PLoS ONE: MicroRNA 219-2-3p functies als een tumor suppressor bij maagkanker en wordt gereguleerd door DNA Methylation

De abstracte

Achtergrond & Doelstellingen

Maagkanker is de meest voorkomende gastro-intestinale tumor bij volwassenen en is de meest dodelijke vorm van kanker bij de mens. Ondanks de verbeteringen van behandelingen, wordt het onderliggende mechanisme van maagkanker niet bekend. Om nieuwe modulatoren die gevoeligheid reguleren tumorgenese te definiëren, hebben we ons gericht op miR-219-2-3p.

Methods

Kwantitatieve RT-PCR werd gebruikt om het niveau van miR-219-2 te onderzoeken -3p bij maagkanker (GC) weefsel (n = 113) en bij elkaar passende aangrenzend normaal weefsel (n = 113). In vitro celproliferatie, apoptose-assays, celmigratie en invasie assays werden uitgevoerd om de biologische effecten van miR-219-2-3p helderen. Sinds zwijgen van miRNA door promotor CpG eiland methylering kan een belangrijk mechanisme in tumorgenese zijn, werden GC cellen behandeld met 5-aza-2'-deoxycytidine en trichostatine A, en expressie veranderingen van miR-219-2-3p werden vervolgens onderzocht door middel van kwantitatieve RT-PCR. Ten slotte is de methylatie status van CpG eiland stroomopwaarts van miR-219-2-3p werd geanalyseerd door methylatie-specifieke PCR in GC weefsels (n = 22).

Resultaten

miR-219- 2-3p werd down-gereguleerd in GC en cellijnen. Bovendien, de experimenten beschreven lagere expressie van miR-219-2-3p in GC monsters met hogere rang en later stadium tumoren. Ondertussen, miR-219-2-3p uitgeoefend antiproliferatieve proapoptotische en antimetastatische rollen en verlaagde niveaus van p-ERK1 /2 in GC cellen. Bovendien 5-aza-2'-desoxycytidine en trichostatine A verhoogde de expressie (-2-voudig) van miR-219-2-3p GC cellen. Door methylatie-specifieke PCR, DNA methylatie in het stroomopwaartse gebied van miR-219-2-3p werd gedetecteerd in beide aangrenzende normale weefsels en kankerweefsels. Zoals verwacht, het methylatie niveau lag aanzienlijk hoger in de miR-219-2-3p down-gereguleerd groep dan up-gereguleerd groep.

Conclusies

miR-219-2-3p is potentieel betrokken bij maagkanker en metastase door het reguleren ERK1 /2-gerelateerde signaalpaden, die een nieuwe therapeutische strategie kan voorzien in de behandeling van maagkanker. Methylatie mechanisme kan worden betrokken bij het moduleren van de expressie van miR-219-2-3p bij maagkanker

Visum:. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, Dong L, Wang B, et al . (2013) MicroRNA-219-2-3p functies als een tumor suppressor bij maagkanker en wordt gereguleerd door DNA-methylatie. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10.1371 /journal.pone.0060369

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 14 december 2012; Aanvaard: 26 februari 2013; Gepubliceerd: 23 april 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China [2012, 91.129.716, om JY] en het Beijing Municipal Science & Technologie Commissie [2010B071, om JY]. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de 4 ^{e meest voorkomende vorm van kanker en de tweede hoogste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd. Tegenwoordig patiënten met late stadium GC met een totale 5-jaars overleving van ongeveer 20% [1]. Kanker ontwikkelt zich als gevolg van een samenstel zijn van verschillende endogene en exogene oorzaken. Eetgewoonten en een toename van Helicobacter pyloriinfection belangrijke exogene oorzaken GC [2], terwijl genetische, alsmede voeding, niveaus van het hormoon gastrine [3], en andere chronische maag-ontsteking veroorzakend factoren in verband gebracht gepredisponeerd tot kankerontwikkeling. Gene veranderingen spelen een belangrijke rol bij GC en veranderingen in een groot aantal oncogenen en tumorsuppressorgenen reeds gemeld in GC.}

Sommige prognostische tumor biomarkers in GC zoals humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2 ), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) zijn epidermale groeifactor receptor (EGFR), geassocieerd met ziektekenmerken en kan daarom worden gebruikt om patiënten betreffen. Zo kunnen patiënten met tumoren die positief voor HER2 worden behandeld met trastuzumab plus chemotherapie [4], en patiënten met tumoren die positief voor VEGF kan worden behandeld met bevacizumab plus chemotherapie testen [5]. Echter, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van GC blijven een uitdaging, dus extra informatieve biomarkers zijn dringend nodig.

MicroRNA (miRNA) zijn een klasse van kleine RNA-moleculen die betrokken zijn bij de regulatie van de vertaling en de afbraak van mRNA [6 ]. MiRNAs binden aan complementaire sequenties in de 3 'onvertaalde gebieden (UTR) van het doelwit mRNA en mRNA afbraak of translationele onderdrukking induceert [7]. De meeste bekende functies van miRNAs zijn gerelateerd aan de negatieve genregulatie: miRNAs stilte genexpressie, meestal door te interfereren met mRNA stabiliteit of eiwit vertaling. De laatste jaren werden miRNAs verondersteld om als oncogen of tumorsuppressorgen, en bijdragen aan kanker initiatie en progressie door het reguleren van genexpressie [8]. De ontdekking van kankerspecifieke stroomopwaartse gebied hypermethylatie van verschillende miRNAs heeft epigenetisch mechanisme voor afwijkende miRNA expressie [9], [10] getoond.

In de humane en muizen zijn twee genomische loci (miR-219- 1 en miR-219-2) dat miR-219 voorloper transcripten coderen. miR-219-1 bevindt zich op chromosoom 6 (MI0000296) en mir-219-2 ligt op chromosoom 9 (MI0000740) [11] (Fig. 1A). De verwerking van de voorloper transcripten door snijmachine genereert drie volwassen miRNAs: miR-219-5p van de 5 'uiteinden van zowel de voorlopers en miR-219-1-3p en miR-219-2-3p van het 3' uiteinde van pre- miR-219-1 en pre-miR-219-2, respectievelijk. Aangezien het zaad regio deze drie ontwikkelde producten is uniek, wordt elke miRNA voorspeld unieke doelen reguleren. Hoewel miR-219-5p is bekend dat het down-gereguleerd in meerdere kanker zoals kwaadaardige astrocytoom [12] en leverkanker [13], de expressie van miR-219-1-3p en miR-219-2-3p heeft niet onderzocht. Interessant is dat miR-199b en miR-219-2-3p genen zich in nabijheid van een deel van chromosoom 9q34.11 (fig. 1A). Een eerdere studie aangetoond dat miR-199b-5p werd down-gereguleerd in medulloblastoom door methylering van CpG eiland 3 kb stroomopwaarts van de 5'-plaats van miR-199b-5p promotor [14]. Omdat DNA methylatie kan beïnvloeden grote gebieden van chromatine en regelen de transcriptie van genen verre, moet worden onderzocht of miR-219-2-3p neerwaarts gereguleerd en gereguleerd door methylering miR-199b-5p bij kanker. In deze studie hebben we vastgesteld dat miR-219-2-3p werd down-gereguleerd in GC weefsels en in verband met progressieve fenotypes van GC. Bovendien herintroductie van miR-219-2-3p verminderde de levensvatbaarheid van GC cellen en geïnduceerde apoptose, wat suggereert dat miR-219-2-3p een kandidaat tumor suppressor in GC. Verdere methylatie analyse van miR-219-2-3p promotor aangegeven dat haar expressie werd gereguleerd door methylatie van gecorreleerde CpG eilanden tot op zekere hoogte. Tot slot, vonden we dat miR-219-2-3p fungeerde als een tumor suppressor door middel van het remmen van de activiteit van ERK1 /2 signaalroute in GC cellen.

Resultaten

miR-219-2- 3p werd differentieel tot expressie gebracht in GC en GC cellijnen

de expressie van miR-219-2-3p GC beoordelen TaqMan RT-PCR analyse werd uitgevoerd bij 113 paren GC weefsels en gekoppeld aangrenzend normaal weefselmonsters . In vergelijking met een normale weefselmonsters, meer dan de helft van de primaire tumoren vertoonden lage niveaus van miR-219-2-3p (58%, 65 113, fig. 1B). Bovendien, vier patiënten bij wie de expressie van miR-219-2-3p waren significant neerwaarts gereguleerd werden gekozen (Fig. 1D). De miR-219-2-3p expressie bij patiënten en vier GC cellijnen (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) werd geanalyseerd om te onthullen dat miR-219-2-3p werd ook down- gereguleerd GC cellen (Fig. 1E). Deze resultaten suggereren dat-down gereguleerd miR-219-2-3p was een frequente gebeurtenis in de menselijke GC en zouden kunnen worden betrokken bij de maag carcinogenese. Door de universele neerwaartse regulatie van miR-219-2-3p in GC geteste cellijnen werden MGC-803 en HGC-27 willekeurig gekozen voor verdere studie.

Verbindingen tussen klinische en pathologische factoren en miR-219- 2-3p expressie in GC

Deze studie omvatte 113 GC patiënten. Om de correlatie tussen miR-219-2-3p expressie en klinisch-pathologische kenmerken te evalueren, werden de patiënten verdeeld in groepen met een down-regulatie en up-regulatie. Zoals getoond in tabel 1 en 1C, werd een statistisch significant verband waargenomen tussen de expressie van miR-219-2-3p GC en klinische fase. De patiënten met lagere niveaus van miR-219-2-3p expressie leek te worden geassocieerd met hoogwaardige en late stadium tumoren (p = 0,047, onafhankelijke steekproeven t-toets). Deze gegevens suggereerden dat veranderingen van miR-219-2-3p kon worden betrokken bij GC progressie.

overexpressie van miR-219-2-3p in GC cellen remt celproliferatie en overleving cel

de opmerkelijke vermindering van miR-219-2-3p expressie in GC monsters gepromoveerd ons naar de mogelijke biologische betekenis van miR-219-2-3p in tumorgenese te verkennen. Gezien het feit dat miR-219-2-3p een rol heeft gespeeld in de regulatie van celproliferatie [15], MGC-803 en HGC-27 cellen werden met miR-219-2-3p en scramble nabootst en geanalyseerd op celgroei, cel apoptose en celcyclus progressie respectievelijk. Allereerst werd RT-PCR gebruikt om het niveau van miR-219-2-3p na overexpressie experimenten meten. We vonden dat miR-219-2-3p met meer dan 100 miRNA vouwen in getransfecteerde MGC-803 en HGC-27 cellen (figuur 2a). Bovendien is de CCK-8 proliferatie assay aangetoond dat celgroei verminderd werd in miR-219-2-3p bootst getransfecteerde MGC-803 en HGC-27 cellen vergeleken met scramble getransfecteerde cellen of onbehandelde cellen (Fig. 2B). Na transfectie werden de remming bedroeg 26% (48 h) en 28% (96 h) in de MGC-803 cellen en 13% (72 h) en 14% (96 h) in HGC-27 cellen. Deze resultaten suggereren dat miR-219-2-3p inderdaad betrokken bij de negatieve regulatie van de celgroei. Er was echter geen significant effect op de celcyclus in miR-219-2-3p GC behandelde cellen (Fig. S1). Aan te pakken of up-regulatie van miR-219-2-3p GC cel apoptose en celdood, het aantal vroegtijdige apoptotische MGC-803 en HGC-27 cellen na behandeling met miR-219-2-3p bootst zou induceren werd onderzocht. Zoals verwacht, enkele vroege apoptotische cellen (10% in MGC-803 of 2,9% in HGC-27) werden gedetecteerd in de-scramble behandelde cellen, terwijl miR-219-2-3p bootst behandeling steeg het percentage van vroege apoptotische cellen (17,5 % in MGC-803 of 8,3 in HGC-27) zoals beoordeeld door Annexine V kleuring (fig. 2C). Daarom concludeerden wij dat miR-219-2-3p invloed kunnen zijn op overleving van cellen in GC cellen.

overexpressie van miR-219-2-3p in GC cellen remt celmigratie en invasie

Om verdere detecteren of miR-219-2-3p wordt geassocieerd met de progressie van GC, wondgenezing en transwell test werd uitgevoerd om het effect van miR-219-2-3p expressie analyseren de trekkende en invasieve gedrag van MGC-803 en HGC- 27 cellen. We vonden dat de invoering van miR-219-2-3p in MGC-803 en HGC-27 cellen resulteerde in een significante vermindering van celmigratie tijdens het sluiten van een wond kunstmatig gecreëerd via een confluente monolaag (Fig. 3A). Deze cellen werden tijdens wondgenezing in serumvrij medium onderhouden dat elke aangevulde migratiegedrag niet kan schaden veranderde celproliferatie. Daarnaast is het herstel van miR-219-2-3p dramatisch remde de doorgaans sterke invasieve capaciteit van MGC-803 en HGC-27 cellen, die lage endogene niveau van miR-219-2-3p (Fig. 3B) uitgevoerd. Deze resultaten gaven aan dat miR-219-2-3p overexpressie bijdraagt ​​aan de regulatie van GC celmotiliteit en progressie in vitro.

MiR-219-2-3p expressie epigenetisch gereguleerde

Op basis van de bovenstaande bevindingen concluderen we dat miR-219-2-3p was een belangrijke regulator in GC. Echter, de regulerende mechanismen van miR-219-2-3p expressie waren nog onbekend. Aangezien veel miRNAs werden geïdentificeerd als doelwit van methylatie regelgeving, zoals miR-9, miR-34b /c en miR-148a in metastatische carcinomen [16], en miR-137 en miR-193a in mondkanker [17], buitenspiegels 193b en miR-145 bij prostaatkanker [18], [19], hebben we besloten om het regelgevend mechanisme van miR-219-2-3p expressie te analyseren vanuit de genomische methylatie. Na analyse van de genomische regio verspreid over de miR-219-2-3p gen identificeerden we een grote CpG eiland (afb. 4A). Om te onderzoeken of miR-219-2-3p epigenetisch gereguleerd in GC, MGC-803, HGC-27 cellen werden behandeld met demethyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-CdR) en histon-deacetylase remmer trichostatine A (TSA). Vervolgens de expressie van miR-219-2-3p door RT-PCR geanalyseerd (Fig. 4B). De resultaten laten zien dat de expressie van miR-219-2-3p werd up-gereguleerd in twee situaties: voor de behandeling 5-Aza-CDR, de expressie van miR-219-2-3p werd up-gereguleerd in MGC-803 ( 5-aza-CdR 1,5 umol /l, 2,14-voudig) en HGC-27 (5-aza-CdR 0,5 umol /l, 3,07-voudig) vergeleken met DMSO behandelde controlegroep; voor de 5-aza-CdR en TSA combinatiebehandeling de expressie van miR-219-2-3p veel hoger in MGC-803 (5-aza-CdR 1,5 umol /l, 1,98-voudig) en HGC-27 (5 -Aza-CdR 1,5 umol /l, 1,28-voudig) vergeleken met TSA controlegroep. Deze resultaten gaven aan dat epigenetische factoren van invloed kunnen zijn miR-219-2-3p expressie in GC. Synergie van demethylering en remming van histon deacetylase leidde tot de re-expressie van miR-219-2-3p in GC. Om verder te detecteren of miR-219-2-3p werd geassocieerd met methylatie van GC, onderzochten we de methylatie status van de miR-219-2-3p upstream regio met behulp van methylatie-specifieke PCR (MSP; fig. 4C). 22 paren van weefsels (primaire tumoren en hun geëvenaard aangrenzende normale weefsels) in de 113 paren werden gekozen, waaronder 11 patiënten die een lagere miR-219-2-3p niveaus bezat (down-regulatie-groep) en 11 patiënten die hogere miR-219 bezat -2-3p niveaus (up-regulatie groep). We vonden dat DNA-methylatie in upstream regio's van miR-219-2-3p bestond in beide aangrenzende normale weefsels en kanker weefsels. De verhouding van hypermethylering stroomopwaartse gebied van miR-219-2-3p gen in de neerwaartse regulatie groep was 63,6% (7 van de 11), die boven het opregulatie groep (36,3%, 4 van de 11 was ). Deze resultaten suggereren dat de methylatie niveau van het stroomopwaartse gebied CpG van miR-219-2-3p hoger in de miR-219-2-3p was down-gereguleerd groep dan in de up-gereguleerd is.

Overexpressie van miR-219-2-3p dempt ERK1 /2 signaleringsroute

De activering van ERK1 /2 route is goed gedocumenteerd in verschillende tumor types, zoals GC [20], pancreaskanker [21] en borstkanker [ ,,,0],22]. Eerdere studies hebben het belang van ERK1 /2 signaleringsroute bij de regulering van migratie, invasie en metastase van kanker cellijnen [23]. Om te onderzoeken of miR-219-2-3p beïnvloedt cel activiteiten door middel van ERK1 /2 route, de fosforylering niveau van ERK1 /2 in MGC-803 en HGC-27 cellen werd onderzocht na miR-219-2-3p overexpressie. Cellulair niveau van p-ERK1 /2 aanzienlijk gedaald in miR-219-2-3p bootst-getransfecteerde cellen in vergelijking met scramble getransfecteerd of onbehandelde cellen. Er werd echter geen duidelijk verschil waargenomen in totaal ERK1 /2-niveau (Fig. 5A). Deze bevindingen gesuggereerd dat de versnelde groei GC cel gedeeltelijk kan te wijten zijn aan geactiveerde ERK1 /2 paden.

Bioinformatics aanpak om te zoeken naar potentiële doelwitten van miR-219-2-3p

MiRNAs moduleren gen expressie door interactie met hun doelwit mRNA resulteert in mRNA degradatie of translationele repressie. Om verder te onderzoeken het mechanisme van miR-219-2-3p in GC, we bioinformatically (TargetScan Versie 5.2 en miRDB) en functioneel betrokken miR-219-2-3p in GC, en vond de genen die het doelwit van miR-219-2- 3p (tabel S2). Onder de 371 voorspelde doelstellingen van miR-219-2-3p, 31 daarvan getoond groot potentieel aangezien zij werden voorspeld door beide programma's, terwijl andere slechts werden voorspeld door een van de programma's. Van deze 31 genen, ErbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1 werden SOX4 gevonden om oncogen of apoptose-gerelateerde genen door de vorige gepubliceerde artikelen zijn. (Fig. 5B en 5C).

Discussie

De laatste jaren bewijs verzameld geleid oncologen te speculeren dat geopenbaarde moleculaire factoren, zoals niet-coderende RNA's die voorheen als "junk" play belangrijke rol in tumorvorming en tumorprogressie. Afhankelijk van hun mRNA targets, kan miRNAs functioneren als tumor suppressors of promotoren van oncogenese. Echter, de mechanismen die miRNAs ontregelde zijn niet uitgebreid bestudeerd, met inbegrip van afwijkende miRNA biogenese en transcriptie [24], [25], epigenetische veranderingen [26], [27], en versterking of verlies van genomische regio's die miRNAs coderen [28] .

Zoals blijkt in dit verslag, we de expressie van miR-219-2-3p geanalyseerd 113 GC patiënten en vond dat de niveaus lijken lager in GC te zijn. Hoewel miR-219-2-3p is gemeld nauw gerelateerd aan diabetische retinopathie [29] zijn, oligodendrocyten [15], de ziekte van Alzheimer [30] en glioblastoom [12], zijn functie in GC nog worden bepaald. Verder hebben we aangetoond dat re-expressie van miR-219-2-3p GC cellen resulteerde in de inductie van apoptose en cellevensvatbaarheid verlaagde. Deze resultaten konden we dat down-regulatie van miR-219-2-3p speculeren kan een overlevingsvoordeel te verstrekken aan GC cellen. Echter, het mechanisme dat verantwoordelijk is voor de miR-219-2-3p down-regulatie in GC is nog onbekend. Omdat het verlies bij 9q34.11, waarbij miR-219-2-3p ligt, wordt zelden waargenomen in GC [31], is het onwaarschijnlijk dat allele verlies verantwoordelijk voor de neerwaartse regulatie. Aan de andere kant vonden we dat miR-219-2-3p merkelijk opgereguleerd bij GC cellen, MGC-803 en HGC-27 werden behandeld met zowel 5-aza-CdR en TSA. Bovendien, computational analyse blijkt dat miR-219-2-3p ligt in een CpG eiland op chromosoom 9q34.11. Daarom lijkt het mogelijk dat DNA methylatie en histon deacetylering kan gepaard gaan met miR-219-2-3p regulering. Door MSP, monsters methylatie frequenties gedetecteerd in het stroomopwaartse gebied van miR-219-2-3p was hoger in de miR-219-2-3p down-gereguleerd groep dan in de up-gereguleerd groep. Deze specificiteit ingerichte de hypothese van een relatie tussen miR-219-2-3p expressie en DNA-methylatie. Over het algemeen zijn de resultaten suggereerden dat methylatie was een belangrijk mechanisme voor miR-219-2-3p down-regulatie in GC.

Wij uitgevoerd voorspelling door TargetScan en miRDB programma's en vond dat 6 genen kunnen zijn mogelijke doelwitten van miR -219-2-3p. Onder de kandidaat-doelwitten van miR-219-2-3p, de receptortyrosinekinasen ErbB3 (epidermale groeifactor receptor familie) trok onze aandacht. Hoge niveaus van ErbB3 sterk geassocieerd met tumorprogressie en slechte prognose voor patiënten met GC [32] - [34] en de EGFR kinaseremmers gefitinib kunnen voorkomen EGFR en ERBB2 activering van ErbB3. Ondertussen, ErbB3 expressie dient ook als een effectieve voorspeller van gevoeligheid voor gefitinib [35]. Het is bekend dat ErbB3 onderdrukte transcriptie remt signaaltransductiecascades van ERK1 /2 routes [36]. Echter, de voorspelde doelwitgenen verder experimenteel bevestigd. Bovendien kan miRNAs functioneert volgens een combinatorische circuits model, waarbij een miRNA meerdere mRNAs kan richten, en verschillende miRNAs tezamen tot expressie gebracht kan een enkel mRNA targeten. Recente studies hebben gesuggereerd dat de biologische begrip 'one hit-multiple targets' kunnen worden gebruikt in de klinische therapieën [37]. Het is waarschijnlijk dat een specifieke miRNA kan verricht door samenwerking neerwaartse regulatie van meerdere doelen en miRNA functie ook door het onderdrukken van de vertaling van hun doelgenen. Om de volledige impact van een miRNA, genoom-brede proteomics studies moeten worden gedaan te verkennen.

Tot slot, onze expressie en functionele studies suggereerden dat miR-219-2-3p differentieel werd uitgedrukt door methylatie mechanisme en had een tumor onderdrukking functie door het reguleren ERK1 /2-gerelateerde signaalpaden in GC. Intussen is de lagere expressie van miR-219-2-3p in GC exemplaren was gecorreleerd met een hogere rang en later stadium. Herinvoering expressie van miR-219-2-3p van GC cellen onderdrukt celproliferatie, migratie en invasie geïnduceerde apoptose aangegeven dat miRNA-gebaseerde theraputic patroon kan dienen als basis voor de ontwikkeling van nieuwe potentiële therapieën bij maagkanker.

Materialen en methoden

weefselmonsters

maag tumoren en hun morfologisch normale weefsels (gevestigd > 3 cm afstand van de tumor) werden verkregen tussen november 2009 en november 2011 vanaf 113 GC patiënten die chirurgie aan kanker ziekenhuis van de Chinese Academie van Medische Wetenschappen (CICAMS, n = 21), de Chinese PLA General Hospital (301 ziekenhuis, n = 31), en The First Affiliated Hospital van de Shanxi Medical University (n = 61). Het gebruik van het weefsel monsters voor alle experimenten werd goedgekeurd door de ethische raad van bestuur van het Instituut voor Basic Medische Wetenschappen, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen. Alle deelnemers ontvangen hun verbale geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan deze studie, en hun verbale geïnformeerde toestemming werden opgeschreven. Deze toestemming proces werd ook goedgekeurd door de ethische raad van bestuur. Weefselmonsters werden gesneden in twee delen, één werd gefixeerd met 10% formaline voor histopathologische diagnostiek, en de andere werd direct snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -196 ° C in vloeibare stikstof tot RNA-extractie. Deze groep bestond uit 95 mannen, 17 vrouwen en één zonder geslacht informatie met een mediane leeftijd van 58 jaar (range, 31-82 jaar) .Formalin-gefixeerd paraffine ingebed weefsel blokken van GC werden verzameld uit het Hospital Cancer van de Chinese Academie van medische Wetenschappen (CICAMS, n = 4) tussen 2009 en 2011. Als gevolg van individuele verschillen tussen patiënten, misten we informatie van een aantal clinicopathologic data. Het gebruik van de weefselmonsters voor alle experimenten werd door alle patiënten en ethische commissie van de instelling. De kenmerken van de patiënten worden beschreven in tabel 1.

celkweken en transfectie

Totaal 4 humane cellijnen MGC GC-803 (mucinous maagkanker, slecht gedifferentieerde), HGC-27 ( metastatische lymfeklier, ongedifferentieerd carcinoom), MKN-45 (Signet ring carcinoom slecht gedifferentieerde), werden SGC-7901 (adenocarcinoom, matig gedifferentieerd) in deze studie onderzocht. Het MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901-cellijn werd gekocht van de Cell Resource Center van het Institute of Basic Medische Wetenschappen, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen en Peking Union Medical College (Beijing, China). MGC-803 werd gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Duitsland), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, PAA, Pasching, Austria) en streptomycine (100 ug /ml), penicilline (100 U /ml). De HGC-27, MKN-45, SGC-7901 werden in RPMI 1640 medium (PAA) aangevuld met 10% FBS (PAA) gehandhaafd. De humane cellijnen MGC GC-803, HGC-27 werden getransfecteerd met miR-219-2-3p bootst en negatieve controle miRNA nabootst (GenePharma, Shanghai, China, Tabel S1) in een uiteindelijke concentratie van 10 nmol /L gebruikt Dharmafect 1 (Thermo Fisher, IL, USA) volgens de instructies van de fabrikant

TaqMan RT-PCR voor expressie miRNA

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de cellen en weefsels met Trizol reagens (Invitrogen, Calsbad. , CA, USA). MiRNAs werden gekwantificeerd door real-time PCR met behulp van TaqMan MicroRNA assay (Invitrogen, USA). Eerste streng complementair DNA (cDNA) synthese werd uit 1 ug totaal RNA in 12 pl eindvolume bevattende 2 M stamlus primer, 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, USA) uitgevoerd. Het mengsel werd plaat bij 65 ° C gedurende 5 minuten, en daarna gemengd met 5 x RT-buffer, 0,1 M DTT, 200 U /pl MultiScribe transcriptase en 40 U /pl RNase remmer (Invitrogen, USA) achteruit. Het mengsel werd plaat bij 37 ° C gedurende 55 min, 70 ° C gedurende 15 min en vervolgens gehouden op -20 ° C. Real-time PCR werd uitgevoerd met een standaard TaqMan PCR protocol. De 20 pi PCR reacties inbegrepen 1 pl RT product, 1 × Universal TaqMan Master Mix en 1 x TaqMan probe /primer mix (Invitrogen, USA, Tabel S1). Alle RT reacties met inbegrip van no-template controles werden uitgevoerd in drievoud. Alle mRNA kwantificering gegevens genormaliseerd tot U6. De relatieve hoeveelheid transcript werd berekend met behulp van de vergelijkende werkwijze Ct.

5-aza-CdR en trichostatine A behandeling van cellijnen

GC cellijnen MGC-803 werd behandeld met 5-aza 2'-deoxycytidine (5-aza-CdR, Sigma-Aldrich, USA) en 0,7 umol /L, 1,5 umol /l, 3 umol /L en HGC-27 werden behandeld met 5-aza-CdR op 0,5 umol /L, 1 umol /L, 1,5 umol /L 3 dagen of 300 nmol /L trichostatine A (TSA; Sigma-Aldrich, USA) gedurende 24 uur. Voor de combinatiebehandeling werden de cellen behandeld met 5-aza-CdR gedurende 48 uur beginnen. Vervolgens TSA (300 nmol /L) werd toegevoegd en de cellen werden nog eens 24 uur. Kweekmedium dat geneesmiddel werd vervangen om de 24 uur. RNA van cellijnen werd gezuiverd met TRIzol reagens volgens de instructies van de fabrikant. cDNA synthese werd uitgevoerd zoals eerder beschreven, en 1 ml van de verdunde cDNA voor elk monster werd geamplificeerd door RT-PCR met de hierboven beschreven protocol.

DNA isolatie en bisulfiet modificatie

Genomisch DNA werd verkregen van -196 ° C in vloeibare stikstof primaire tumoren en bij elkaar passende aangrenzend normaal weefsel (n = 22, 11 omvatten patiënten die expressie van miR-219-2-3p werden neerwaarts gereguleerd en de anderen werden opwaarts gereguleerd) en gebruikte Biomed DNA Kit (Biomed, Beijing, China) volgens de instructies van de fabrikant. (; Hilden, Duitsland Qiagen) bisulfiet behandeling en herstel van de monsters werden uitgevoerd met de Epitect bisulfiet kit uitgevoerd. Genomisch DNA (2 ug) in 20 pl water werd voor elke reactie en gemengd met 85 pi mix bisulfiet en 35 pl DNA beschermen buffer. 99 ° C gedurende 5 min, 60 ° C gedurende 25 min, 99 ° C gedurende 5 min, 60 ° C gedurende 85 min, 99 ° C gedurende 5 min, 60 ° C gedurende 175: bisulfiet conversie werd als volgt uitgevoerd op een thermocycler min en 20 ° C oneindig. De bisulfiet behandelde DNA werd teruggewonnen door Epitect spinkolom en vervolgens gesequenced om de efficiëntie van bisulfiet conversie bevestigen.

methyleringsanalyse

MSP werd gebruikt voor methylatie van miR-219-2-3p analyseren stroomopwaartse gebied in cellijnen en weefsels. Methprimer werd gebruikt om MSP primer (tabel S1) te ontwerpen. MSP reacties op nieuwe primers werden geoptimaliseerd met behulp gemethyleerde positieve controle (M-DNA), die met normale humane perifere lymfocyten DNA in vitro behandeld SSS I methyltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA). Het DNA van twee normale humane perifere lymfocyten werd als normale controle. Touchdown PCR bestond uit twee fasen: fase 1 omvatte een initiële denaturatie van 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 45 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, gloeien bij temperatuurschommelingen gedurende 30 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 40 s. In de eerste cyclus werd de annealing temperatuur naar 58 ° C en bij elk van de 10 volgende cycli werd de hybridisatietemperatuur verlaagd met 0,6 ° C. Fase 2 bestond uit 35 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 52 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 40 s. MSP producten werden geanalyseerd op 3% polyacrylamidegels

celproliferatie, apoptose en celcyclus analyse

De cellen werden geïncubeerd in 10% CCK-8. (DOJINDO, Kumamoto, Japan) verdund in normale kweekmedium bij 37 ° C tot visuele kleur conversie heeft plaatsgevonden. Proliferatiesnelheden werden bij 0, 24, 48, 72, 96 uren na transfectie. De absorptie van elk putje werd gemeten met een microplaat lezer ingesteld op 450 nM en 630 nM. Alle experimenten werden uitgevoerd in viervoud. De apoptose-assay werd uitgevoerd op MGC-803 en HGC-27 cellijnen 72 uur na transfectie met de PE Annexine V Apoptose Detectie Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) en geanalyseerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) . Celcyclus werd uitgevoerd op MGC-803 en HGC-27 cellijnen 48 uur na transfectie met miR-219-2-3p bootst en scramble respectievelijk. Cellen werden geoogst, tweemaal gewassen met koude PBS, in ijskoude 70% ethanol gefixeerd en geïncubeerd met propidiumjodide (PI) en RNase A, vervolgens geanalyseerd door FACS. Elk monster werd uitgevoerd in drievoud.

Cell migratie en invasie assays

MGC-803 en HGC-27 cellen werden gegroeid tot confluentie op 12-wells plastic platen en behandeld met scramble of miR-219 -2-3p imiteert. 24 uur na transfectie, lineaire scratch wonden (in drievoud) werden gemaakt op de samenvloeiing celmonolagen met behulp van een 200 ul pipetpunt. Cellen van de celcyclus voorafgaand aan verwonding te verwijderen, werden de cellen in serumvrij medium gehouden. Op gemigreerde cellen en wondgenezing te visualiseren, werden beelden genomen op 0, 12, 24, 36, 48, 60 en 72 h uur. Een totaal van tien gebieden werden willekeurig gekozen uit elk putje en de cellen in drie wells van elke groep werden gekwantificeerd. Voor de invasie assays, na 24 uur transfectie, 1 x 10 ^{5 cellen in serumvrij medium werden gezaaid op de transwell migratie kamers (8 urn poriegrootte, Millipore, Zwitserland) die zijn bekleed met Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) op de bovenste kamer. Medium met 20% FBS werd aan de onderste kamer toegevoegd. Na 24 uur werden de niet-binnendringende cellen verwijderd met watten, invasieve cellen op het onderoppervlak van de kamer werden gekleurd met May-Grunwald-Giemsa-kleuring (Sigma Diagnostics, St. Louis, Missouri, USA) en geteld onder de microscoop (Olympus, Tokyo, Japan). Experimenten werden onafhankelijk driemaal herhaald.}

eiwitisolatie en Western blotting

Op de aangegeven tijden, MGC-803 cellen en HGC-27 cellen werden geoogst in ijskoude PBS en gelyseerd op ijs in koude bereiding van gemodificeerde radioimmunoprecipitatie buffer aangevuld met proteaseremmers. De eiwitconcentratie werd bepaald met de BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Milaan, Italië) en gelijke hoeveelheden eiwitten werden geanalyseerd door SDS-PAGE (10% acrylamide). Gels werden geëlektroblot op nitrocellulose membranen (Millipore, Bedford, MA, USA). Voor immunoblot experimenten werden membranen geblokkeerd gedurende 2 uur met 5% vetvrije droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween-20 en geïncubeerd bij 4 ° C overnacht met primair antilichaam. Detectie werd uitgevoerd door peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen met de versterkte chemiluminescentie systeem. Primaire antilichamen gebruikt werden, waren: GAPDH van Zhong Shan Golden Bridge (Beijing, China); ERK1 /2 (konijn anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) en fosfo-ERK1 /2 (konijn anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolab, NEB)

Histologie

weefsels werden overnacht gefixeerd in gebufferde formaline, ingebed in paraffine, gesneden tot 3 urn dik, en gekleurd met hematoxyline-eosine (H &E). kleuring

Bioinformatics en statistische analyses van gegevens
<

• PLoS ONE: hoge expressie van heat shock protein 90 wordt geassocieerd met Tumor agressiviteit en een slechte prognose bij patiënten met gevorderde maagkanker
• PLoS ONE: Noninvasive Visualisatie van MicroRNA-16 in de chemoresistance van maagkanker met een dual Reporter Gene Imaging System