Abstract
Bakgrunn
lysosome-forbundet trans protein 4β -35 (LAPTM4B-35), et medlem av pattedyr 4-tetratransmembrane dekkende protein-superfamilien, er blitt rapportert å være overuttrykt i mange kreftformer. Imidlertid ekspresjonen av LAPTM4B-35 og dens rolle i progresjonen av magekreft (GC) er fortsatt ukjent. Målet med denne studien var å undersøke LAPTM4B-35 uttrykk i GC, dens potensial relevans for clinicopathologic parametere og rollen LAPTM4B-35 i løpet av magekreftutvikling.
I denne studien, parafin -embedded prøver med GC (n = 240, inkludert 180 sammenkoblede eksemplarer) og 24 sammenkoblede Dypfryst vev ble analysert. QRT-PCR og immunhistokjemi (IHC) ble brukt til å analysere ekspresjonen av LAPTM4B-35 i GC. Virkningene av LAPTM4B-35 på GC celleproliferasjon, migrasjon og invasjon ble bestemt ved overekspresjon og knockdown-analyser.
IHC viste at LAPTM4B-35 ble uttrykt i 68,3% (123/180 ) av GC vev, mens i 16,1% (29/180) av sine sammenkoblede tilstøtende noncancerous mage vev ( P Disse funnene indikerer at LAPTM4B-35 overekspresjon kan være relatert til GC progresjon og dårlig prognose, og kan således tjene som en ny forutsigelse markør av prognosen hos pasienter GC relasjon:. Cheng X, Z Zheng, Bu Z, X Wu , Zhang L, Xing X, et al. (2015) LAPTM4B-35, er en kreft-relaterte Gene, assosiert med dårlig prognose i TNM Stages I-III Gastric kreftpasienter. PLoS ONE 10 (4): e0121559. doi: 10,1371 /journal.pone.0121559 Academic Redaktør: Ken-ichi Mukaisho, Shiga University of Medical Science, JAPAN mottatt: 10 april 2014; Godkjent: 12 februar 2015; Publisert: 07.04.2015 Copyright: © 2015 Cheng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr 30471677 og 81141024) og National Key Technology R & D Program (Beijing Science and Technology. prosjekt Z121100007512010). Finansiører bidratt til studien design, ytelse, reagenser, materialer, dataanalyse og beslutningen om å publisere Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer Innledning Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen i Kina og den ledende årsak til kreft dødsfall i Kina [1]. De fleste av GC-pasienter er allerede i avansert stadium ved tidspunktet for diagnose (stadium III og IV), hvilket gjør prognosen for å være sturen, til tross for forbedring av kirurgisk og adjuvant behandling tilnærming [2-5]. Uavhengig av kjemoterapi og ment kurativ kirurgi, nesten 60% av pasienter med GC utvikle tilbakefall og til slutt dø av metastatisk sykdom [6]. GC progresjon er en multifaktoriell og flertrinnsprosess hvor arvet og miljømessige faktorer spiller en viktig rolle [7]. Tidligere observasjoner tyder på at klassiske biomarkører og iscenesettelse systemer, basert på kliniske og patologiske funn, kan ha sine begrensninger på kliniske applikasjoner og drive å utvikle nye molekylære biomarkører som kan forutsi pasientens utfall og behandling [8, 9]. lysosome-assosiert protein trans 4 beta (LAPTM4B) er opprinnelig klonet i hepatocellulært karsinom (HCCs) av Shao et al, som ligger på kromosom 8q22, en region ofte forsterket i brystkreft og HCC [10, 11]. Det koder for to proteiner med forskjellig molekylvekt, 24-kDa og 35 kDa-proteiner (LAPTM4B-24 og -35) med fire antatte transmembranområdene [12]. Lokalisering av LAPTM4B-35 ble funnet ikke bare i lysosomet, men også i plasmamembranen og indre organeller som Golgi-apparatet og endosomer [13]. Det har blitt rapportert at LAPTM4B-35 ble allment uttrykt i ulike typer kreft. Tidligere rapporter tydet på at overekspresjon av LAPTM4B-35 er assosiert med negative biologiske atferd og dårlig prognose i mange kreftformer, som brystkreft [14], HCC [15-17], galleblæren kreft [18, 19], tykktarmskreft [20] , epitelial ovarialcancer [21] og livmorkreft [22]. Det er også blitt rapportert at allelisk variasjon av LAPTM4B var assosiert med genetisk disposisjon av GC [23]. Videre overekspresjon av LAPTM4B-35 ved transfeksjon av cDNA LAPTM4B fremmer celleformering, migrering, invasjon i HCC xenotransplantater i nakne mus og induserer multimedikamentresistens [24]. Knockdown av LAPTM4B av RNA interferens omvendt snudd alle disse ondartede fenotypiske egenskaper i HCC [24, 25]. Men LAPTM4B-35 uttrykk, dens relevans for clinicopathologic egenskaper, og biologiske rolle LAPTM4B-35 i GC fortsatt uklare. I denne studien ønsket vi å identifisere LAPMT4B-35 uttrykk i GC og dets potensial forhold til clinicopathological funksjoner, og dens prognostisk betydning. I tillegg in vitro funksjonelle analyser ble utført for å karakterisere de biologiske effektene av LAPTMEB-35 i mage tumorigenicity. Etikk Alle pasientene hadde signert informert samtykke for å skaffe vevsprøver, og studieprotokollen ble godkjent av klinisk forskningsetiske komité for Peking University Cancer Hospital. Menneskelige mage vevsprøver i alt 240 (167 menn og 73 kvinner, alderen 22-87 år, og median alder var 60 år) formalinfiksert parafin innebygd GC vev, inkludert 180 paret kreft og matchet tilstøtende noncancerous mageslimhinnen vev, ble samlet inn fra GC pasienter som gjennomgår gastrektomi ved Peking University Cancer Hospital fra januar 2003 til desember 2011. Den kliniske og histologiske informasjon for hvert tilfelle ble også samlet inn i henhold til godkjente institusjonelle retningslinjer. 1997 UICC-TNM kriterier ble brukt for klassifisering av magekreft. Median oppfølging varighet siden diagnosetidspunktet var 26,2 måneder (range, 2.4-119.0 måneder). I alt 112 (46,7%) pasienter døde i oppfølgingsperioden. Parafin seksjoner (4 mikrometer) ble avvokset og rehydrert i Xylem og etanol. Immunhistokjemi ble utført som tidligere beskrevet [16] ved anvendelse av anti-LAPTM4B-35-antistoff (1: 200) (Gitt av Pro RL Zhou.). Som negative kontroller, ble seksjonene behandlet som den samme protokoll med unntagelse av at de ble inkubert over natten ved 4 ° C i blokkeringsløsning uten det primære antistoff. Ekspresjon av LAPTM4B-35 ble vurdert av to erfarne patologer (Y Sun og B Dong), som jobbet selvstendig og ble blindet for pasientens kliniske resultater. Avvik mellom observatørene ble funnet i mindre enn 10% av de undersøkte lysbilder, og en enighet ble nådd etter ytterligere gjennomgang. Beising vurderingen ble bare brukt semikvantitative metoder for å klassifisere LAPTM4B-35 uttrykk som negative og positive farget immunreaktive celler. Forholdet mellom positivitet ble poengvurdert som '' 0 "(< 10% positive tumorceller)", "1" (10-50% positive tumorceller), og '' 2 "(mer enn 50% positive tumorceller). Den fargeintensitet ble scoret som '' 0 "(ingen flekker eller svakt farget)", "1" (moderat flekker), eller '' 2 "(sterk farging). Summen av fargingsintensitet, og den prosentvise resultatet ble brukt til å definere LAPMT4B ekspresjonsnivåene: 0-2, negative uttrykk og 3-4, positivt uttrykk (14). Den positive uttrykk kun vurderes av delene med minst 10% positive område av svulster. magekreft cellelinjer (SGC- 7901, BGC-823, MGC-803, MKN-28 og AGS) ble dyrket i DMEM (Wisent Inc., St. Bruno, QC, Canada) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO 2. pcDNA3 hCas9 og gRNA vektor ble fått fra (CZRC) Kina Sebrafisk Resource Center. Den fulle lengde Cas9 cDNA ble klonet inn i pXT7 vektor og linearized, og avkortet mRNA ble syntetisert ved hjelp mMESSAGE mMACHINE mRNA transkripsjon syntesesett (Life Technologies, Carlsbad, California, USA). De gRNA Primersekvensene som ble benyttet var: forover primer, 5'-TACGACTCACTATAGGGGGATGGTGCCGGTGCGGACAGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3 ', og revers primer: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3'.The protokoll ble etterfulgt av den tidligere publiserte papir [26]. hCas9 mRNA (3 ng /mL) og gRNA (0,2 ng /mL) ble transfektert inn i SGC-7901 celle utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California). RNA isolering, kvantitativ real-time revers transkripsjon PCR (QRT-PCR) Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og revers transkribert til cDNA ved hjelp av M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI 7500 Fast real-time PCR system (Life Technologies, Carlsbad, California, USA). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Primersekvensene brukt er listet nedenfor: LAPMT4B-35: forover primer: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ', reverse primer: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; β-aktin: forover primer: 5'CCTGTGGCATCCACGAAACT-3 'reverse primer: 5'GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3' Celleproliferering analysen Celleproliferering ble målt ved Cell Counting Kit-8. (CCK-8) (Dojindo, Japan) ifølge fremstillingen protokoll. Et volum på 100 ul av cellesuspensjonen (3000 celler per brønn) ble inkubert i en 96-brønns plate (Costar, Corning, NY) i 24, 48, 72, 96 timer. 10 ul av den CCK-8-løsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Absorbans verdier av alle brønner ble deretter bestemt ved 450 nm med en referansebølgelengde på 630 nm i Microplate Reader (Bio-Rad, USA). Forsøket ble utført i triplikat og gjentatt to ganger. Cellemigrering ble målt med sårhelende analyse av IncuCyte HD-system (IncuCyte ZOOM, Essen BioScience, USA). Celler ble sådd ut i 96-brønners plater med en tetthet på 6 x 10 4 celler per brønn. Sår ble gjort gjennom konfluente monolag celler med en tapp blokk og cellene ble vasket med 1 x PBS, dyrket i DMEM-medium med 10% føtalt bovint serum. Fotografier av celler ble fotografert med IncuCyte HD system ved 4 timers mellomrom fra 2 separate regioner per brønn med 10x objektiv. Verdier fra 2 regioner i hver brønn ble samlet og fordelt på tvers av alle 3 replikater Transwell invasjons assays Transwell (8 pm porestørrelse, Cell Biolabs, USA). Assay ble brukt for å analysere celle invasjon i henhold til produsentens instruksjoner. 8 × 10 4 celler ble plassert i forkamrene i serum-frie medier, og de nedre kamrene ble fylt med DMEM og 10% FBS. Etter inkubering i 72 timer ved 37 ° C, ble ikke-invasive celler på den øvre overflate av membranene fjernes med en bomullsdott. Membranene ble fiksert med metanol i 10 minutter og farget med 0,5% krystallfiolett i 10 min. Cellene på undersiden av filteret var fra fem tilfeldig valgte mikroskopiske syn ble tellet. protein ekspresjonsnivå av GC-cellelinjer ble målt ved Western blot-analyse. Celler ble lysert på forhånd avkjølt RIPA-lyseringsbuffer (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL) inneholdende protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Sveits) i 30 min etter sentrifugering ved 15,000g i 20 minutter, ble supernatanten erholdt. 50 ug av proteinekstrakter ble separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til 0,45 um polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Whatman, Tyskland). Membranen ble blokkert i 1 time ved romtemperatur med blokkeringsbuffer (pH 7,6) som inneholdt 5% fettfri tørrmelk, deretter inkubert med anti-LAPTM4B-35-antistoff (1: 800; Gitt av Prof. RL Zhou) ved 4 ° C over natten . Mus anti-human β-aktin-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ble anvendt som en intern kontroll. Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av en chemiluminescence deteksjonssystem (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Chi-kvadrat test ble brukt for å sammenligne forskjellen i LAPTM4B-35 protein uttrykk mellom GC vev og tilstøtende noncancerous vev. Ubetinget logistisk regresjonsanalyse modeller ble brukt til å analysere sammenhenger mellom LAPTM4B-35 uttrykk og clinicopathological parametere justert av kjønnsstatus. Forskjellen på LAPMT4B-35 total overlevelse (OS) kurve ble beregnet med Kaplan-Meier-metoden og analysert med log-rank test. Relativ risiko (RR) for død forbundet med LAPTM4B-35 uttrykk og andre Predictor variabler ble estimert fra den univariate Cox modell først. Multivariat Cox modeller ble også konstruert for å beregne RR for LAPMT4B-35 uttrykk. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare statistikkpakken (versjon 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En tosidig P Expression analyse av LAPTM4B-35 i GC cellelinjer og GCer Vi først undersøkt uttrykk for LAPTM4B-35 LAPTM4B-35 LAPTM4B-35 protein uttrykk ble hyppig observert i menneskelige GC Vi undersøkte uttrykk for LAPTM4B-35 i GC og tilstøtende noncancerous vev ved hjelp av immunhistokjemisk analyse. LAPTM4B-35 uttrykte ikke i normal gastrisk mucosa (figur 2A), men uttrykkes i intestinal metaplasi, dysplasi lesjon (Data ble ikke vist), og tumorceller, og i hovedsak lokalisert i cytoplasma eller på cellemembranen (Fig 2B og 2D 2H). LAPTM4B-35 hyppig observert i GC vev sammenlignet med matchet tilstøtende noncancerous slimhinnen (68,3% vs. 16,1%, P Vi analyserte forholdet mellom LAPTM4B-35 uttrykk og clinicopathological kjennetegn ved GC pasienter. Som kjønn, objektene i vår studie har sin avvik (167 vs 73, tabell 2), beregnet vi deres forhold ved logistisk regresjonsanalyse og justert for kjønn status. LAPTM4B-35 ble hyppigere observert dårlig differensierte GCer sammenlignet med moderate-godt differensierte seg (65,4% vs. 57,9%, P LAPTM4B-35 ekspresjon og prognose av GC pasienter figur 3 viser analysen av LAPTM4B-35 ekspresjon og kliniske resultater. Kaplan-Meier overlevelseskurver viste at det var en tendens til kortere totaloverlevelse (OS) i GC pasienter med LAPTM4B-35 positive uttrykk i forhold til de negative ( P resultatene av univariate og multivariate Cox modeller for OS av GC pasienter i TNM stadium i-III utstilt at dybden av invasjonen (RR = 3,103, 95% KI: 1,427 -6,748; P LAPTM4B-35 forfremmet tumor celleproliferasjon for å undersøke effekten av LAPMT4B-35 i funksjon av cellebiologi, ble to cellelinjer etablert. BGC-823 og SGC-7901 celler som presenterer relativt lavere eller høyere uttrykk av LAPTM4B-35 ble separat valgt for overekspresjon og knockdown-analysen (figur 1A). I den første, cellelinje BGC-823-AF overekspresjon LAPTM4B-35 stabilt ble etablert, og MOCK ble brukt som kontroll for denne cellelinje. For det andre LAPTM4B-35 ble stabilt slått ned towarding til SGC-7901 (hCas9 /gRNA) av type II gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) system, og resultatene ble identifisert ved Western blot (Fig 4A). celle proliferasjonsanalyse ble målt ved hjelp av CCK-8 celletelling kit. Absorbansverdien av BGC-823-AF celler i 72 timer etter spredning var betydelig høyere enn de overordnede cellene og mock celler, og resultatet var bare overfor ved å slå ned på LAPTM4B-35 i SGC-7901 celler (figur 4B). LAPTM4B-35 forbedret tumor celle migrasjon og invasjon evne Etter transfeksjon med pcDNA3.0-AF og hCas9 /gRNA, vi utførte sårhelende analyse for å analysere migrasjon evne LAPTM4B-35 over-uttrykk /knockdown mage kreftceller (fig 5A). Resultatene viste at LAPTM4B-35 forfremmet BGC-823 (BGC-823-AF) celle migrasjon sammenlignet med BGC-823 og mock ( P Følgelig er effekten av LAPTM4B-35 på invasivitet av tumorceller ble undersøkt ved hjelp av transwell analysen. (fig 6A). Vi fant ut at den invaderte celle nummer var signifikant høyere i LAPTM4B-35-transfekterte BGC-823 celler og lavere i knockdown SGC-7901 celler, enn i sine kontrollceller, henholdsvis ( P GC er en svært heterogen sykdom hvor selv lignende kliniske og patologiske funksjoner fører til forskjellige resultater [27, 28], noe som indikerer at TNM staging system for GC har sin begrensning og drive å søke etter nye molekylære biomarkører som kan forutsi pasientens utfall og behandling. Oncogenet LAPTM4B-35 er lokalisert på kromosom 8q22, og forsterkning av DNA-kopi-antall på kromosom 8q22 er en hyppig funn i GC ifølge vår tidligere studie (upubliserte data). I brystkreft, overekspresjon av LAPTM4B-35 og 8q22 forsterkning ble bidratt til de nove I denne studien undersøkte vi LAPTM4B-35 Videre har vi også analysert sammenhengen av LAPTM4B-35 uttrykk med clinicopathological parametre i magekreft. Høy LAPTM4B-35 uttrykk var signifikant korrelert med grad av differensiering, lymphovascular invasjon, dybden av invasjonen og lymfeknutemetastase, noe som tyder på at LAPTM4B-35 kan være omfattende aktivert i magekreft, og det kan spille en viktig rolle i mage karsinogenese og tumorprogresjon. Som svulsten lymphovascular invasjon og lymphonode metastasering er svært viktige kliniske prognostiske indikatorer for svulst tilbakefall, gjorde vi en overlevelsesanalyse. Kaplan-Meier-kurver stratifisert etter LAPTM4B-35 uttrykk og tumorstadium eller lymphovascular invasjon avslørte at LAPTM4B-35 positive pasienter har betydelig dårligere OS sammenlignet med LAPTM4B-35 negative i TNM stadium I-III eller uten lymphovascular invasjon gruppen. Multivariat Cox regresjonsanalyse i denne undergruppen viste at blant alle analysert faktorer, er LAPTM4B-35 uttrykk en uavhengig prognostisk faktor i magekreftpasienter i TNM stadium I-III, men i stadium IV. Det er rimelig fordi pasienten i fase IV er ute av stand til å motta radikal operasjon, og kan bli behandlet med mange andre forskjellige palliativ behandling, som alle ville påvirke prognosen. Disse resultatene indikerer at tilbøyeligheten for LAPTM4B-35 kan spesifikt spår de mest aggressive og dødelige typer magekreft i tilfeller med tidlig og uten distal metastaser eller uten lymphovascular invasjon. I denne studien fant vi at LAPTM4B -35 positivt uttrykk generelt korrelert med dårligere prognose i GC pasienter stratifisert etter tumorstadium eller lymphovascular invasjon. For funksjonen av LAPTM4B-35 i GC, vi videre utført in vitro assay. Overekspresjon av LAPTM4B-35 i BGS-823-celler viste en signifikant økning i celle-proliferasjon, migrering og invasjon, og nedregulering av LAPMT4B-35 bly til de motsatte resultater. Zhou et al. har vist at LAPTM4B-35 overekspresjon fremmer celleoverlevelse, deregulert spredning og migrasjon i HCC celler [12]. Nyere studier har rapportert at LAPTM4B-35 var assosiert signifikant med en dårligere klinisk resultat i mange humane ondartede sykdommer, slik som HCC [16], metastatisk ovarial tumor [32], galleblæren [19, 33], ekstrahepatiske kolangiokarsinom [34] og livmorkreft [22]. Disse akkumulerte bevis støtter våre nåværende funn, noe som indikerer at LAPTM4B-35 overekspresjon kan spille en viktig rolle i malign transformasjon og progresjon av GC. De molekylære mekanismene for LAPTM4B-35 i tumorprogresjon egenskaper er fortsatt uklart. Noen tidligere studier indikerte at LAPTM4B-35 er nødvendig for lysosomet homeostase, surgjøring og funksjon, og at LAPTM4B-35 gjengir tumorceller som er resistente mot lysosom-mediert celledød forårsaket av miljømessige og genotoksiske påkjenninger [30, 31]. Overekspresjon av LAPTM4B-35 kan aktivere noen proto-onkogener, for eksempel c-myc, c-jun og c-fos [35], og fremme spredning, migrasjon og invasjon i noen humane kreft linjer som ville øke veksten og metastasering av HCC transplantater i nakne mus [36]. Relatert undersøkelse antydet at LAPTM4B kan forbedre celleproliferasjon eller overlevelse gjennom involvering i signaltransduksjonsbane, slik som den fosfatidylinositol 3-kinase-proteinkinase B pathway. Og LAPTM4B-35 kan interagere med noen kreft-relaterte proteiner, som proteinfosfatase 2A og proteinkinase C [10]. Li et al fant at LAPTM4B-35 motiverer multimedikamentresistens av cancerceller ved å fremme legemiddelutstrømningen og anti-apoptose ved å aktivere PI3K /AKT signalering [24], noe som indikerer at LAPTM4B-35 kan være et nytt mål for terapi. Den funksjonelle rollen og mekanisme LAPTM4B i GC trenger videre etterforskning. I konklusjonen, denne studien indikerer at LPTM4B-35 overekspresjon spiller viktige roller i å fremme celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i mage kreft. LAPTM4B-35 positivt uttrykk i mage kreft vev korrelert med dårlig resultat og viste seg å være en uavhengig prognostisk faktor i undergruppe av GC pasient i TNM etapper I-III eller uten lymphovascular invasjon. Således kan LAPTM4B-35 utgjør et nyttig biomarkør for å forutsi prognose i visse undergruppen av GC. I tillegg, som rollene LAPTM4B-35 i begrensende lysosome-mediert celledød og fremme autofagi har betydelige overlevelse effekter i kreftceller, og LAPTM4B-35 ble over-uttrykt i en stor andel av magekreft, kan det være et nyttig mål for behandling av subtype gruppen av magekreft. Hjelpemiddel Informasjon Acknowledgments We takke Guoshuang Feng (fra kinesisk Center for Disease Control and Prevention) for hans slag hjelp i data statistikk.
= 0,000). LAPTM4B-35
mRNA nivåer i GC vev ble også betydelig forhøyet sammenlignet med sine sammenkoblede tilstøtende noncancerous vev ( P
= 0,017). Overekspresjon av LAPTM4B-35 var signifikant assosiert med grad av differensiering, dybden av invasjonen, lymphovascular invasjon og lymfeknutemetastase ( P
< 0,05). Kaplan-Meier-overlevelseskurver viste at pasienter med LAPTM4B-35 ekspresjon hadde en betydelig reduksjon i total overlevelse (OS) i trinn I-III GC pasienter ( P
= 0,006). Multivariat analyse viste høy uttrykk for LAPTM4B-35 var en uavhengig prognostisk faktor for OS i fase I-III GC pasienter ( P
= 0,025).
Konklusjon
Materialer og Metoder
Immunohistochemistry
Cell kultur, LAPTM4B-35 uttrykk plasmid og hCas9 /gRNA transfeksjon
. 0-AF
inneholder hele ORF av LAPTM4B produsere LAPTM4B-35 protein ble begavet av professor RL Zhou [11]. Transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. Positive cellekloner ble oppnådd ved antibiotika utvalg med G418 (Gibco, Grand Island, NY) i en konsentrasjon på 800 ng /ml.
sårhelende assay
Western blot-analyse
Statistisk analyse
mRNA-ekspresjon mellom GC og tilstøtende noncancerous vev ble analysert ved hjelp av Wilcoxon samsvarende par-testen.
verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikans.
Resultater
av RT-PCR i 5 GC cellelinjer (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901 og AGS), og deretter oppdaget sin protein uttrykk ved Western blot. Resultatene viste at LAPTM4B-35 ble uttrykt i alle cellelinjene i både mRNA og proteinnivåer (Fig 1A, øvre og nedre panel), så vi valgte BGC-823 og SGC-7901 celler for våre følgende cellefunksjonstester.
uttrykk ble også påvist i 24 par resected GC eksemplarer av QRT-PCR. Som vi kan se i figur 1B, LAPTM4B-35
uttrykk i GC vev ble signifikant forhøyet sammenlignet med sammenkoblede tilstøtende noncancerous vev ( P
= 0,017) (figur 1B).
= 0,000) (tabell 1).
Forholdet mellom LAPTM4B-35 uttrykk og clinicopathological egenskaper
= 0,017). Videre LAPTM4B-35 uttrykk ble assosiert med lymphovascular invasjon ( P
= 0.000), dybde av invasjon ( P
= 0,016) og lymfeknutemetastase ( P
= 0,029) (tabell 2).
= 0,064, log-rank = 3,425) (fig 3A). Etter pasienter ble fordelt etter TNM I-III eller pasienter uten lypmphovascular invasjon, pasienter med LAPTM4B-35 positive uttrykk viste signifikant kortere OS enn de negative ( P
= 0,006 og P
= 0,001 ., henholdsvis) (figur 3B og 3D)
= 0,004), lymfeknutemetastase (RR = 3,015, 95% KI: 1,552 til 5,858; P
= 0,001) og LAPTM4B-35 uttrykk nivå (RR = 2,249 , 95% KI: 1,242 til 4,072; P
= 0,007) påvirkes betydelig overlevelse av GC, (Tabell 3); Videre LAPTM4B-35 positive uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor (RR = 1,897, 95% KI: 1,041 til 3,457; P
= 0,025). Lymfeknutemetastase (RR = 2,665, 95% KI: 1,362 til 5,213; P
= 0,001) også uavhengig spådde OS (tabell 3)
< 0,05), og nedregulering av LAPTM4B-35 uttrykk kunne reversere denne fenomen i SGC-7901-celler ( P
< 0,05, figur 5B)
< 0,05, fig 6B). Disse resultater antyder at LAPTM4B-35 fremmer migrering og invasjon av magekreftceller.
diskusjon
chemoresistance til antracykliner og er ettergivende for metastatisk tilbakefall [29].
uttrykk i 24 magekreft og deres sammenkoblede noncancerous mage kirurgiske prøver av QRT-PCR og fant at LAPTM4B-35
mRNA uttrykk nivået i magekreft ble signifikant forhøyet sammenlignet med det i den sammenkoblede noncancerous vev gruppe. Videre immunhistokjemisk analyse i 180 par av magekreft viste LAPTM4B-35 ble overexpressed i GC vev (68,3%) sammenlignet med deres paret noncancerous slimhinnen (16,1%). LAPTM4B-35 fremmer tumorvekst og toleranse for metabolske og genetisk stress gjennom induksjon av autophagy [30, 31]. I vår nåværende studie ble funksjon LAPTM4B i magekreft undersøkes av in vitro analyser. Overekspresjon av LAPTM4B-35 i BGC-823 celler også økt celleviabilitet i serumfritt dyrkningsforhold også. Hvis dette fenomenet skyldes selvdestruerende er nødvendig for å bli undersøkt.
S1 datasett. Individuelle resultater fra relativ mRNA av LAPTM4B-35 uttrykk, celleproliferasjon, migrasjon og invasjon, overlevelse av pathients og clinicopathological features.
(Excel)
doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001
(XLS)
Tarmbakterier kan forutsi risiko for pulmonal hypertensjon
Spiserørskreftrisiko kan reduseres med esomeprazol og lavdose aspirin
Bytte ut rødt kjøtt for plantebaserte kjøttalternativer senker kardiovaskulær risiko
Kvinner født med keisersnitt har større risiko for fedme og diabetes
Kronisk hoste kan lindres med nytt stoff
Tarmmikrober i veps hjelper til med å overvinne plantevernmidler
Gassdetekterende elektronisk pille for diagnose av gastrointestinale plager
Forskere fra RMIT University, Melbourne, har laget en elektronisk pille som kan oppdage spesielle gasser i tarmen og hjelpe leger med å diagnostisere gastrointestinale plager som irritabel tarm.
Mikroplast identifisert i menneskelig avfall for første gang
En analyse av avføringsprøver fra mennesker tatt fra deltakere i åtte land har funnet at hver eneste prøve som ble testet inneholdt mikroplast og at opptil ni forskjellige plastmaterialer var tilstede
Spiserørskreftrisiko kan reduseres med esomeprazol og lavdose aspirin
I følge resultatene av en fase III -studie presentert på ASCOs årsmøte 2018, to enkle reseptfrie legemidler-høydose esomeprazol og lavdose aspirin når de tas regelmessig, kan moderat redusere risikoen