PLoS Genetics: miR-218 inibe a invasão e metástase de câncer gástrico, visando os Robo1 Receptor

Sumário

MicroRNAs desempenham papéis importantes na metástase do tumor. Aqui, descrevemos a regulação e função de miR-218 em câncer gástrico (GC) metástase. expressão de miR-218 é diminuída, juntamente com a expressão de um dos seus genes hospedeiros, Slit3 em GC metastático. No entanto, Robo1, um dos vários receptores de fenda, é regulado negativamente por miR-218, estabelecendo assim um ciclo de feedback negativo. Diminuição de miR-218 níveis eliminar Robo1 repressão, o que activa a via de fenda Robo1 através da interacção entre a Robo1 e Slit2, desencadeando, assim, a metástase tumoral. A restauração do miR-218 suprime a expressão Robo1 e inibe a invasão de células de tumores e metástases in vitro
e in vivo
. Tomados em conjunto, os nossos resultados descrevem um circuito regulador Slit-miR-218-Robo1 cuja interrupção pode contribuir para a metástase GC. Segmentação de miR-218 pode fornecer uma estratégia para bloquear metástases tumorais.

Autor Resumo

MicroRNAs foram identificados como desempenhando papéis importantes na metástase tumoral, mas o seu impacto sobre a metástase de GC tem sido mal explorada. Nós descobrimos miR-218, que funciona como um supressor de metástase tumoral e está correlacionada com a fase clínica, metástase de nódulo linfático, e o prognóstico em pacientes com GC. Os nossos resultados mostram que o miR-218 é parte de um circuito de regulação que envolva a via de fenda Robo1. Em células tumorais metastáticas, de miR-218 foi suprimida juntamente com Slit3, um dos seus genes do hospedeiro. Enquanto isso, Robo1, um dos vários receptores de fenda, é regulada positivamente em resposta à diminuição do miR-218, que por sua vez induz uma regulação positiva reactivo da via de fenda Robo1 através de uma interacção com a Slit2, facilitando, assim, a migração de células tumorais e invasão. Tais achados não só fornecer novos insights sobre os mecanismos metastáticos no GC, mas também fornecer evidência para um romance modo de regulação mediada por miRNA de sinalização do receptor

Citation:. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, S Sun, et ai. (2010) miR-218 inibe a invasão e metástase de câncer gástrico, visando os Robo1 Receptor. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10.1371 /journal.pgen.1000879

editor: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de julho de 2009; Aceito: 10 de fevereiro de 2010; Publicação: 12 de março de 2010

Direitos de autor: © 2010 Tie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.670.970, No. 30.873.026, No. 30.672.369, No. 30.530.780) e do Programa de Pesquisa básica Nacional da China (No.2010CB529300). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os avanços em abordagens diagnósticas e terapêuticas levaram a excelentes expectativas para a sobrevivência a longo prazo para o câncer gástrico precoce (GC). No entanto, o prognóstico para GC avançado com extensa invasão e metástase continua pobre [1]. A fim de metástase, as células tumorais devem passar através de uma série de eventos sequenciais e selectivos, incluindo descolamento, migração, invasão local, angiogénese, intravasamento, sobrevivência no sistema circulatório, extravasamento e recrescimento em diferentes órgãos. Na cascata metastática, invasão de GC para o tecido circundante é um passo inicial importante [2] - [4]. No entanto, os mecanismos de invasão ainda não foram completamente elucidados.

Um grande número de ácidos microribonucleic (microRNAs ou miRNAs) foram recentemente implicada na metástase do cancro [5], incluindo miR-10b, miR-21, miR-126, miR-335, miR-373, miR-146, miR-520c, e miR-205 no cancro da mama [6] - [11]; miR-224 e miR-21 no cancro da próstata [12], [13]; miR-29c em carcinoma de nasofaringe [14]; miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7 e miR-452 em carcinomas uroteliais [15]; miR-182 em pacientes com melanoma [16]; miR-92b e miR-9/9 * em tumores cerebrais [17]; e miR-21 no câncer colorretal [18]. No entanto, muito poucas miARNs conhecidos por estarem envolvidos em metástase GC têm sido relatados. miRNAs são naturais, moléculas de RNA curtas e não-codificantes que regulam negativamente a expressão do gene [19]. Nos mamíferos, miARNs maduros são gerados a partir de pri-miARNs e pré-miARNs via processamento sequencial pelo Drosha e Dicer e encontram-se em muitos organismos. Eles consistem de 21-24 nucleótidos, integrar-se em complexos de silenciamento de indução de ARN, e emparelhar com regiões não traduzidas a 3 '(3'-UTR) de RNAs específicos alvo mensageiro (ARNm) para suprimir a tradução ou induzir a degradação dos mRNAs alvo [20 ]. A evidência emergente revelou que miARNs desempenham papéis importantes em processos biológicos diversos, tais como a diferenciação celular, proliferação, apoptose, resistência à tensão, o metabolismo da gordura, tumorigénese, e metástase [21] - [23]. Uma melhor compreensão das mudanças na expressão de miRNA durante a invasão GC pode levar a uma melhor compreensão do desenvolvimento GC, bem como eventuais melhorias no diagnóstico e tratamento de GC avançado.

No presente estudo, nós estabelecemos alta sublinhas baixos invasivos celulares (MKN28-NM e SGC7901-NM) usando um ensaio transpoço repetitivo (MKN28-M e SGC7901-M) e in vitro
. Em seguida, examinou o perfil global expressão miARN em cada sub-linha celular utilizando um microarray para identificar miARN miARNs expressos diferencialmente relacionados com a invasão do GC humano. No total, 45 miRNAs se mostraram diferencialmente expressos em invasivo vs. células GC não-invasivos. Entre estes, miR-218, um miRNA significativamente regulada negativamente em células altamente invasivos, mostrou-se estreitamente correlacionados com tumorigênese GC e metástase em pacientes. Mais recentemente, uma diminuição na miR-218 foi avaliado em vários tipos de tumores sólidos, incluindo o cancro da próstata, GC, cancro do pulmão e carcinoma do colo do útero [24] - [27], mas esta diminuição da miARN-218 foi simplesmente rastreadas para fora como sendo uma das dezenas de potenciais miARNs de interesse nos cancros descritos acima. Sem mais estudos têm sido realizados para avaliar a importância de miR-218 na metástase do tumor. Aqui, encontrámos que a diminuição da expressão de miR-218 foi correlacionada com a fase avançada clínica, linfa metástase, e mau prognóstico em pacientes, e re-expressão de miR-218 em células metastáticas foi capaz de inibir a migração, invasão, e formação de metástases tanto in vitro
e in vivo
. Usando uma pesquisa de bioinformática para miR-218 alvos, que identificou o receptor Robo1 como alvo funcional de miR-218, e confirmou-se que a interação entre o miR-218 e Robo1 foi crucial para a motilidade celular GC, demonstrando que houve uma correlação inversa entre miR -218 e Robo1 em linhas celulares de GC, bem como em pacientes GC. Além disso, nós descobrimos um circuito fechado de realimentação negativo envolvendo intrigante de fenda, o miR-218, e Robo1, em que o miR-218 pode ser derivado de qualquer um de dois genes localizados nos intrões de dois membros distintos da família de proteínas de fenda. Além disso, os membros desta família são ligandos do receptor de Robo1. Foi demonstrado que a expressão dos dois genes de precursores de miARN (MIR-218-1 e miR-218-2) correlacionada com a expressão dos genes do hospedeiro (Slit2 e Slit3, respectivamente) e que o miR-218 maduro foi obtido principalmente a partir do miR -218-2 precursor, com uma redução concomitante de acolhimento Slit3 mas não da Slit2 em células metastáticas de GC. Assim, a regulação positiva de Robo1 em resposta à diminuição do miR-218 induziu uma regulação positiva reactivo da via de fenda Robo1 através da sua interacção com a Slit2, facilitando assim a invasão de células tumorais e metástases. Nossas descobertas não só fornecer novos insights sobre os mecanismos metastáticos no GC, mas também revelou um novo mecanismo regulador da sinalização do receptor.

Resultados

Estabelecimento e caracterização de sublinhas celulares com diferentes invasivo e metastático potenciais

Para estabelecer os modelos de metástase de GC, foi criado sublinhas de células invasivas e não invasivas partir das linhas celulares humanas SGC7901 GC e MKN28 usando a abordagem Transwell repetida (Figura 1A, ver Materiais e Métodos). Resumidamente, num ensaio de invasão repetitivo foi realizada, e as células que não conseguiram invadem as membranas e as células que tinham a capacidade de migrar através da membrana revestida de colagénio em todas as rondas de selecção foram separadas. Depois de dez ciclos de selecção, foram obtidos sublinhas celulares invasivos (MKN28-M e SGC7901-M) e não-invasivos (MKN28-nm e SGC7901 nm). As propriedades metastáticas de cada sub-linha celular foram então caracterizado in vitro
e in vivo
. Como mostrado na Figura 1B e 1C, capacidade de migração de células MKN28-M foi de aproximadamente 4 vezes maior do que a de células MKN28-NM. Do mesmo modo, o potencial invasivo era cerca de 5 vezes maior para células MKN28-M em comparação com células MKN28-NM. Nos in vivo
estudos, metástase de células tumorais foi observado em ratos nus. Tal como mostrado na Figura 1D e 1E, quase nenhumas células GC metastáticos foram detectados nos pulmões ou no fígado de ratinhos nus em 10 semanas após a injecção das células MKN28-nM, enquanto que a maioria dos ratinhos injectados com células MKN28-M exibida pulmão óbvio ou fígado metástases. Foram observados resultados semelhantes para as células SGC7901-NM SGC7901-M e (dados não mostrados). Não foram observadas diferenças significativas na proliferação celular ou distribuição do ciclo celular entre estes sublinhas celulares (Texto S1, figuras S1 e S2).

Identificação de miRNAs relacionadas com a metástase por baseada em array hibridação

para identificar miARNs potencialmente envolvidas na invasão de GC, examinámos a expressão de miARN global em cada sub-linha de célula usando a matriz de microARN (v.10.0, Exiqon, Vedbaek, Dinamarca), que consiste de 847 sondas de captura para miARNs humanos maduros. Os resultados de microarray revelou que a expressão de 124 miARNs diferiu significativamente entre a variante altamente invasivo MKN28-M e o não-invasiva sub-linha celular MKN28-NM. Destes, 83 foram regulados positivamente e 41 foram regulados negativamente. Comparado com SGC7901-NM, 62 miRNAs foram diferencialmente expressos na sub-linha celular SGC7901-M, incluindo 47 reprimidos e 15 miRNAs regulada. No total, 11 miARNs foram encontrados para ser supra-regulada e 34 miARNs foram regulados negativamente em células MKN28-M e M-SGC7901 comparados com os dos correspondentes as sublinhas não-invasivos (Tabela S1).

dos 45 diferencialmente miRNAs regulados, miR-218 era um daqueles que exibia diferencial significativamente a expressão. miR-218 tem sido relatada a ser regulada negativamente no cancro do colo do útero [25], GC [26], o cancro do pulmão [27] e o cancro da próstata [28], indicando um possível envolvimento em ambos transformação oncogénica e tumoral metástase. No entanto, miARN-218 foi de apenas uma das muitas miARNs potenciais de interesse em cancros. Neste trabalho, miR-218 foi investigado com muito mais detalhes. Para validar os resultados de microarray, foi avaliada a expressão de miR-218 nas sublinhas celulares GC anteriormente mencionadas e na linha celular epitelial gástrica imortal GES utilizando qRT-PCR [29]. expressão de miR-218 foi significativamente diminuída em células MKN28-M e M-SGC7901 e era inferior em todos os quatro sublinhas celulares GC em comparação com as células imortalizadas humanas epiteliais gástricas GES (Figura 2A). Além disso, comparou-se o miR-218 de expressão no tumor primário GC vs. os linfonodos metastáticos em 10 doentes com estádio III /IV GC utilizando qRT-PCR. Tal como mostrado na Figura 2B, amadurecer o miR-218 níveis eram significativamente diminuída em 7 de 10 linfonodos metastáticos, indicando que o miR-218 pode desempenhar um papel causal na metástase GC.

A diminuição da expressão de miR-218 em CG foi associado com estágio avançado clínica, linfonodo metástases e pobre prognóstico do paciente

Para determinar as possíveis implicações clínico-patológicas de expressão alterada miR-218, foram investigados os níveis de miR-218 expressão em 40 tecidos GC (T) e mucosa não-tumoral (N) por qRT-PCR. O termo -ΔCt foi usado para descrever o nível do miR-218 de expressão. Consistente com os dados anteriores, os resultados verificou-se que o nível de expressão de miR-218 em GC (-13,81 ± 0,15, média ± SE) tecidos foi significativamente mais baixa do que na mucosa não-neoplásica (-11,62 ± 0,15, média ± SE) ( P Art < 0,0001, t = 10,62, emparelhado t
-teste) (Figura 3A). Correlações entre o nível de expressão de miR-218 e características clínico-patológicas de GC estão resumidos na Tabela 1. As associações estatisticamente significativas entre o nível de expressão de miR-218 e estágio clínico e entre o nível de expressão de miR-218 e GC metástase foram observados neste estudo. A expressão mediana de miR-218 foi -14,25 ± 0,17 nos 22 casos com estágio avançado (estágio III e IV) da doença, enquanto que a expressão média foi de -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney teste) nos 18 casos com início de carreira (estágios da doença I e II). Nos 29 casos de GC com metástase ganglionar, a expressão mediana de miR-218 foi -14,09 ± 0,16, que foi significativamente menor do que a expressão mediana (-13,07 ± 0,24) nos 11 casos GC não-metastáticos ( P
= 0,0036). A expressão de miR-218 em pacientes de GC não se correlacionou com a idade, sexo, tamanho do tumor, ou a diferenciação celular. Além disso, examinamos se o nível de expressão de miR-218 foi associado com a sobrevivência em pacientes com GC. Os doentes foram subsequentemente divididas em baixa expressão (n = 20) e grupos de expressão elevada (n = 20) com base em níveis de miR-218 maior ou menor do que a média (-13,81) (Figura 3B). As análises de sobrevida de Kaplan-Meier revelou que os pacientes cujos tumores primários exibido baixa expressão de miR-218 teve um menor tempo médio de sobrevivência. A taxa de sobrevivência de três anos de pacientes com baixa expressão de miR-218 foi de 30%, que foi significativamente inferior à taxa de sobrevida em pacientes com alta expressão de miR-218 (65%; P
= 0,0012, log- rank;. Figura 3C)

a expressão ectópica de miR-218 a invasão da célula tumoral inibido e metástase in vitro
e in vivo

Para estudar o papel de miR-218 em metástase GC, células MKN28-M foram transfectadas com pGenesil-1-miR-218 um vector de controlo que expressam um miARN inespecífica, CEL-miR-67, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA ou ). As células foram depois seleccionadas com 400 mg /l de G418 para gerar células estáveis ​​MKN28-M-218 e miR-MKN28-H-miR-controlo. Descobrimos que a expressão ectópica de miR-218 resultou numa redução de aproximadamente três vezes na migração e invasão. Para determinar se a perda de miR-218 iria promover a migração ou a invasão de células do cancro, nós silenciados miR-218 com um oligonucleótido anti-sentido inibidor na linha de células MKN28-NM, resultando num aumento de três a quatro vezes na migração de células e invasividade (Figura 4A e 4B). Para testar se a inibição da invasão de tumor por miR-218 é causada pela alteração da capacidade invasiva de células tumorais, foram excluídos do efeito de miR-218 sobre a distribuição do ciclo celular e a proliferação de células de cancro gástrico. A sobre-expressão de miR-218 não afecta a proliferação e a distribuição do ciclo celular de células MKN28-M In vitro
(Figura S5A e S5D). Para investigar ainda mais a inibição de in vivo
metástase tumoral por miR-218, que implantado células MKN28-H-miR-218 que expressam de forma estável foram miR-218 ou as células de controlo em ratinhos nus através da veia lateral da cauda. Pulmonar e metástases do fígado de GC era aparente em ratinhos injectados com células H-miR-MKN28 de controlo. Em contraste, alguns tumores metastáticos foram detectados em ratinhos injectados com MKN28-H-miR-218 células (Figura 4C). Além disso, observou-se, simultaneamente, o crescimento dos tumores primários e a incidência de metástases distantes na ratinhos nus injectados subcutaneamente com células MKN28-H-miR-218 ou células de controlo. Os resultados mostraram pulmão ou fígado metástase era aparente em 3 dos 10 ratinhos injectados com células H-miR-MKN28 de controlo; em contraste, nenhuma metástase foram encontrados em ratos injectados com MKN28-M-miR-218 células (Figura s5e). Estes resultados são consistentes com os dados obtidos a partir de ensaios que avaliam a veia da cauda a metástase do câncer e indicam que o miR-218 tem a capacidade de suprimir a metástase sem afectar a proliferação celular.

Robo1 era um alvo funcional directa do miR-218 em CG metástase

para avaliar como um baixo nível de miR-218 expressão contribui para a invasão e metástase de GC, que procurou os potenciais alvos de regulação de miR-218, utilizando ferramentas de previsão, incluindo Miranda, PicTar e TargetScan. Embora centenas de diferentes alvos foram previstos, aqueles genes envolvidos na migração ou invasão podem ser os alvos relevantes no que diz respeito às funções biológicas de miR-218. Nós, então, realizada uma classificação funcional das metas previstas usando o programa DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Destes genes, Robo1 é considerada como uma actividade de proto-oncogene e portos de promoção da migração [30] - [35]. Mertsch et ai. Demonstraram que
Robo1 facilita a migração de células de glioma mediada por Slit2 [36]. Schmid et al., Achou que a migração de células tumorais de mama é induzida pela interação Slit2-Robo1 in vitro
[37]. Estes achados sugerem que Robo1 pode ser um alvo para miR-218. Para testar ainda mais a nossa hipótese, foi analisada a expressão de miR-218 e Robo1 em GES e em não-invasiva (MKN28-NM e SGC7901-NM) e invasiva (MKN28-M e SGC7901-H) células GC. Os resultados mostraram uma correlação negativa entre os níveis de miR-218 e mRNA Robo1 nessas células (Figura S3A). Além disso, observou-se que os níveis de mRNA Robo1 (Figura S3B) e de proteína (Figura 5B2) diminuíram quando o miR-218 foi expressa por pGenesil-1-miR-218 em células MKN28-M (Figura 5B1). O inverso foi observado para a expressão Robo1 quando miR-218 foi derrubado em células MKN28-NM (Figura 5C1 e Figura 5C2). A relação inversa entre o miR-218 e expressão Robo1 foi ainda confirmada por imuno-histoquímica (Texto S1) em 40 casos de cancro gástrico, em tecidos normais adjacentes correspondentes que foram também utilizadas em estudos clínico-patológicos, e metástases em 29 correspondentes. Os resultados mostram que Robo1 foi regulada positivamente em GC, especialmente em GC metastático (Figura S4), em que o miR-218 tem uma expressão relativamente baixa.

Para se obter mais provas de que a Robo1 directa é um alvo de miR-218 , investigaram o local de ligação de miR-218 na 3'UTR do ARNm Robo1 (Figura 5A). Construiu-se um repórter de luciferase (Luc-Robo1) em que os nucleótidos da Robo1 3'-UTR complementar para miR-218 (nt 971-978) foram inseridos no PMIR-RELATÓRIO miARN repórter vector de expressão de [38]. Correspondentemente, também gerado tanto um repórter mutante (Luc-Robo1-MU), na qual foram eliminados os primeiros seis nucleótidos nos locais complementares do miR-218 de sementes de região, e um repórter controlo, que continha um fragmento de não-relacionado de ADNc (Luc-Ctrl). miR-218-plasmídeos de expressão foram co-transfectadas com Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, ou Luc-Ctrl em células MKN28-M. Os ensaios mostraram que a actividade da luciferase nas células-Luc Robo1-transfectadas foi significativamente diminuída em comparação com a actividade da luciferase em células de controlo e mutantes negativos ( P
< 0,05), sugerindo que o miR-218 reduziu o a actividade da luciferase de Luc-Robo1 mas não teve efeito sobre Luc-Robo1-mu (Figura 5D). Portanto, concluiu-se que o fragmento inserido de Robo1 (NT 971 -
978). Foi o alvo de miR-218

Robo1 tem sido mostrado a ser sobre-expressos em células de cancro e é conhecido para promover a angiogénese de tumores e metástases através de uma interacção com fenda [39], [40]. Para testar se é funcionalmente Robo1 regulada por miR-218, foi gerada uma construção de expressão Robo1 contendo apenas um fragmento do sítio de ligação de miR-218 previsto e Robo1 vector de expressão mutante inteiramente sem a 3'-UTR. Nós também fez o Robo1 siRNA. células MKN28-H-miR-218, que expressa de forma estável o miR-218 ectopicamente, foram transientemente transfectadas com o Robo1 construir ou a construção mutante (sem local de ligação de miR-218), e as células MKN28-M foram transfectadas com Robo1 siRNA ou um siRNA controle negativo. MKN28-H-miR-218 células transfectadas com a construção mutante Robo1 mostrou um aumento de 3,8 vezes na capacidade de invasão em comparação com células transfectadas com o constructo Robo1. Estes resultados indicam que a introdução de ADNc Robo1 mutante que faltava o sítio de ligação de miR-218 para as células de miR-218 que sobre-expressam reverteu o efeito de supressão de miR-218-mediada de invasão celular. No entanto, o efeito de Robo1 foi reprimido por miR-218 na presença do Robo1 3'-UTR que contém os locais de ligação de miR-218. Knockdown de Robo1 por siRNA em células MKN28-M inibiu a invasão celular, que caiu para níveis semelhantes aos observados após a transfecção com o vector miR-218 expressando (Figura 5E e 5F). Estas observações sugerem que o miR-218 suprime directamente a invasão de células mediada por Robo1.

Slit2, mas não Slit3, pode interagir com Robo1, enriquecida pela ausência de miR-218, para promover a invasão GC

Dois tipos de miRNAs existir: intergênico e intrônica. Os primeiros são localizados em regiões de não codificação entre os genes e os seus correspondentes pri-miARNs são geralmente transcritos a partir de seus próprios promotores de ARN polimerase II. Estes últimos estão localizados dentro dos intrões de genes do hospedeiro, e a sua biogénese é controlada pelos promotores de genes de hospedeiro [41], [42]. miR-218 é um miARN intrónica. Dois genes código para madura de miR-218, miR-218-1 e miR-218-2, que estão localizados dentro do intrão 15 da Slit2 e intrão 14 da Slit3, respectivamente (Figura 6A). A localização intrônica dos dois miR-218 genes nos levou a perguntar se miR-218-1 e miR-218-2 são transcritas juntamente com os seus mRNAs de genes do hospedeiro. Para testar esta hipótese, utilizou-se qRT-PCR para examinar a expressão do precursor de miR-218-1, o precursor de miR-218-2, amadurecer o miR-218, ARNm Slit2, e ARNm Slit3 nos tecidos de GC dos sobrevivência análise. A análise estatística do coeficiente de correlação dos resultados de qRT-PCR revelou uma correlação positiva significativa entre os níveis de ARNm Slit2 e miR-218-1 e entre os níveis de ARNm Slit3 e miR-218-2 (Figura 6B e 6C). Estes resultados indicam que o miR-218 de codificação de genes, o miR-218-1 e miR-218-2, são transcritos em conjunto com os genes do hospedeiro, e Slit2 Slit3, respectivamente. A correlação positiva entre os níveis de miR-218 e miR-218-2 (Figura 6D) foi visto em GC; no entanto, nenhuma correlação foi observada entre os níveis de miR-218 e miR-218-1 (Figura 6E). Estes resultados indicam que a regulação negativa de miR-218 em GC é promovido por uma diminuição na miR-218-2, mas não na de miR-218-1. Consistente com esta conclusão, expressão Slit3 foi significativamente reduzida em GC (-22,43 ± 0,21, média ± SE) comparado com tecido gástrico normal (-20,79 ± 0,23, média ± SE), ( P Art < 0,0001, t = 7,67, emparelhado t
-teste) (Figura 6F), enquanto que a expressão Slit2 não foi significativamente diferente ( P
= 0,0772, emparelhado t
-teste) ( A Figura 6G). Em resumo, os nossos resultados experimentais sugerem que a regulação positiva significativa do gene Robo1 em resposta à remoção do miR-218 pode induzir uma supra-regulação posterior da via de fenda Robo1 através da sua interacção com a Slit2, facilitando a migração celular e invasão tumoral.

Discussão

para estudar uma doença, é vital para a construção de um modelo ideal. No presente estudo, foram isoladas subpopulações de células invasivas e não invasivas de linhas de células humanas estabelecidas GC usando a abordagem repetido Transwell, que tem sido aplicado com sucesso em muitos estudos investigando a metástase do tumor [43] - [48]. Os resultados do exame metastático in vitro
e in vivo
mostrou que as sublinhas celulares estabelecidas tinham capacidades invasivos e metastáticos distintos. Aqui, nós analisamos não só sublinhas celulares derivadas de linhas celulares GC com alto potencial invasivo, mas também aqueles com baixo potencial invasivo. Com a exceção de suas habilidades metastáticos, as sublinhas celulares seleccionadas foram bastante semelhantes, uma vez que partilham o mesmo fundo genético. Uma vez que a principal diferença entre os dois tipos de sublinhas é a capacidade metastática, os genes que diferem entre eles deve correlacionar bem com a metástase. Além disso, o método é capaz de distinguir as fases de invasão de metástase e permite o estudo de passos específicos em metástases, que não podem ser avaliadas no modelo de animais vivos.

Recentemente, têm sido relatados miARNs para promover [49] [50], ou suprimir [51] - [54] metástase de tumor, proporcionando uma nova perspectiva sobre o processo metastático. No entanto, o papel de miARNs na metástase GC está ausente. Neste relatório, nós exploramos e obteve, pela primeira vez 45 miRNAs relacionadas com metástases em GC com base em um modelo de célula metástase bem estabelecida. A constatação de que o miR-218 foi regulada negativamente em GC metastático é intrigante, como a diminuição dos níveis de miR-218 têm sido relatados em vários tipos de tumores sólidos [24] - [27], [55], indicando que a perda de miR-218 pode ser um evento comum na tumorigênese. No presente estudo, nós focada no efeito de miR-218 em metástase GC e demonstraram que o miR-218 actua como um supressor tumoral em metástase GC. Restauração de miR-218 migração celular reduzida e invasão in vitro
e tumor metástase in vivo
. Para obter linhas de células estáveis ​​que sobre-expressa miR-218, nós transfectadas células MKN28-M com o miR-218 plasmídeos e blindados por G418. Foram selecionados doze colónias de células no grupo de miR-218 transfectadas e encontrou 10 de 12 colónias exibiu notavelmente uniformes, e expressão estável de alto nível de miR-218. Além disso, três linhas de células monoclonais escolhidos aleatoriamente exibiram redução semelhante em ablility invasiva. No entanto, as estratégias de transfecção de plasmídeo muitas vezes resultam em menor eficiência de integração em comparação com a expressão viral que conduz à possibilidade de selecção de estocástica raros variantes funcionalmente heterogéneas de grandes quantidades da população inicial. Portanto, a utilização futura de sistemas de expressão viral deve criar uma população de partida mais imparcial para testar a nossa hipótese.

Como parte de nossa pesquisa sobre como a perda de miR-218 afeta GC metástase, demonstramos que Robo1 era um crítico alvo a jusante de miR-218. Sabe-se que robo é um receptor de orientação de axónios fenda e é conservada em animais que vão desde as moscas da fruta a mamíferos. Nos mamíferos, três fenda (Slit1-3) e quatro genes robo (Robo1-4) foram descritos [56], [57]. As interações Slit-Robo transmitir sinais de mediação sugestões repulsivas sobre axônios e cones de crescimento durante o desenvolvimento neural e participar em celulares e monócitos quimiotaxia T [58] - [64]. Tal como para outras vias de desenvolvimento, da expressão aberrante de fenda -
genes robo foi observada numa variedade de tipos de tumores [65] - [68]. Por exemplo, em amostras de tecido de carcinoma da mama, Robo1 tem sido mostrado a ser sobre-expressos, e tem sido demonstrado para induzir a migração de linhas celulares de cancro da mama [37]. sinalização Slit2-Robo1 facilita a migração de células de glioma [36] e está envolvido na angiogénese, aumentando a densidade de microvasos e a massa do tumor num modelo de xenoenxerto de tumores [30]. Wang et al.
Demonstrado que a expressão excessiva de Robo1 em novos vasos sanguíneos em tumores induz neovascularização e crescimento do câncer através de uma interação entre Robo1 e seu ligante, Slit2. Também identificaram-fosfoinositida 3-quinase (PI-3K) como um efector a jusante de sinalização Slit2 /Robo1. Isto sugere que existe uma cascata de fenda Robo1-PI-3K que poderia levar à geração de fosfoinositol-3,4,5-trifosfato e a activação subsequente de GTPases pequenas que medeiam o movimento celular e remodelação do citoesqueleto de actina [30] , [35]. Em contraste, outros estudos têm argumentado que a regulação negativa da Robo1 causadas por deleções ou modificações epigenética pode desempenhar um papel na progressão tumoral [69] - [73]. Propõe-se que existe um padrão de expressão específico de tecido para os genes de fenda robo.

Neste estudo, verificou-se que muitas vezes Robo1 foi expresso em níveis elevados em células invasivas e em baixos níveis em células não-invasivos , ao passo que o miR-218 exibiu o padrão de expressão em frente. Quando transfectado o vector de miR-218-expressão e oligonucleótidos que inibem em células MKN28-M e MKN28-NM, respectivamente, foi observado um padrão de expressão inversa entre o miR-218 e Robo1, isto é, se o miR-218 de expressão foi elevada, Robo1 expressão foi baixa e vice-versa. Este resultado foi confirmado em amostras clínicas e em ensaios de actividade de luciferase. Notamos também que a indução da expressão de Robo1 pela construção mutante Robo1 sem o sítio de ligação de miR-218 poderia reverter a supressão miR-218-mediada da invasão de células tumorais. Em contraste, a expressão do gene de knockdown Robo1 por RNAi teve um efeito na redução da invasão de células de tumor semelhante ao da restauração de miR-218, embora Robo1 knockdown sozinho demonstrou um efeito fraco. Isto poderia ser por causa Robo1 não é o único alvo de miR-218 que é relevante para a metástase do tumor. Estes resultados indicam que o efeito de supressão de invasão de miR-218 é pelo menos parcialmente mediado através de uma diminuição na expressão Robo1. Este é também o primeiro estudo a mostrar que o Robo1 gene associado a tumores é regulada negativamente por miR-218 por meio de um sítio alvo específico (971-978 nt) no interior da 3'-UTR. O receptor Robo1 é crucial para a resposta a sinais extracelulares e alterações fenotípicas celulares; portanto, a regulamentação rigorosa do receptor Robo1 por miR-218 pode facilitar a transdução de sinal mais robusto. O anticorpo monoclonal anti-Robo1 tem sido relatada como sendo um tratamento eficaz para cancros que expressam Robo1 [30], [33]. No presente estudo, encontramos um novo inibidor de Robo1, miR-218, que podem, potencialmente, ser usado para tratar alguns tipos de câncer.

Como mencionado acima, Slit1, Slit2 e Slit3 compreendem a família de Fenda de proteínas. Embora os genes que se sobrepõem, os seus padrões de expressão e funções são distintas. As duas primeiras proteínas são conhecidos por estar envolvidos na orientação de axónios e migração de células [37], [74], enquanto Slit3 está envolvido no desenvolvimento de órgãos e sistemas, incluindo o diafragma e o rim [75]. De acordo com estes dados, descobrimos que Slit2, mas não Slit3, interagiu com Robo1 para promover a invasão GC.

Além disso, foi demonstrado que os genes que codificam miR-218 foram localizados em e transcritas em conjunto com genes de fenda , que eram ligantes Robo1, criando assim um ciclo de feedback negativo que regula a sinalização de fenda /Robo1. Sailen Barik demonstrou que um miRNA intrônica, miR-338, genes que são funcionalmente antagônico ao seu produto de gene de acolhimento silenciados, criando assim um ciclo de feedback positivo que auxilia no papel fisiológico do gene host [76].

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