PLoS ONE: MicroRNA-9 slopina proliferaciją, invazija ir metastazių skrandžio vėžio ląsteles per Nukreipimas cikloniniai D1 ir Ets1

Anotacija

Naujausi duomenys rodo, kad pakitęs MicroRNA-9 (MIR-9) išraiška yra susijęs skrandžio vėžio progresavimą. Tačiau tikslios pareigos ir pagrindinės mechanizmai PPN-9 platinimu, invazijos ir metastazių skrandžio vėžiu tebėra nežinoma. Šiame tyrime, PPN-9 buvo nustatyta, kad žemyn reguliuojama ir atvirkščiai koreliuoja su ciklino D1 raiškos ir V-ETS erythroblastosis viruso E26 onkogeno homologas 1 (Ets1) skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų. Bioinformatika analizė atskleidė spėjamus Pasaulis-9 privalomus svetainių 3'-neišverstų regionuose (3'-UTR), iš ciklino D1 ir Ets1 mRNR. Negimdinis išraiška ar triuškinantis miR-9 lėmė reaguodama pakitusi išraišką ciklino D1, Ets1 ir jų tolesniems tikslų fosforilinamos Retinoblastoma ir matricos metaloproteinazės 9 išaugintų skrandžio vėžio ląstelių linijų SGC-7901 ir AGS. Į liuciferazės reporteris sistemos, PPN-9, tiesiogiai nukreipta į 3'-UTR iš ciklino D1 ir Ets1, ir šie reiškiniai buvo panaikinta mutavo Mir-9 jungimosi vietų. Per išraiška miR-9 slopino platinimu, invazija, ir metastazes SGC-7901 ir AGS ląstelės in vitro, parsisiųsti ir in vivo
. Restauravimas miR-9 tarpininkaujant žemyn reguliavimo ciklino D1 ir Ets1 pagal laikinas transfekciją gelbėjo vėžio ląsteles nuo sumažėjusios dauginimosi, migracijos ir invazijos. Be to, anti-Pasaulis-9 inhibitorius skatino dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląsteles, o beldžiasi žemyn ciklino D1 arba Ets1 dalies phenocopied su poveikį miR-9 pernelyg išraiška. Šie duomenys rodo, kad Pasaulis-9 slopina ciklino D1 ir Ets1 išraišką per jungimosi vietų jų 3'-UTR, todėl slopina dauginimąsi, invazija ir metastazes skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Zheng L Qi T, Yang D, Qi, M, Li D, Xiang X, ir kt. (2013) MicroRNA-9 slopina proliferaciją, invazija ir metastazes skrandžio vėžio ląsteles per Nukreipimas cikloniniai D1 ir Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. Doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

redaktorius: Alejandro H. Corvalán, Pontificia Universidad Catolica de Čilė, Čilė

Įstojo rugsėjo 14, 2012 m Priėmė: Gruodžio 29, 2012 m Paskelbta 31 sausio 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Zheng et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Palaikoma Nacionalinis gamtos mokslų fondas Kinijos (Nr 30.600.278, Nr 30.772.359, Nr 81.071.997, Nr 81.072.073, Nr 81.272.779), programa New Century Puikus talentus universiteto (NCET-06-0641), mokslinių tyrimų fondas grįžo užjūrio kinų mokslininkai (2008-889) ir fundamentinių tyrimų fondus Centrinės universitetuose (2012QN224). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio pasaulyje [1]. Nepaisant to, kad chirurginės ir multimodalinio terapijos gerinimo, išplitusiu skrandžio vėžiu, prognozė tebėra prasta dėl recidyvo, invazija ir metastazių, su 5 metų išgyvenamumas žemiau 30% [1]. Geriau pažinti mechanizmus pagrindinių naviko progresavimas yra pateisinama atrasti naujų paradigmų diagnozės ir gydymo skrandžio vėžio [2]. Mikro RNR (miRNAs), neseniai nustatė Kategorija mažų ir labai konservatyvių nekoduojamame RNR, gali dalyvauti po transkripcijos reguliavimo genų ekspresiją per dalinė papildo privalomus su 3 'neišverstų regionuose (3'-UTRs) tikslinės mRNR, todėl Pritaikymo represijos ar iRNR degradacija [3]. Atsiranda įrodymų matyti, kad miRNAs dalyvauja biologinių procesų, susijusių su apoptozę platinimu, diferenciacija, invazija ir metastazių, o dereguliavimas kuris yra labai svarbus vėžio inicijavimo ir progresavimo [3]. Šiuo metu yra skubiai ištirti miRNAs vaidmenis ir jų tikslines genų naviko progresavimo pagal eksperimentiniais modeliais.

žmogaus skrandžio vėžio, buvo pranešta iš miRNAs skaičius bus nenormaliai per išreiškė arba žemyn reguliuojama per skrandžio vėžio progresavimas, įskaitant ir miR-21 [4], miR-15b [5], ir miR-16 [5], ir miR-101 [6]. Šie miRNAs žaisti onkogeninių arba auglio-slopinančio vaidmenis ląstelių augimo, migracijos ir invazijos reglamento represuoti savo tikslinę genus. Pavyzdžiui, onkogeninė Pasaulis-21 yra nenormaliai per išreikštas skrandžio vėžio ir pagerina platinimu ir invaziškumo skrandžio vėžio ląstelių nukreipiant Reversion skatinančius cisteino turtingas baltymų su Kazal motyvai [4]. Tuo tarpu, PPN-15b ir Pasaulis-16 žemyn reguliuojama skrandžio vėžio, ir prisidėti prie pasipriešinimo skrandžio vėžio ląstelių vaistams taikant moduliavimą apoptozės per orientacija B ląstelių leukemija /limfoma 2 [5]. Pasaulis-101 yra žemyn reguliuojama skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų, o negimdinis išraiška miR-101 žymiai slopina proliferaciją, migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląstelių nukreipiant stipriklis iš zeste homologas 2, citochromo c oksidazės subvieneto II ir mieloidinių ląstelių leukemija seka 1 [6]. Todėl buvo dėmesio toliau tirti išraišką ir funkcijos Mirna į naviko biologijos skrandžio vėžio.

MicroRNA-9 (MIR-9) pirmą kartą įvardyta kaip vienas iš svarbiausių reguliuotojų plėtros , fiziologija ir patologija nervų sistemos keliose organizmų, įskaitant Drosophila
, zebrafish ir žinduolių [7] - [9]. Vėlesniu tyrimų serija parodė, kad pakeista miR-9 išraiška yra susijęs su vystymosi ir progresavimo vėžio [10] - [14]. Ankstesni tyrimai rodo, kad Pasaulis-9 yra gerokai žemyn reguliuoja skrandžio vėžiu, o tai reiškia savo potencialius vaidmenis naviko progresavimo [15] - [18]. Jis taip pat nurodė, kad Pasaulis-9 gali moduliuoti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją per orientacija uodegos tipo homeozinis genas 2 (CDX2) [19], ir NF-Kappa B (NF-κB) [16]. Tačiau tiksli funkcija ir pagrindines mechanizmai PPN-9 skrandžio vėžio progresavimo dar negarantuoja tolesnio tyrimo. Šiame tyrime mes įrodyti, pirmą kartą, kad Pasaulis-9, tiesiogiai skirta cikloniniai D1 ir V-ETS erythroblastosis virusų E26 onkogeno homologą 1 (Ets1) ir slopina proliferaciją, invazija ir metastazes skrandžio vėžio ląstelių in vitro parsisiųsti ir vivo
.

Rezultatai

Pasaulis-9 buvo žemyn reguliuojama ir atvirkščiai koreliuoja su ciklino D1 ir Ets1 raiškos skrandžio vėžio audiniuose ir ląstelių linijų

Jei ištirti mir-9 raišką skrandžio vėžiui, skrandžio vėžiui audinių ir gretimos ne neoplastiniu gleivinės buvo renkami iš 86 pirminių atvejų. Realaus laiko kiekybine PGR atvirkštinės transkripcijos (AT-PGR) atskleidė, kad Pasaulis-9 buvo žemyn reguliuoja skrandžio vėžio audiniuose negu gretimos ne neoplastiniu gleivinės ( P
= 0,001, pav. 1A). Mir-9 raiška buvo statistiškai reikšmingai mažesnis skrandžio vėžio atvejų su gilesniu skrandžio sienelės invazijos ( P
< 0,001), limfmazgių metastazės ( P
< 0,001), tolimos metastazės ( P
= 0,022) ir pažangiosios TNM stadija ( P
= 0,01) (lentelė S1). Priešingai, didesnis cikloniniai D1 ir Ets1 stenograma koncentracija buvo aptikta skrandžio vėžio audiniuose ( P
< 0,0001 ir P
. ≪. 0,0001, atitinkamai, pav 1B ir 1C pav). Ten buvo atvirkštinė koreliacija tarp Pasaulis-9 raiškos ir cikloniniai D1 stenograma lygių skrandžio vėžio audiniuose ( P
. ≪ 0,001 pav 1D). Be to, atvirkštinis ryšys tarp Pasaulis-9 raiškos ir Ets1 stenograma lygių taip pat buvo pažymėta, šių vėžio audiniuose ( P
. ≪ 0,001 pav 1e). Žemutinė Pasaulis-9 raiška ir aukštojo stenograma lygiai ciklino D1 ir Ets1 buvo pastebėtas skrandžio vėžio ląstelių linijų, nei normaliomis skrandžio epitelio GES-1 ląstelių [20] (pav. 1F). Imunohistocheminį dažymo buvo atliekama siekiant stebėti nuo ciklino D1 ir Ets1 ekspresiją šių vėžio bandinių (S1 pav.). Branduolinė cikloniniai D1 buvo pažymėta 26/86 (30,2%) atvejais, o branduolinės ir citoplazma dažymo Ets1 buvo pastebėtas 58/86 (67,4%) atvejų (lentelė S1). Iš ciklino D1 ir Ets1 reaktyvumas buvo reikšmingai didesnis skrandžio vėžio atvejų su gilesniu skrandžio sienelės invazijos ( P
< 0,001 ir P
= 0,001), limfmazgių metastazių ( P
< 0,001 ir P
< 0,001), tolimos metastazės ( P
< 0,001 ir P
< 0,001), ir pažangių TNM stadija ( P
< 0,001 ir P
= 0,004) (lentelė S1). Žemutinė Pasaulis-9 raiška buvo pastebėtas skrandžio vėžio audiniuose su aukštuoju imunodažymu iš cikloniniai D1 ( P
< 0,0001 pav 1G.) Arba Ets1 ( P
. ≪ 0,0001 pav 1H ). Šie rezultatai parodė, kad Pasaulis-9 buvo žemyn reguliuojama ir atvirkščiai koreliuoja su išraiškos ciklino D1 ir Ets1 skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų.

Pasaulis-9 žemyn sureguliavo ciklino D1 ir Ets1 išraiška per postą -transcriptional represijos

Jei ištirti hipotezę, kad Pasaulis-9 gali turėti įtakos ciklino D1 ir Ets1 išraišką skrandžio vėžio, skaičiavimo prognozavimas atliko Mirna duomenų bazėse. Galimas privalomi svetainės PPN-9 su didelio papildomumo buvo pažymėta bazių 2974-2995 iš cikloniniai D1 3'-UTR ir 2648-2670 iš Ets1 3'-UTR (pav. 2A). Ištirti tiesioginį poveikį PPN-9, taikomų ciklino D1 ir Ets1 raiškos skrandžio vėžio ląsteles, mes atlikome Mirna daugiau ekspresijos eksperimentus. Stabilus transfekcija miR-9 pirmtakas į SGC-7901 ir AGS ląstelių lėmė padidinti PPN-9 lygių (S2 pav.). Vakarų dėmė, AT-PGR ir realaus laiko kiekybine PGR parodė, kad per išraiška miR-9 lėmė sumažėjęs baltymų ir transkripcijos lygio ciklino D1 ir Ets1 skrandžio vėžio ląstelių, nei perkeltų su neigiamu kontroliniu vektoriaus (maketas) ( pav. 2B, pav. 2C, ir pav. 2D). Be to, iš fosforilinto retinoblastoma (PRB, tolesnis efektorinE iš ciklino D1) [21] ir matricos metaloproteinazės 9 (MMP-9, tolesnis genas Ets1) [22] buvo sumažėjęs miR-9 per ekspresija vėžio ląstelių kiekis (pav. 2B, pav. 2C, ir pav. 2D). Toliau nagrinėti slopinančią vaidmenį PPN-9 ciklino D1 ir Ets1 išraiška, mes atliekame Mir-9 triuškinantis eksperimentus transfekuojant anti-miR-9 arba neigiamos kontrolės (anti-NC) inhibitoriais į GES-1, Tarybos generalinis sekretoriatas -7901 ir AGS ląstelės. Transfekavimas anti-miR-9 inhibitoriaus akivaizdžiai sumažėjo endogeninę miR-9 išraiška (S3A pav.), Ir aktyvinama baltymų lygius nuo ciklino D1, PRB, Ets1 ir MMP-9 nei transfekuota su anti-NC (pav. 2E ir pav. S4A). Realaus laiko kiekybine PGR analizė parodė padidėjusius stenograma lygius ciklino D1, Ets1 ir MMP-9 kultūroje ląstelių perkeltų su anti-Pasaulis-9 inhibitorių, palyginti su tų, perkeltų su anti-NC (Pav. 2F ir pav. S4b). Apskritai, šie rezultatai rodo, kad Mir-9 žymiai slopino ciklino D1 ir Ets1 išraišką per po transkripcijos represijų.

Pasaulis-9, tiesiogiai nukreipta cikloniniai D1 ir Ets1 skrandžio vėžio ląstelių

Jei nustatyti, ar Pasaulis-9 gali slopinti ciklino D1 ir Ets1 išraišką nukreipiant savo privalomus svetainių 3'-UTR, PGR produktai, kurių sudėtyje yra nepaliestas tikslines svetaines ar mutacija Pasaulis-9 sėklų pripažinimo sekų (3a pav.) buvo įtrauktos į liuciferazės reporteris vektorius. Plazmidės buvo pernešta į skrandžio vėžio ląstelių stabiliai transfektuotose neigiamos kontrolės vektoriaus (maketas) arba Pasaulis-9 pirmtakas. Renilla
liuciferazės veikla standartizuoti tų Firefly buvo žymiai sumažintas SGC-7901 ir AGS ląstelių stabiliai transfektuotose Pasaulis-9 pirmtakas (3b pav.), Ir šis poveikis buvo panaikinta mutavo spėjamas MIR-9 jungimosi vietų viduje 3'-UTR ir ciklino D1 ir Ets1 (3b pav.). Be to, parbloškimo miR-9 su anti-miR-9 inhibitoriaus padidėjo liuciferazės veiklą GES-1, SGC-7901 ir AGS ląstelės (3C pav. Ir S4C pav.), O mutacija miR-9 atpažinimo vieta panaikino šias poveikį (pav. 3C ir S4C pav.). Šie rezultatai parodė, kad Pasaulis-9 tiesiogiai ir konkrečiai bendravo su tikslinių vietų 3'-UTR ir ciklino D1 ir Ets1.

Pasaulis-9 slopino in vitro
platinimu skrandžio vėžio ląsteles per orientacija ciklino D1

Kadangi aukščiau įrodymai parodė, kad Pasaulis-9 slopino ciklino D1 išraiška, ir derinant faktus, cikloniniai D1 vaidina svarbų vaidmenį ląstelių ciklo progresavimo ir platinimu vėžinių ląstelių [21], mes taip pat ištyrė poveikį miR-9 per saviraiškos ir tikslinio geno Restoration on išaugintų skrandžio vėžio ląsteles. Western Blot ir realaus laiko kiekybine PGR nurodė, kad transfekavimas ciklino D1, bet ne Ets1, išgelbėjo ir miR-9-sukeltas down-regulation iš ciklino D1 (pav. 4a ir 4b pav.). Kolonijas formavimosi tyrime, PPN-9 per išraiškos silpnos, kad SGC-7901 ir AGS ląstelių augimą, palyginti su tų, perkeltų su neigiamos kontrolės vektoriaus (maketas) (. 4C pav). Tėkmės citometrijos nurodė, kad Pasaulis-9 per išraiškos sukelto ląstelių ciklo arešto metu G _{0 /G 1 etapas SGC-7901 ir AGS ląstelių (pav. 4d). Be to, transfekavimas ciklino D1, bet ne Ets1, į SGC-7901 ir AGS ląstelių atkūrė platinimu slopinimas ir ląstelės ciklo suėmimą, sukeltą per išraiškos PPN-9 (Pav. 4C ir pav. 4d). Kita vertus, mes išanalizavome miR-9 triuškinantis poveikį GES-1, SGC-7901 ir AGS ląstelių. Įvadas anti-miR-9 inhibitorių į šias ląsteles lėmė didesnius sugebėjimus platinimu (pav. S3B) ir ląstelės ciklo progresavimo (S3C pav.). Šie rezultatai parodė, kad Mir-9 nepaprastai slopino in vitro
neplatinimo ir ląstelės ciklo progresavimas skrandžio vėžio ląsteles per orientacija ciklino D1.}

Pasaulis-9 susilpnintas in vitro
migracija ir invazija į skrandžio vėžio ląsteles per orientacija Ets1

Kadangi ankstesni tyrimai rodo svarbius vaidmenis Ets1 invazija ir metastazių vėžinių ląstelių [23], [24], mes toliau tyrė miR- poveikį 9 per saviraiškos ir tikslinio geno restauravimo dėl migracijos ir invazijos į skrandžio vėžio SGC-7901 ir AGS ląsteles. Vakarų dėmė ir realaus laiko kiekybine PGR nurodė, kad transfekciją Ets1, bet ne ciklino D1 gelbėjo Mir-9 sukeltos žemyn reguliavimo Ets1 (pav. 5a ir 5b pav.). Be transwell migracijos tyrimas, skrandžio vėžio ląstelės stabiliai perkeltų su Pasaulis-9 pirmtakas pristatė silpnaregiams migracijos talpos nei tie, perkeltų su neigiamos kontrolės vektoriaus (maketas) (. 5C pav). Be Matrigel invazijos metodu, PPN-9 per išraiškos silpnos, kad SGC-7901 ir AGS ląstelių (pav. 5d) invazinis. Be to, transfekavimas Ets1, bet ne nuo ciklino D1, į SGC-7901 ir AGS ląstelių linijų atkurta ir miR-9-meditaed slopinimas dėl migracijos ir invazijos (pav. 5C ir pav. 5D). Be to, mes išnagrinėjome PPN-9 triuškinantis poveikį GES-1 SGC-7901 ir AGS ląsteles. Transfekcijq anti-Pasaulis-9 inhibitorių atsirado padidintu migracijos ir invazijos į šių ląstelių (pav. S3D ir S3E pav.). Šie rezultatai parodė, kad Mir-9 nepaprastai silpnos in vitro
migracija ir invazija į skrandžio vėžio ląsteles per Orientavimas Ets1.

Pasaulis-9 susilpnintas augimą ir metastazes skrandžio vėžio ląstelių in vivo

kitas tyrė PPN-9 veiksmingumą prieš naviko augimui ir metastazių in vivo
. Stabilus transfekcija miR-9 pirmtakas į SGC-7901 arba AGS ląstelių susilpnėjimas augimą ir svorį poodinio ksenografiniuose navikų athymic nuogas pelėms, jei lyginsime su stabiliai perkeltų su neigiamos kontrolės vektoriaus (maketas) (. 6A ir pav pav. 6B ). Be to, nuo ciklino D1, Ets1 ir pasroviui MMP-9 raiška buvo sumažintas stabilios transfekciją miR-9 pirmtakas (6C pav.). CD31 teigiamas vidutinis laivo tankis buvo sumažintas per navikų suformuotų injekcijos vėžinių ląstelių stabiliai transfektuotose Pasaulis-9 pirmtako (. 6D pav). Eksperimentiniuose metastazės tyrimų, SGC-7901 arba AGS ląstelės stabiliai perkeltų su Pasaulis-9 pirmtakų nustatytų statistiškai mažiau plaučių metastazių kolonijų nei juoktis grupės (pav. 6e). Šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-9 slopino augimą ir metastazes skrandžio vėžio ląstelių in vivo
.

triuškinantis iš ciklino D1 ir Ets1 phenocopied Pasaulis-9 per išraiškos slopinamos ant platinimu migracija ir invazija į skrandžio vėžio ląstelių in vitro

Kadangi minėti rezultatai parodė neigiamą reguliavimą ciklino D1 ir Ets1 išraiškos miR-9, mes iškėlė hipotezę, kad ciklino D1 ir Ets1 triuškinantis galėtų daryti panašų poveikį išaugintų skrandžio vėžio ląsteles. Maži trukdančių RNR (siRNAs) skirtos kodavimo regionas ciklino D1 ir Ets1, SI-CCND1 ir Si-Ets1, buvo suprojektuotas ir perkeltų į SGC-7901 ir AGS ląsteles. Transfekcijq Si-CCND1 ir Si-Ets1 lėmė sumažėjęs išraišką ciklino D1, PRB, Ets1 ir MMP-9 skrandžio vėžio ląsteles, atitinkamai, jei lyginsime su perkeltų su peštynės siRNA (SI-SCB) (. 7A pav pav . 7D ir S5 pav.). Nokdaunas iš ciklino D1 slopino platinimu ir sukeliama ląstelių ciklo suėmimą tuo G _{0 /G 1 etapas SGC-7901 ir AGS ląstelių (pav. 7B ir pav. 7C). Be to, triuškinantis ir Ets1 į SGC-7901 ir AGS ląstelių susilpnėjimas galimybes migracijos ir invazijos (7E pav. Ir 7F pav.). Šie rezultatai rodo, kad triuškinantis iš ciklino D1 ir Ets1 phenocopied (turėjo panašius fenotipų iki) Pasaulis-9 per saviraiškos slopina proliferaciją, migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląstelių in vitro
.}

Diskusijos

Ji buvo gerai nustatyta, kad mir-9 raiška aprašymą vėžį remiasi pasiskirstymo audiniuose. Pirminės smegenų auglių, PPN-9 yra padidėjusi ir veikia kaip esminio veiksnio nervų kancerogenezėje [10]. Pasaulis-9, taip pat per išreikštas gimdos kaklelio vėžio [11], o tai rodo jos navikų aktyvatorius vaidmenį navikų vystymąsi ir progresavimą. Tačiau, miR-9 yra žemyn reguliuojama keliomis žmogaus vėžio, įskaitant kasos vėžio [12], kiaušidžių vėžio [13] ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio [14], ir yra susijęs su piktybinio progresavimo krūties vėžio [25] ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio ( 14). Luo , et al.,
Pažymėti žemyn reguliavimą PPN-9 24 skrandžio vėžiu egzempliorių [15], kuris vėliau buvo patvirtinta 9 [16], 72 [17] ir 13 [18] skrandžio vėžys atvejai. Tačiau Inoue , et al.,
Pranešė PPN-9 ląstelę 5 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams realaus laiko PGR pagrįstas Mirna masyvai [26], o tai skiriasi konstatavimo Pasaulis-9 raiškos profilyje gali būti dėl į ribotų egzempliorių heterogeniškumo. Šiame tyrime mes įrodyti, kad Pasaulis-9 yra gerokai žemyn reguliuojama 86 pirminių skrandžio vėžio egzempliorių nei gretimose ne navikinių audinių, kurie yra suderinti su ankstesnių tyrimų išvadas [15] - [18]. Svarbu tai, kad mes taip pat patvirtina, kad Pasaulis-9 raiška yra atvirkščiai susijęs su klinikiniais etapais, invazija, ir metastazių skrandžio vėžio. Žmonėms, brandus Pasaulis-9 yra užkoduotas trijų nepriklausomų genų, MIR-9-1, MIR-9-2 ir mir-9-3, nukreipiantys į chromosomų 1, 5 ir 15, atitinkamai [27]. Ankstesni tyrimai rodo, kad žemyn reguliuojama ir miR-9 raiška skrandžio vėžys yra dėl nukrypusiu nuo normos hypermethylation Promotorių regione miR-9 koduojančių genų ekspresiją, [17]. Panašiai, nukrypęs nuo normos, hypermethylation miR-9 šeimos genų yra taip pat pranešimų, kad kai pirminius navikus su limfmazgių metastazių, pavyzdžiui, gaubtinės žarnos vėžio, plaučių vėžio, krūties vėžio, ir melanomos [14], [28]. Svarbu tai, kad dabartinis tyrimas pranešė atvirkštinę koreliaciją tarp Pasaulis-9 lygius bei ciklino D1 ir Ets1 raiškos skrandžio vėžio audiniuose, o tai reiškia, kad cikloniniai D1 ir Ets1 gali būti neigiamai reglamentuoja Pasaulis-9.

Ši funkcija ir tikslinių genų miR-9 yra auglio specifinis ir priklauso nuo mobiliojo ryšio kontekste. Pasaulis-9 gali slopinti El cad išraišką krūties vėžio [29], todėl branduolinės perkėlimas beta-kateninai ir jo junginių su transkripcijos veiksniai, T-ląstelių faktoriaus /limfoidinė stipriklis koeficientas 1, ir po to iki reguliuojama transkripciją genai, kurie palengvina ląstelių proliferaciją bei angiogenezę [29]. Priverstinis Pasaulis-9 raiška krūties vėžio ląstelių linijas, taip pat rezultatų dideliais ekspresijos pokyčius daugelio genų p53 susijusių apoptozės kelias [30]. Per tiesioginį taikymą NF-κB, negimdinio išraiška miR-9 slopina in vitro, parsisiųsti ir vivo
augimas kiaušidžių vėžio ląstelių [31] ir augimo ir metastazių melanomos [32] , Be neuroblatoma, per išraiškos PPN-9 slopina invazija, metastazių ir angiogenezę vėžinių ląstelių per orientacija matricos metaloproteinazę 14 [33]. WAN , et al.,
Pranešė, kad per išraiška miR-9 slopinamas in vitro, parsisiųsti ir vivo
augimas skrandžio adenokarcinoma ląstelių linijos MGC803 per represuoti NF-κB ne po transkripcijos lygio [16]. Tačiau neseniai atliktas tyrimas, Rotkrua , et al.,
Nurodė, kad Pasaulis-9 gali būti įtraukti į skrandžio kancerogenezėje per apačią reguliavimo CDX2 ir nokdaunas miR-9 sumažėjo in vitro
proliferacija skrandžio vėžio MKN-45 ląstelių [19], o jų rezultatai turi būti toliau stiprinami miR-9 daugiau ekspresijos, tikslinio geno gelbėjimo, ir vivo
studijų. Be to, šiuo metu prieštaringai ar CDX2 vaidina onkogeninio arba auglio slopinamojo vaidmenį skrandžio kancerogenezėje [34], [35]. Be to, potencialūs vaidmenys PPN-9 invazija ir metastazių skrandžio vėžio nebuvo iki šiol neišaiškinta. Taigi, funkcija ir tiesioginės tikslai PPN-9 skrandžio vėžys orderio tolesniam tyrimui.

Šiame tyrime mes parodė, kad per išraiška miR-9 ardo tą dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląsteles, kuris buvo panašus į ciklino D1 arba Ets1 triuškinantis, tai rodo, galimą taikymą, miR-9 ", skirto skrandžio vėžio terapijos tikslą. Be to, mūsų duomenys patvirtino, kad Pasaulis-9, tiesiogiai nukreipta ciklino D1 ir Ets1 skrandžio vėžio ląsteles per 3'-UTR liuciferazė reporterio testą. Nuo naujausi duomenys rodo, kad tam tikri miRNAs gali alternatyviai moduliuoti genų ekspresiją, sąveikaudamas su projektų rengėjais [36] - [38], potencialūs vaidmenys PPN-9 reguliuojant ciklino D1 ir Ets1 transkripciją per bendrauja su projektų rengėjais lieka neaiškūs ir garantuojate, mūsų dar tyrimas. CIKLONAS D1 Proto-onkogeno kad priklauso G _{1 ciklinų šeima, ir vaidina svarbų vaidmenį ląstelinio ciklo G 1 S perėjimo prisijungdamas savo partneriais ciklino priklausoma kinazės 4 ir 6 fosforilinti ir nukenksminti RB baltymų [21]. Per išraiška cikloniniai D1 anksti renginys kancerogenezėje žmogaus storosios žarnos, stemplės ir tulžies pūslės vėžio [39], ir yra prognostinis rodiklis susijęs su prasta išlikimo stemplės, krūties ir šlapimo vėžio [39]. CIKLONAS D1 per išraiška žmogaus vėžio nušviečiamas daugeliu mechanizmų, įskaitant genomo pakitimai, po transkripcijos reguliavimo ir po transliacijos baltymų stabilizavimui [39]. Naujausi duomenys rodo, kad Pasaulis-16-1 malšina ciklino D1 išraiška po transkripcijos lygio per privalomas jos 3'-UTR mantijos ląstelių limfoma [40]. Atsižvelgiant į dabartinę studijų, mūsų rezultatai parodė, kad Pasaulis-9 slopinamos apie ląstelių ciklo progresavimo ir ląstelių proliferacijos buvo išgelbėti atkūrimo ciklino D1 raiškos skrandžio vėžio ląstelių, tai rodo, kad ciklino D1 identifikavimas kaip Pasaulis-9 taikinio geno, gali paaiškinti, bent jau iš dalies, kodėl per-išraiškos miR-9 slopinamas skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją.}

Ets1, priklausantis ETS šeimos transkripcijos faktorius narys, rišasi su tam tikrais DNR sekų, kurių sudėtyje yra GGAA /T pagrindinį motyvą [22], ir dalyvauja naviko invazija ir metastazių per transkripcijos reguliavimo keletą genų, atsakingų už tarpląsteliniame remodeling, migracijos, ir invazijos, pavyzdžiui, matricos metaloproteinazės ir urokinazė plazminogeno aktyvatoriaus [22]. Iki šiol, vis daugiau klinikinių tyrimų parodė svarbius vaidmenis Ets1 naviko vystymosi ir progresavimo įvairių solidinių navikų [23], [24]. Ankstesni tyrimai rodo, kad Ets1 išraiška yra susijusi su klinikos ypatybių skrandžio vėžio, įskaitant naviko infiltracijos ir limfmazgių ar distalinio metastazių, tai rodo jos lemiamą vaidmenį invazijos ir metastazių skrandžio vėžio [41]. Tačiau mechanizmus, sukeliančius per saviraiškos skrandžio vėžio Ets1 tebėra beveik nežinomas. Naujausi tyrimai rodo, kad po transkripcijos reguliavimo Ets1 pagal miR-125b krūties vėžio ląstelių [42], ir miR-200B endotelio ląstelių [43]. Šiame tyrime mes parodė, kad kaip tiesioginis tikslo miR-9, Ets1 buvo iki reguliuojama skrandžio vėžio ir prisidėjo prie migracijos ir invazijos į vėžines ląsteles. Nokdaunas iš Ets1 dalies phenocopied į PPN-9 poveikį per saviraiškos skrandžio vėžio ląstelių linijas, o restauracija Ets1 išraiškos išgelbėjo vėžines ląsteles MIR-9 slopinamos dėl migracijos ir invazija, atskleisti romano po transkripcijos reguliavimo mechanizmas iš Ets1 pagal miR-9 ir jos klinikinių potencialų skrandžio vėžio.

Apibendrinant, mes parodė, pirmą kartą, kad ir miR-9 slopina, kad nuo ciklino D1 ir Ets1 išraiška per tiesiogiai skirta jų 3 ' taip -UTR, slopina proliferaciją, invazija ir metastazes skrandžio vėžio ląsteles. Šis tyrimas apima žinias apie ciklino D1 ir Ets1 reglamentavimo po transkripcijos lygio Mirna, ir rodo, kad Pasaulis-9 gali būti potencialių reikšmių kaip naują terapinį tikslą skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

Ligonių audinio mėginiai

patvirtinimas atlikti šį tyrimą buvo gauta iš institucinių peržiūros valdybos Tongji medicinos koledžo (patvirtinimo numeris: 2010-S003). Parafino-įterptųjų ir švieži pavyzdžiai 86 pirminių skrandžio vėžio atvejų buvo gauti iš Chirurgijos departamento Sąjungos ligoninės Tongji medicinos koledžo. Jų patologinė diagnostika buvo įrodyta mažiausiai dvi patologai. Demografiniai ir klinikos duomenys visiems pacientams buvo apibendrinti S1 lentelėje. Šalia skrandžio gleivinė, kad nebuvo jokios makroskopinį auglį taip pat buvo gauta, o ne navikiniai sritys vėliau buvo patikrinti mikroskopu histologiją. Šviežių naviko pavyzdžiai ir gretimų ne neoplazminė gleivinė buvo kaupiami ir saugomi -80 ° C iki naudojimo.

imunohistocheminis

imunohistocheminį dažymo buvo atliktas anksčiau aprašytas [44], su antikūnai specifiniai CIKLONAS D1 Ets1, MMP-9 ir CD31 (Abcam Inc ", Cambridge, MA, 1: 200 skiedinius). Neigiama kontrolė įtraukti lygiagrečios pjūvis gydomi neveikimo pirminio antikūno, be to į gretimą skyrių pačiame bloke kurioje pirminis antikūnas buvo pakeistas to triušio polikloninio IgG (Abcam Inc) kaip izotipo kontrolės. Reaktyvumo laipsnis buvo įvertintas mažiausiai dvi patologams nežinant klinikos funkcijų auglių. Iš pozityvumo laipsnis pradžių buvo klasifikuojami pagal teigiamų vėžinių ląstelių procentais, kaip taip: (-) < 5% ląstelės teigiamas, (+1) 6-25% ląstelių teigiami, (2+) 26-50% ląstelių teigiamas , ir (3+) > 50% ląstelės teigiamas. Skaidrės su vidutinio teigiamas (2+) arba stipri teigiama (3+) reaktyvumo buvo klasifikuojama kaip turinti "aukšto išraiška", o skaidres neigiami (-) arba silpna teigiama (+1) reaktyvumas buvo klasifikuojamos kaip turintys "mažą raišką" .

Vakarų dėmė

Mobilieji baltymų ekstrahuojamas 1 × ląstelių lizės buferiniame tirpale (Promega, Madison, WI). Baltymų (50 mikrogramų) Iš kiekvieno mėginio buvo atliktas 4-20% iš anksto-lieto poliakrilamido gelyje (Bio-Rad, Hercules, CA) elektroforezės ir perkelti ant nitroceliuliozės membranos (Bio-Rad). Dėl ciklino D1, Ets1, MMP-9, PRB ir β-aktino (Santa Krusas Biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija) aptikimo, pirminiai antikūnai skiedinius buvo 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 ir 1: 1000, atitinkamai, o po to 1:3000 praskiedus ožkos anti-triušio krienų peroksidazės žymėto antikūno (Bio-Rad). Glaudesnis chemiluminescencja substratas komplektas (Amersham, Piskatavėjus NJ) buvo naudojamas chemiluminscent nustatymo signalų autoradiografavimą filmas (Amersham).

AT-PGR ir realaus laiko kiekybine PGR

Iš viso RNR buvo išskirta su RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Atvirkštinės transkripcijos reakcijos buvo atliktas su Transcriptor First Strand sintezei Kit (Roche, Indianapolis, IN). PGR gruntai ciklino D1, Ets1, MMP-9 ir beta-aktino buvo sukurta "Premier" Primer 5.0 programinės įrangos (lentelė S2). RT-PGR buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [44]. Realaus laiko kiekybine PGR su SYBR Green PGR Master Mix (Applied Biosystems Foster City ĮA) buvo atliekamas naudojant ABI PRISM 7700 Eilės detektorius (Applied BIOSYSTEMS). Fluorescencinės signalai buvo renkami pratęsimo fazės metu, Ct reikšmės mėginių buvo apskaičiuojamas ir stenograma lygiai ciklino D1, Ets1 ir MMP-9 buvo normalizuotas tiems beta-aktino 2 ^{-ΔΔCt metodu.}

kiekybinis Pasaulis-9 raiškos

subrendusių miR-9 pirminė audinių ir ląstelių linijų koncentracija buvo nustatoma naudojant bumbulas ciklo ™ miRNAs qPCR pradmenimis (RiboBio Co Ltd, Guangzhou, Kinija). Po kDNR buvo susintetintas su Mirna konkrečių kamieninių kilpa gruntas, kiekybinė PGR buvo atliekama su konkrečių gruntams (lentelė S2). Mir-9 koncentracija buvo normalizuotas tiems iš U6 snRNA.

Mirna tikslas prognozavimas

Mirna tikslai buvo prognozuojama taikant algoritmus Miranda miRDB, RNA22 ir Targetscan [45]. Identifikuoti genus dažniausiai prognozuojama keturių skirtingų algoritmų, numatomų tikslų rezultatai buvo kerta naudojant miRWalk [46].

Mobilusis kultūra ir transfekcija

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (SGC-7901 ir MKN-74) ir SV40-pertvarkyta, normalus ir ne tumorogeniškas skrandžio epitelio GES-1 ląstelės [20] buvo gauti iš tipas kultūros kolekcijos Kinijos mokslų akademija (Šanchajus, Kinija). Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija "AGS (CRL-1739) buvo įsigytas forma American Type Culture Collection (Rockville, MD). Ląstelės buvo auginamos RPMI1640 terpės (Life "technologijas, Inc., Gaithersburg, MD), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (Life Technologies, Inc.), penicilinui (100 V /ml) ir streptomicino (100 mikrogramų /ml). Ląstelės buvo palaikoma 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO _2.

• PLoS ONE: Asociacija tarp mažinimo Plazminiai adiponektino kiekį kraujyje ir rizikos bakterinės infekcijos po skrandžio vėžio chirurgijos
• PLoS ONE: išraiška AFP ir STAT3 dalyvauja Arseno trioksidas sukeltos Apoptozė ir slopinimas platinimu AFP gaminančios skrandžio vėžio ląsteles