gali būti gydomos kai kurios vėžio rūšys.

Kaip minėta pirmiau, Slit1, Slit2 ir Slit3 sudaro plyšiai šeimą baltymai. Nors genai sutampa, jų išraiškos būdus ir funkcijos yra skirtingos. Buvę du baltymai yra žinoma, kad dalyvauti AXON orientavimo ir ląstelių migraciją [37], [74], o Slit3 dalyvauja organų ir organų sistemų, įskaitant diafragmą ir inkstuose [75] plėtrai. Sutinka su šiais duomenimis, mes nustatėme, kad Slit2, bet ne Slit3, bendravo su Robo1 skatinti GC invazija.

Be to, mes parodė, kad Mir-218 kodavimo genai buvo įsikūrę ir transkripcija kartu su plyšine genų , kuris buvo Robo1 ligandų, tokiu būdu sukuriant neigiamą grįžtamąjį ryšį, kuri reguliuoja įpjovą /Robo1 signalizacijos. Sailen Barik parodė, kad intronic Mirna, PPN-338, nutildė genus, kurie funkciniu požiūriu yra antagonistinis savo šeimininko genų produktas, tokiu būdu sukuriant teigiamą grįžtamąjį ryšį, kad padeda fiziologinės vaidmenį priimančiosios geno [76].

• PLoS ONE: Kraujagyslių CXCR4 išraiška - romano antiangiogeniniai Tikslinė skrandžio vėžio
• PLoS ONE: Triukšmo slopinimo ir Claudin-11 yra susijęs su padidėjusia invazijos skrandžio vėžio Cells