PLoS ONE: PKG II remt EGF /EGFR-Induced Migration van maagkanker Cells

De abstracte

Achtergrond

Onze vorige onderzoeksresultaten toonden aan dat type II cGMP afhankelijk proteïne kinase (PKG II) kon blokkeren de activering van epidermale groeifactor receptor (EGFR) en daarmee de proliferatie en de bijbehorende MAPK /ERK gemedieerde signaaltransductie van maagkanker cellijn BGC-823 remt, suggereert dat PKG II kunnen staan ​​andere EGFR geactiveerd signaaltransductieroutes en aanverwante biologische activiteiten van maagkanker cellen. Dit document werd ontworpen om de potentiële remming van PKG II op EGF /EGFR-geïnduceerde migratie activiteit en de daarmee verband houdende signaaltransductie te onderzoeken.

Methodologie /voornaamste bevindingen

In maagkanker cellijn AGS, expressie en activiteit van PKG II verhoogd door het infecteren van de cellen met construct codeert PKG adenovirale II cDNA (Ad-PKG II) en behandelen van de cellen met cGMP analoge 8-pCPT-cGMP. Fosforylering van eiwitten werd gedetecteerd door Western Blotting en actieve kleine G-eiwit Ras en Rac1 werd gemeten door "Pull-down" methode. Celmigratie activiteit werd gedetecteerd met trans-well apparatuur. Binding tussen PKG II en EGFR werd gedetecteerd met Co-IP. De resultaten toonden EGF gestimuleerde migratie van AGS cel en het effect was gerelateerd aan PLCγ1 en ERK-gemedieerde signaaltransductie. PKG II remde EGF-geïnduceerde migratie-activiteit en geblokkeerde EGF-geïnitieerde signaaltransductie van PLCγ1 en MAPK /ERK-gemedieerde paden door het voorkomen van EGF-geïnduceerde Tyr 992 en Tyr 1068 fosforylering van EGFR. PKG II gebonden met EGFR en veroorzaakte threonine fosforylering ervan.

Conclusie /Betekenis

Onze resultaten systemisch bevestigt de remming van PKG II on-EGF-geïnduceerde migratie en aanverwante signaaltransductie van PLCγ1 en MAPK /ERK-gemedieerde paden, wat aangeeft dat PKG II heeft een fargoing remming op EGF /EGFR-gerelateerde signaaltransductie en biologische activiteiten van maagkanker cellen door fosforylering EGFR en het blokkeren van de activering ervan

Visum:. Jiang L, Lan T , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II remt EGF /EGFR-Induced Migration van maagkanker Cells. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10.1371 /journal.pone.0061674

Editor: Vladislav V. Glinskii, Universiteit van Missouri-Columbia, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 30 september 2012; Aanvaard: 12 maart 2013; Gepubliceerd: 16 april 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China, No.81272755, No.31040002, No.81001100 en No.31100974; De Innovation Grant van Jiangsu University. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Type II cGMP-afhankelijke eiwitkinasen (PKG II) is een serine /threonine kinase en accumuleren onderzoeksgegevens aangegeven dat dit kinase een belangrijke rol in het reguleren celbiologische activiteiten zoals proliferatie en apoptose had, vooral in tumorcellen . In 2004, Cook et al, vond dat PKG II apoptose van de humane gekweekte prostaat stromale cellen kunnen veroorzaken [1]. In 2009, Swartling et al
gemeld dat PKG II remde proliferatie van menselijke neuroglioma cellen en de remming werd samen met de afname van de expressie van transcriptiefactor SOX9 en de fosforylatie van Akt [2]. In 2011, Fallahian et al, vond dat cGMP apoptose van borstkankercellen kon veroorzaken en dit effect was gerelateerd aan PKG II [3]. Tijdens ons onderzoek bleek dat de expressie en de activiteit van PKG II in menselijke maagkanker cellijnen waren significant lager dan die van normale maagslijmvlies cellen [4]. Nader onderzoek in ons laboratorium toonden dat PKG II de proliferatie van maagkanker cellijnen en EGF- geïnduceerde signaaltransductie van MAPK /ERK-gemedieerde route door het voorkomen van de activering van de EGFR door EGF kan remmen [5], [6]. Aangezien de activering van EGFR verschillende signaaltransductiewegen zoals MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT en PLCγ1 gemedieerde routes initiëren [7], [8], het blokkerende effect van PKG II bij activering van EGFR suggereert dat dit enzym kan een breed scala remmend effect op signaaltransductie en de gerelateerde biologische activiteiten van maagkanker cellen. Dit document werd ontworpen om dit breed scala remmende effect van PKG II te bevestigen door middel van het onderzoeken van de remming van PKG II on-EGF-geïnduceerde migratie activiteit en de daarmee verband houdende signaaltransductie bij maagkanker cellen.

Resultaten

PKG II remt EGF-geïnduceerde celmigratie die is geassocieerd met signaaltransductie van PLCγ1 en MAPK /ERK-gemedieerde Pathways

celmigratie is belangrijk in normale fysiologie en ziekte. Verwerving van vermogen tot migratie van kankercellen is een eigenschap, die verspreiding van uitgezaaide tumorcellen gelegen organen. Recente gegevens toonden aan dat EGF de migratie van kankercellen zouden kunnen stimuleren. Het mechanisme waardoor EGF stimuleert celmigratie is niet duidelijk, maar sommige gegevens blijkt dat EGF kan dit doen door middel van het initiëren van signaaltransductie van PLCγ1 en MAPK /ERK-gemedieerde paden. In dit experiment, detecteerden we de migratie stimulerende effect van EGF in AGS cellen en gebruikt remmer van belangrijke componenten in de signaalwegen naar de mogelijke signaaltransductie geassocieerd met het effect te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat EGF behandeling verhoogde de migratieactiviteit AGS cellen en zowel MEK (sleutelcomponent van MAPK /ERK-gemedieerde pathway) remmer U0126 en PLCγ1 remmer U73122 remde EGF geïnduceerde migratie, wat aangeeft dat EGF gestimuleerde celmigratie activiteit door middel van het activeren van zowel MAPK /ERK en PLCγ1 gemedieerde signaaltransductie (fig. 1).

PKG II Blokken EGF-geïnduceerde Tyr Tyr 992 en 1068 Fosforylering van EGFR

Als EGF bindt met EGFR, veroorzaakt auto- fosforylatie van de receptor. Er zijn verschillende auto-fosforylatieplaatsen die zijn verbonden met verschillende signaaltransductieroute. Tyrosine 992 en tyrosine 1068 behoren tot de auto-fosforylatieplaatsen van EGFR en worden geassocieerd met PLCγ1 gemedieerde respectievelijk MAPK /ERK-gemedieerde signalering. In dit experiment hebben we het remmende effect van PKG II op tyrosine 992 en 1068 Tyrosine fosforylering van EGFR in verschillend behandeld AGS cellen met Western blotting. De resultaten lieten zien dat EGF behandeling veroorzaakte een toename van 14 plooien Tyrosine 992 en een stijging van 8 plooien Tyrosine 1068 fosforylering van EGFR. In cellen geïnfecteerd met Ad-PKG II en gestimuleerd met cGMP, werd de fosforylatie significant afgenomen (fig. 2, 3). Dit wijst erop dat PKG II kan voorkomen dat EGF-geïnduceerde tyrosine 992 en 1068 Tyrosine fosforylering van EGFR en bijgevolg remmen PLCγ1-gemedieerde en MAPK /ERK-gemedieerde signalisatie.

PKG II Voorkomt EGF-getriggerd Main Events van PLCγ1-gemedieerde signaaltransductieroute

(1) PLCγ1 activering.

PLCy is de downstream-component van receptortyrosinekinasen (RTK's). Er zijn twee isovormen: PLCγ1 is alomtegenwoordig en PLCγ2 wordt hoofdzakelijk uitgedrukt in hematopoietische cellen. Activering van PLCγ1 eist van zijn rekrutering aan het membraan en de vereniging, via zijn SH2-domein, met geactiveerde RTK's, zoals EGFR. Deze associatie leidt tot de fosforylering van PLCγ1 op tyrosine residuen, met name op tyrosine 783, en een toename van de enzymatische activiteit. We pasten IP methode PLCγ1 isoleren en vervolgens gebruikt Western blot werkwijze voor de fosforylering van PLCγ1 detecteren. De resultaten lieten zien dat EGF behandeling veroorzaakte een duidelijke toename van Tyr783 fosforylering van PLCγ1 en de toename van PKG II-activiteit door middel van het infecteren van de cellen met Ad-PKG II en stimulering van de cellen met cGMP efficiënt verhinderd de EGF-geïnduceerde fosforylatie van PLCγ1 (fig. 4 ).

(2) DAG formatie.

Als het eenmaal is geactiveerd, kan PLCγ1 de hydrolyse van fosfatidylinositol 4,5-BISPHOS-fosfaat katalyseren (PI-4,5P _{2) in inositol 1,4,5-trifosfaat (IP 3) en diacylglycerol (DAG), twee moleculen die de mobilisatie van intracellulair Ca respectievelijk ^{2 + en proteïne kinase C-activiteit te reguleren. Om de effecten van EGF en PKG II op de vorming van DAG observeren, werd ELISA methode voor DAG concentratie detecteren AGS cellen. De resultaten toonden aan dat EGF gestimuleerde AGS cellen, het niveau van DAG duidelijk toegenomen en pre-infectie met Ad-PKG II en behandeling met 8p-CPT-cGMP remde de vorming van DAG door stimulatie met EGF (fig. 5).}}

(3) Ca ^{2 + vrijgeven.}

IP3 en DAG zijn tweede messengers in PLCγ1-gemedieerde signaaltransductie route. IP3 is bekend dat de afgifte van calcium gestimuleerd door inwendige winkels. We gebruikten calciumindicator fluo-3 /AM om calcium te detecteren in het cytoplasma. De resultaten toonden aan dat EGF behandeling verhoogde de afgifte van Ca ^{2+ uit endoplasmatisch reticulum (ER) naar cytoplasma en hoge expressie en activiteit van PKG II remde de afgifte, het effect van EGF behandeling omkeren (fig. 6).}

(4) Activering van PKCa.

PKCa, een isovorm van proteïne kinase C, is een belangrijk onderdeel van PLCγ1 bemiddelde signaalroute en kan worden geactiveerd door Ca ^{2+ en DAG . Geactiveerd, PKCa translokeert van cytosol naar het membraan van de cellen. Hoe hoog van PKCa op het membraan vertegenwoordigt de activering van PKCa. In dit experiment hebben we het remmende effect van PKG II op de activatie van PKCa in verschillend behandeld AGS cellen door Western blotting. De resultaten toonden aan dat binnen vijf minuten na het toevoegen van het EGF kweekmedium, de translocatie van PKCa van cytosol dramatisch membraan verhoogd en de translocatie werd geremd door pre-infecteren van de cellen met Ad-PKG II en behandeling met 8-pCPT-cGMP ( fig. 7).}

(5) Activering van CaMKIIα.

Studies over de regulering van Ca ^{2 + /calmodulin (CAM) -afhankelijke kinase II alfa (CaMKIIα), die een primaire isovorm van CaMKII, hebben gesuggereerd dat wanneer Ca 2 + /CaM bindt met CaMKIIα, intramoleculaire autofosforylering optreedt en de fosforylering handhaaft de persistente activering van het enzym. Het antilichaam tegen fosfo-CaMKIIα (Thr286) is in Western blotting toegepast op de fosforylatie van CaMKIIα detecteren. De resultaten toonden aan dat in AGS cellen behandeld met EGF, Thr286 fosforylering van CaMKIIα met bijna 2,5 vouwen en infectie met Ad-PKG II en behandeling met 8-pCPT-cGMP remde de toename van de fosforylatie geïnduceerd door EGF (fig. 8).}

PKG II remt EGF-geïnduceerde activatie van de belangrijkste onderdelen van de MAPK /ERK gemedieerde signaaltransductieroute

(1) Activering van MAPK /ERK.

MAPK /ERK is de belangrijkste component van de MAPK /ERK-gemedieerde pathway. Fosforylering zowel threonine en tyrosine 202 204 residuen van ERK1 en threonine en tyrosine 185 187 residuen van ERK2 is vereist voor volledige enzymatische activering. Het antilichaam tegen p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) is in Western blotting toegepast op de dubbele fosforylering van ERK detecteren. De resultaten toonden aan dat binnen vijf minuten na het toevoegen EGF celkweekmedium, fosforylatie van ERK1 /2 in AGS cellen dramatisch (10 vouwen) verhoogd en de fosforylering werd geremd door pre-infecteren van de cellen met Ad-PKG II en activeren van het enzym met 8-pCPT-cGMP (fig. 9).

(2) activering van ras.

Kleine G proteïne Ras is een belangrijk onderdeel van MAPK /ERK-gemedieerde signaaltransductie pathway. Het heeft twee vormen in cellen: GTP-gebonden actieve vorm en GDP-gebonden inactieve vorm. Eenmaal Ras in GTP-gebonden vorm kan binden en activeren Raf-1 en start de daaropvolgende activering van serine /threonine kinasen in de signaalroute. We pasten "pull-down" methode om de geactiveerde Ras detecteren. Het resultaat toonde dat na toevoeging van EGF aan het kweekmedium, actieve Ras in AGS cellen duidelijk verhoogd binnen vijf minuten. Infecteren van de cellen met Ad-PKG II en hen te stimuleren met 8-pCPT-cGMP voor het toevoegen EGF aanzienlijk verhinderde de EGF-geïnduceerde Ras activering (afb. 10).

PKG II remt EGF-geïnduceerde activering van RAC1

kleine G-eiwit RAC1 het belangrijkste lid van Rho familie die belangrijke rol spelen bij het reguleren van migratie van kankercellen. Zowel PLCγ1 en MAPK /ERK gemedieerde signaaltransductie kunnen RAC1 activeren en daarna stimuleren cel migratie. Om het remmende effect van PKG II op EGF /EGFR-geïnduceerde signalering die verband houdt met de migratie verder te bevestigen, "Pull-down" methode werd toegepast om de remming van PKG II bij activering van RAC1 detecteren. Het resultaat toonde dat EGF behandeling veroorzaakte een duidelijke toename van actieve RAC1 en hoge activiteit van PKG II efficiënte activering van RAC1 (fig. 11) remde. Dit leverde verder bewijs van de remming van PKG II on-EGF-geïnduceerde migratie van maagkanker cellen.

PKGII wisselwerking met EGFR en Oorzaken Thr-phoshporylation van de Receptor

Het mechanisme waardoor PKGII blokken de EGF-geïnduceerde activatie van EGFR werd voorlopig onderzocht in dit experiment. Co-immunoprecipitatie werd op de interactie tussen PKGII en EGFR detecteren. Western blotting met anti pan fosforylering van threonine antilichaam werd gebruikt om de threonine fosforylering van EGFR door PKGII detecteren. De resultaten van Co-immunoprecipitatie toonde dat AGS cellen geïnfecteerd met Ad-PKG II en gestimuleerd met 8-CPT-cGMP, directe binding tussen PKG II en EGFR werd gedetecteerd (Fig. 12, paneel A). Resultaten van Western blotting toonde aan dat activatie van PKG II veroorzaakte threonine fosforylering van EGFR (fig. 12, paneel B). Dit wijst erop dat PKG II blokkeerde de activering EGFR door binding met de receptor en het veroorzaken van fosforylering van het.

Discussie

Momenteel zijn er twee cGMP-afhankelijke proteïnekinasen (Pkgs), PKG I en II PKG , geïdentificeerd in zoogdiercellen [10], [11]. PKG I is wijd verspreid in het lichaam en door zijn remmende effect op tumorgroei en invasiviteit en inducerend effect op apoptose van tumorcellen, is geïdentificeerd als een tumorsuppressor [12]. De expressie van PKG II is weefsel beperkt [13]. Lange tijd, in tegenstelling tot de goed bewezen antitumoreffect van PKG I geen onderzoeksdata duidelijk aangegeven antitumor rol van PKG II en dit kinase was alleen betrokken bij verschillende fysiologische functies waaronder intestinale secretie, botgroei en leren en memory [14]. Uit onderzoek rente over PKG II neemt toe en een aantal nieuwe functies van PKG II zijn onlangs gevonden, met inbegrip van de rol van de PKG II bij de regulatie van epitheliale natrium kanaal en mechanisch-signaaltransductie [15] - [17]. Belangrijker accumuleren onderzoeksgegevens aan dat PKG II van proliferatie en apoptose in een aantal cellen, vooral in tumorcellen, wat sterk suggereert de mogelijke rol van dit enzym in het reguleren biologische activiteiten van tumorcellen [1] -. [6]

EGFR bestaat op het oppervlak van cellen. Met een molecuulgewicht van 170KD, EGFR heeft een extracellulair domein, een cross-membraan domein en een intracellulair domein. Het intracellulaire domein van EGFR 542 aminozuurresten en kunnen worden onderverdeeld in approximate membraan subdomein, tyrosine kinase subdomein, en C-terminale subdomein [18]. Het activeren van EGFR werkwijze omvat de tyrosinefosforylatie van zijn intracellulaire domein en verschillende fosforylatieplaatsen op het domein zijn aan verschillende signaalwegen. Wanneer EGFR is geactiveerd, kan het effector eiwitten rekruteren om haar gefosforyleerde C-terminale subdomein en initieert de effector-eiwit gemedieerde paden [19], [20]. Onder de fosforylatieplaatsen, tyrosine 1068 en 1086 zijn aan MAPK /ERK-gemedieerde route en tyrosine 992 en 1173 zijn aan PLCy-gemedieerde signaaltransductie pathway [7], [8]. Onze eerdere resultaten toonden aan dat PKG II-EGF-geïnduceerde tyrosine 1068 fosforylering van EGFR bij maagkanker cellijn kan remmen BGC-823 [6], het verhogen van de vraag of PKG II de fosforylering van andere tyrosine sites kunnen remmen op EGF /EGFR en daarna hebben een breed scala remming op EGF /EGFR-geïnduceerde signaaltransductie en aanverwante biologische activiteiten van maagkanker cellen.

In dit artikel hebben we onderzoek gedaan naar de werking van PKG II on-EGF-geïnduceerde migratie activiteit van maagkanker cellijn AGS. Het resultaat toonde dat PKG II had significante remming op celmigratie veroorzaakt door EGF. Dit levert verder bewijs voor het openbaren van de tumor remmende effect van PKG II. Onderzoeksgegevens gebleken dat er bij de EGF /EGFR ingeleid signaaltransductiewegen worden PLCγ1 en MAPK /ERK gemedieerde signaaltransductie in verband met migratie activiteit [21], [22]. Om dit te bevestigen bij maagkanker cellen, gebruikten we remmer van signaaltransductie component aan de deelname van MAPK /ERK en PLCγ1 gemedieerde paden in het proces te identificeren. De resultaten bleek dat MEK remmer U0126 en PLCγ1 remmer U73122 gedeeltelijk geblokkeerd EGF /EGFR-geïnduceerde migratie activiteit van AGS cellen, wat aangeeft dat beide signaalwegen deel aan de regulerende proces. Om het potentieel remmende werking van PKG II volgende signaaltransductie ophelderen we eerst onderzocht het remmende effect van PKG II op EGF geïnitieerd PLCγ1-gemedieerde signaaltransductie route. De resultaten toonden aan dat PKG II verhinderde alle belangrijke gebeurtenissen in deze signaaltransductieroute, waaronder de Tyr 992 fosforylatie /activatie van EGFR, de fosforylatie /activering van PLCγ1, de vorming van tweede boodschapper DAG, de afgifte van calcium in cytoplasma, en de activering van PKC en CaMK IIα. Voor de remming van PKG II op EGF /EGFR geïnduceerde MAPK /ERK gemedieerde signaaltransductie route, hebben ons eerdere werk aangetoond dat PKG II remt de activering van alle belangrijke componenten in de route geïnduceerd door EGF bij maagkanker cellijn BGC-823 [ ,,,0],6]. In dit artikel, onderzochten we het remmende effect van de PKG II op EGF /EGFR-geïnduceerde activatie van de belangrijkste componenten in deze route. De resultaten bevestigden dat PKG II remde EGF-geïnduceerde activatie van Ras eiwit en MAPK /ERK in AGS cellen, wat suggereert dat PKG II ook remde EGF /EGFR-geïnduceerde signaaltransductie van MAPK /ERK-gemedieerde pathway in deze vorm van kanker cellijn. Deze resultaten systematisch bleek dat PKG II remde EGF-geïnduceerde migratie van maagkanker cellen door het blokkeren van EGF /EGFR geïnitieerd signaaltransductie van PLCγ1 en MAP /ERK-gemedieerde paden.

De signaaltransductie van zowel PLCγ1 en MAP /ERK gemedieerde paden kan activeren kleine G-eiwit Rac1, wat een belangrijke component bij het reguleren celmigratie [23], [24]. Om de remming van PKG II op deze belangrijke gebeurtenis in de EGF-geïnduceerde migratie van GAS cellen te bevestigen, pasten we "pull-down" methode om de activiteit van Rac1 checken anders behandeld AGS cellen. De resultaten toonden aan dat tijdens EGF geïnduceerde migratie Rac1 werd geactiveerd en activering werd gerelateerd aan zowel PLCγ1 en MAP /ERK-gemedieerde signalering. Bovendien PKG II remde de EGF-geïnduceerde activatie van Rac 1. Dit remmende effect van de PKG II verder bevestigd EGF /EGFR geïnitieerd celmigratie.

EGFR is nauw verbonden met tumorigenensis. Overexpressie en mutatie van EGFR vaak voor in de meeste vormen van kanker. Onderzoeksgegevens toonden dat meer dan 50% -70% van longkanker, darmkanker en borstkanker hoge expressie van EGFR [25]. Bovendien kankerpatiënten met overexpressie van EGFR meestal slechte prognose. Bijvoorbeeld EGFR overexpressie werd gedetecteerd in 60% van niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) patiënten en de prognose van de patiënten waren slecht, met een overleving van slechts 4-5 maanden [26]. In vitro
experimenten bevestigden dat overexpressie van EGFR veroorzaakte transformatie van NIH-3T3, Rat-1 en NRK cellen belemmert EGFR activering remde proliferatie van sommige tumorcellen [27]. Bijgevolg is de eerste EGFR groeifactorreceptor genomen kankertherapie doel. Verschillende werkwijzen voor het remmen EGFR activiteit en verwante signaaltransductie, waaronder specifieke antilichamen tegen EGFR en EGFR remmers, ontvangen intensief onderzoek [28] - [30]. Nieuwe en effectievere werkwijzen blokkeren EGFR gemedieerde signaaltransductie nuttig zijn bij kankertherapie. Daarom is de vaststelling dat PKG II de activatie van de EGFR en de daaropvolgende signaaltransductie kan inhiberen heeft belangrijke betekenis. Het suggereert sterk dat PKG II is een potentiële inhibitor endogeen EGFR en nieuwe hint over strategie kanker therapie.

onderzoeksgegevens gebleken dat bepaalde proteïne kinasen fosforylatie van EGFR veroorzaken en beïnvloeden de activering en /of de bestemming. Bijvoorbeeld kan proteïne kinase C (PKC) de fosforylering van threonine 654 van EGFR veroorzaken en regelt receptor binding en internalisatie [31]. Serine 1046/1047 (Ser1046 /1047) fosforylatieplaats is vereist voor EGFR desensibilisatie in-EGF behandelde cellen [32] .In onze experimenten hebben we ontdekt de fosforylering van Thr654 en Ser1046 /1047 van EGFR en vond dat PKG II niet ertoe leiden dat de fosforylering van deze fosforylatieplaatsen. Echter, onze resultaten bleek dat er een directe interactie tussen PKG II en EGFR en PKG II veroorzaakte threonine fosforylering van EGFR. Dit gaf aan dat PKG II blokkeerde de activatie van de EGFR door binding met en fosforylering van de receptor. De exacte fosforylering site zal ons volgende onderzoek doel zijn.

Materialen en methoden

Cell Line en reagentia

Human maagkanker cellijn AGS werd verzorgd door het Institute of Cell Biology (Shanghai, China). Adenovirale vectoren die coderen voor β-galactosidase (PAD-LacZ) en PKG II (PAD-PKG II) aardig giften van Dr. Gerry Boss en Dr. Renate Pilz in de University of California, San Diego, USA Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Media (DMEM) en foetaal runderserum (FBS) waren afkomstig van GIBCO (Grand Island, NY). Het antilichaam tegen PKG II was van ABGENT Biotechnology (San Diego, CA). Geit anti-β-actine, muis anti-pan-Ras en muizen anti-PLCγ1 antilichamen uit Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Konijn-anti-p-EGFR (Tyr1068), konijn anti-p-EGFR (Tyr992), konijn anti-EGFR, muis anti-p-ERK (Thr 202 /Tyr 204), konijn anti-ERK en konijn-anti-p-PLCγ1 (Tyr783) antilichamen waren van Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Konijn anti-PKCa en konijn anti-p-CaMK IIα (Thr286) waren afkomstig Bioworld Technology (St. Louis Park, MN). Konijn anti-p-Thr antilichaam was van Abcam (MA, USA) .Horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen waren van Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). De cellulaire permeabele cGMP analoog 8-pCPT-cGMP was van Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 en U0126 waren van Sigma (St. Louis, MO). Elektrochemiluminescentie (ECL) reagentia waren van Millipore (Billerica, MA). Ca ^{2 + indicator Fluo-3 /AM en Membrane en cytosoleiwit Extraction Kit waren afkomstig Beyotime (Jiangsu, China). Human diacylglycerol (DAG /DG) ELISA Kit was van Cusabio Biotech Co., Ltd (Newark, DE). Alle andere reagentia waren van analytische kwaliteit.}

Bereiding van adenovirale vectoren

293A-cellen werden getransfecteerd met adenovirale vector coderend voor LacZ en PKG II respectievelijk en gedurende maximaal tien dagen tot CPE werd waargenomen. De cellen en het kweekmedium geoogst en ondergingen drie invriezen-ontdooien cycli. De supernatant bevattende adenovirussen (Ad-LacZ en Ad-PKG II) werden gebruikt om nieuwe 293A cellen amplificeren adenovirussen infecteren. De geamplificeerde adenovirale preparaten werden getitreerd en de pfu /ml werd bepaald, en met -80 ° C bewaard tot gebruik.

Celkweek en infectie met adenovirale vectoren

AGS cellen werden gekweekt in DMEM geleverd met 10% FBS en in een bevochtigde incubator met 95% lucht en 5% CO _{2 gehandhaafd op 37 ° C. Het medium werd elke twee dagen vervangen en de cellen werden gekweekt bij sub-confluentie. Op de dag voor infectie werden cellen vers geplant op 70-80% confluentie en de infectie met Ad-LacZ en Ad-PKG II werd uitgevoerd.}

Western Blotting

Eiwitmonsters werden onderworpen SDS-PAGE (8-12%) gel volgens de molecuulgrootte doelwiteiwit en elektroforese en overdracht membraan werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant (Bio-Rad, Hercules, CA). De primaire antilichamen werden geïncubeerd gedurende de nacht bij 4 ° C in TBS-T (2% Tween-20) en de overeenkomstige secundaire antilichamen werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in TBS-T (2% Tween-20), met drie wassingen na elke incubatie. ECL reagentia werden toegepast om de positieve banden op het membraan zien. Om densitometrie analyse uit te voeren, werden digitale beelden van de positieve banden verkrijgbaar Chemidoc XRS en geanalyseerd met het beeldanalyseprogramma Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De resultaten werden toonden als de verhouding van doelwit eiwit /laden controle.

"Pull-down" Analyse van de Active Klein G-eiwit Ras en Rac1

De activiteit van Ras werd gedetecteerd met Pull-down werkwijze zoals hiervoor is beschreven [9]. In het kort werden cellen groeien op 100-mm kweekplaat driemaal gewassen met koude PBS en gelyseerd door toevoegen van 400 ul van de lysisbuffer (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10% glycerol, 25 mM NaF , 10 mM MgCl _{2, 0,25% natriumdeoxycholaat, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3VO 4, 10 ug /ml aprotinine en 10 ug /ml leupeptine). Het monster werd verzameld en gecentrifugeerd (14000 g, 4 ° C, 10 min) om zich te ontdoen van het puin. Het supernatant werd geïncubeerd met glutathion-Sepharose kralen en glutathion S
transferase-Ras-RBD (GST-RBD) bij 4 ° C gedurende 1 uur. De korrels werden 3 maal met lysisbuffer gewassen en in gekookt water om eiwitten vrij te verwarmen. De eiwit monsters (met werkzame Ras) werden geanalyseerd door Western blotting met antilichamen tegen pan-Ras. De actieve Rac1 werd gedetecteerd met soortgelijke methode, maar met GST-Pak1 eiwit bindend domein (GST-PBD) en antilichaam tegen Rac1.}

Immunoprecipitatie

De cellen groeien op 100-mm kweekplaat werden gewassen tweemaal met koud PBS en gelyseerd door toevoeging van 1 ml RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptine, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4) per plaat. Antistoffen tegen PLCγ1 en p-PLCγ1 werden gebruikt voor immunoprecipitatie. De neerslagen werden geprobed met antilichamen tegen doeleiwitten.}

Analyse van calcium in cytoplasma

Om het effect van EGF en PKG II op EGF-geïnduceerde calciumafgifte bewaken AGS cellen werden beladen met 5 uM membraan permeabel calciumindicator fluo-3-acetoxymethyl (AM) ester gedurende 30 minuten bij 37 ° C in DMEM. Na het laden werden de cellen gewassen met PBS en gesuspendeerd in DMEM. Fluorescentiemetingen werden uitgevoerd onder gebruikmaking van een Olympus FluoView-500 confocale systeem. Fluo-3 is geëxciteerd door argon laserlicht bij 488 nm en fluorescentie werd gemeten bij een golflengte van 515 nm.

ELISA-assay van DAG

DAG concentraties werden gemeten door ELISA, overeenkomstig de instructies van de fabrikant . Deze test maakt de kwantitatieve sandwich enzym-immunoassay technieken. Antilichaam specifiek voor DAG is voorbekleed op een microplaat. Standaarden en monsters worden in de putjes gepipetteerd en elke aanwezige DAG wordt gebonden door het geïmmobiliseerde antilichaam. Na verwijderen van niet-gebonden stoffen wordt een biotine-geconjugeerd antilichaam specifiek voor DAG toegevoegd aan de putjes. Na wassen wordt avidine geconjugeerd mierikswortelperoxidase (HRP) toegevoegd aan de putjes. Na een wassen om ongebonden avidine-enzym reagens te verwijderen wordt een substraatoplossing aan de putjes toegevoegd en de kleurontwikkeling in verhouding tot de hoeveelheid DAG gebonden in de eerste stap. De kleurontwikkeling wordt gestopt en de intensiteit van de kleur wordt gemeten.

subcellulaire fractionering

subcellulaire fractionering in cytosol en membraan fracties werd uitgevoerd met behulp van membraan en cytosol Protein Extraction Kit, volgens de fabrikant instructie. Monolaagculturen werden driemaal met ijskoud PBS-oplossing gewassen en afgeschraapt in koude homogenisatiebuffer (HB) bevattende 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% glycerol, 10 g /ml leupeptine, en 1 mM PMSF. De cellen werden gelyseerd met sonicatie via 4-15 s intervallen en volledige lysis werd microscopisch gevolgd. Het homogenaat werd ultracentrifuge bij 86.000 g gedurende 45 min bij 4 ° C en het supernatans werd aangeduid als cytosolfractie. De pellet werd geresuspendeerd in HB bevattende 1% Triton X-100 en geïncubeerd op ijs gedurende 30 min. De monsters werden daarna gecentrifugeerd bij 14.000 g gedurende 20 min bij 4 ° C en de supernatant werd aangewezen als de membraanfractie. Alle monsters werden gekookt en geklaard door centrifugeren.

Cell Migratie Assay

Migratie activiteit van AGS cellen werden gedetecteerd door transwell systeem (BD BioCoatTM Controle 8,0 mm PET membraan 24-well celkweek inserts, BD Biosciences). Na behandeling met trypsine, werden 5 * 10 ^{4cells gezaaid in de bovenste kamer met kweekmedium zonder FBS. Cel migratie naar de onderzijde van membraan werd geïnduceerd door medium dat 10% FBS in de onderste kamer gedurende 12 uur bij 37 ° C in een weefselkweek incubator. Gemigreerde cellen op de onderzijde van het membraan werden gefixeerd in 40% paraformaldehyde oplossing 30 min gekleurd met Giemsa oplossing gedurende 10 minuten en vervolgens gespoeld in water. De gekleurde cellen werden microscopisch onderzoek onder een lichtmicroscoop. Gemigreerd cellen werden geteld in 5 willekeurig gekozen velden per insert, en de waarden werden gemiddeld. Alle experimenten werden uitgevoerd met drie herhalingen onder elke migratie conditie.}

Statistische analyse

De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyse werd uitgevoerd met een tweezijdige ANOVA met SPSS statistische software. Een P
-waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als significant.

Dankwoord

Wij danken Dr. Gerry Boss en Dr. Renate Pilz, University of California, San Diego, USA voor het soort geschenken van de adenovirale constructen.

• PLoS ONE: Socio-demografische en geografische factoren in Sterfte slokdarmkanker en maagkanker in Zweden
• PLoS ONE: Overexpressie van CD151 voorspelt Prognose in Patiënten met weggesneden maagkanker