PLoS ONE:? Vascular CXCR4 expressão - um novo alvo antiangiogênico em Câncer Gástrico

Background

G-acoplados à proteína receptores

Abstract
(GPCRs) são os principais candidatos para a novela prevenção do câncer e estratégias de tratamento. Temos procurado por GPCRs diferencialmente expressos em carcinomas gástricos positivos nó.

Metodologia /Principais Achados

A expressão diferencial de GPCRs em vs. positiva de três nó de três nó carcinomas gástricos do tipo intestinal negativo foi analisada pelo conjunto de genes tecnologia. Os genes candidatos CXCL12 e o seu receptor CXCR4 foram validados em tempo real por transcrição reversa de reacção em cadeia de polimerase em um conjunto independente de 37 carcinomas gástricos. A tradução foi estudada por imuno-histoquímica em 347 carcinomas gástricos utilizando microarrays de tecido, bem como em 61 de correspondência de metástases linfáticas. A expressão proteica foi correlacionada com as características do paciente clínicas e sobrevivência. 52 GPCRs e genes relacionados com o GPCR foram para cima ou para baixo-regulado no câncer gástrico positivo nó, incluindo CXCL12. A expressão diferencial de CXCL12 foi confirmada por RT-PCR e correlacionada com o crescimento local do tumor. imunopositividade CXCL12 foi negativamente associado com metástases à distância e grau do tumor. Apenas 17% dos carcinomas gástricos mostrou células tumorais imuno CXCR4, que foi associado com maior extensão do tumor local. 29% de carcinomas gástricos mostrou CXCR4 microvasos de tumor positivo. expressão Vascular CXCR4 foi significativamente associada com maior extensão local do tumor, bem como maiores UICC-estágios. Ao expressar ambos, CXCL12 em células tumorais e CXCR4 em microvasos de tumor, estes tumores foram também altamente significativamente associados com maior T e UICC-estágios. Três metástases linfáticas revelou expressão CXCR4 vascular, enquanto as células tumorais completamente faltava CXCR4 em todos os casos. A expressão de CXCL12 e CXCR4 não teve impacto na sobrevida dos pacientes.

Conclusões /Significado

Nossos resultados fundamentam a importância da GPCRs sobre a biologia dos carcinomas gástricos e fornecer evidências de que a via CXCL12-CXCR4 pode ser um novo alvo antiangiogênico promissora para o tratamento de carcinomas gástricos

Citation:. Ingold B, Simon E, Ungethüm U, Kuban RJ, Müller BM, Lupp a, et al. (2010) Vascular CXCR4 expressão - um romance antiangiogênico alvo no câncer gástrico? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10.1371 /journal.pone.0010087

editor: Irene Oi Lin Ng, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 22 de setembro de 2009; Aceito: 16 de março de 2010; Publicação: 08 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Ingold et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Berliner Krebshilfe (Berlin Canceraid). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns em todo o mundo, ocupando o quarto lugar na frequência global e respondendo por mais de 650.000 mortes por ano [1]. A mortalidade de câncer gástrico só é superado por câncer de pulmão. câncer gástrico precoce muitas vezes não causa sintomas específicos. A falta de sintomas precoces retarda o diagnóstico. Consequentemente, 80-90% dos pacientes com câncer gástrico ocidentais presentes com tumores avançados, quando metástases locais ou distantes já tinha ocorrido [1]. O status do nó de linfa, especialmente a proporção de linfonodos metástases positivos /metástase-negativos, é o mais forte fator prognóstico do câncer gástrico [2]. A taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes com metástases 1-6 linfáticos é de 44% e terminando com apenas 11% em pacientes com mais de 15 linfonodos positivos. gastrectomia parcial ou total, combinado com radioterapia adjuvante e /ou quimioterapia como indicado, promete cura completa apenas em pacientes com doença em estágio inicial. Na doença metastática, atualmente utilizados regimes de radioterapia e quimioterapia têm má progressão eficácia e resistentes às doenças de tratamento leva à morte dentro de poucos meses [3]. Até à data, não existe nenhum marcador preditivo específica como HER2 no carcinoma da mama, carcinoma de pulmão de EGFR em células não pequenas ou K-ras no carcinoma colorectal, o que permite uma estratégia terapêutica mais individualizada. Portanto, são necessárias novas abordagens terapêuticas moleculares-alvo.

G-acoplados à proteína receptores (GPCRs) representam, de longe, a maior família de moléculas da superfície celular, que transmitem os sinais via proteína de ligação ao GTP (G-proteína ) -initiated cascatas segundo mensageiro na célula [4]. Os GPCRs são reguladas por muitos agonistas, mas todos partilham uma característica núcleo composto por sete transmembranar α-hélices, que estão ligadas através de três intra e três voltas extracelulares. Estes receptores controlar as funções fisiológicas importantes, incluindo neurotransmissão, hormônios e liberação de enzimas a partir endócrinas e exócrinas glândulas, respostas imunes, contração muscular e regulação da pressão arterial para citar alguns [4].

As células malignas muitas vezes seqüestrar o fisiológico normal funções de GPCRs para sobreviver, proliferar de forma autónoma e iludir o sistema imunitário. Além disso GPCRs desempenhar um papel central na angiogénese induzida por tumores e metástases de cancro. Muitos tumores sólidos dependem de GPCRs para induzir uma resposta angiogénica quer actuando em componentes endoteliais ou do estroma directamente ou através de regulação da libertação ou da actividade de outros mediadores angiogénicos tais como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) pela estromais e células do sistema imunológico [5]. As células cancerosas manipular GPCRs para atrair células endoteliais e levá-los a invadir a massa tumoral, formando assim novas embarcações para fornecer nutrientes e oxigênio. Muitos tipos de câncer metástase para órgãos específicos, o que muitas vezes é causada pela expressão aberrante de GPCRs em células cancerosas - receptores especialmente quimiocinas - concomitante com a libertação de quimiocinas dos órgãos secundários [6]

entrega da droga, imagiologia de tumores. e biomarcadores que predizem malignidade são aplicações de GPCRs para destacar: peptídeos de rádio-marcados que se ligam a GPCRs podem ter amplas aplicações para diagnóstico e terapia do cancro [7]. Os ligandos que se ligam a GPCRs também foram conjugados com os agentes citotóxicos para visar especificamente as células malignas que sobre-expressam estes receptores, reduzindo, por conseguinte, os efeitos colaterais [8]. Além disso, GPCRs podem ser biomarcadores valiosas para diagnóstico de câncer como provado por estudos em câncer de próstata [9].

Por isso, o nosso objectivo (i) avaliar GPCRs diferencialmente expressos em negativo nodal contra carcinoma gástrico nodal positiva tipo intestinal por técnica de matriz GeneChip. (Ii) A transcrição de genes candidatos foi validado pela reacção em cadeia da polimerase-transcrição reversa em tempo real (real-time PCR-RT). Avaliou-se a tradução e a distribuição histoanatomical da CXCL12 quimiocina e o seu correspondente receptor de quimiocina CXCR4 em uma grande série de 347 amostras de carcinoma gástrico imuno-histoquimicamente utilizando o tecido de microarray-tecnologia, bem como em correspondência de 61 metástases de nódulos linfáticos em lâminas convencionais (III). Nós correlacionaram os padrões de expressão de translação com um amplo conjunto de características clinicopatológicas dos pacientes, incluindo a sobrevida do paciente (iv).

Resultados

expressão gênica diferencial em nó negativo e positivo nó gástrica tecido canceroso

primeiro, estudamos a expressão diferencial de mRNA em uma série de tipo 6 intestinal pacientes com câncer gástrico (3 com e 3 ausência de metástases linfáticas) usando o Genome U133 GeneChip® humano mais 2,0 matriz de Affymetrix que detecta 47.000 transcrições e variantes bem como 38.500 genes humanos bem caracterizados. ARNm foi extraído e transcritos apenas a partir de amostras de tecido obtidas a partir dos tumores primários. Um total de 115 transcrições foram encontrados para ser para cima e 219 para ser regulada para baixo no câncer gástrico positivo nó comparação com cancros gástricos negativos nó (Tabela S1). Seguinte, procurou GPCRs diferencialmente expressos. Foram identificados 52 GPCRs e genes relacionados com o GPCR, que foram para cima ou para baixo-regulado com um fator de mudança dobra de >. 1.5 (Tabela S2)

In silico
análise

em seguida, procurou o ENTREZ
base de dados do " National Center for Biotechnology Information (NCBI)
" para as entradas dos GPCRs e GPCR-ligantes e seu suposto papel na biologia tumoral . O significado do II tipo 1 do receptor de angiotensina no câncer gástrico foi previamente verificada por meio de nosso próprio grupo [10]. Vários estudos mostraram que a expressão do receptor de quimiocina grupo sanguíneo Duffy (DARC) correlacionado inversamente com a prevalência e prognóstico de cancro da próstata [11] - [13]. No modelo animal de cancro da mama a expressão de EDG2 correlacionada com a incidência de metástases pulmonares [14]. FPRs mediar o efeito de anexina 1 sobre a motilidade celular e a invasão, que são importantes para o potencial metastático de células tumorais [15]. LGR5 foi recentemente demonstrado ser um marcador de células estaminais de células do intestino delgado e do cólon e células-tronco perda específica de resultados Apc nas neoplasias que crescem progressivamente [16]. Colectivamente, estes dados fornecem evidências de que a nossa abordagem identificada GPCRs e GPCR-ligantes que podem estar envolvidos na biologia do câncer gástrico. No que diz respeito receptores de quimiocinas e de quimiocinas, a expressão da CCL2 quimiocinas e CXCL12 foram aumentadas no cancro gástrico positiva nodal em comparação com casos negativos nodais (quadro suplementar S2). Desde o eixo CXCL12-CXCR4 desempenha um papel proeminente na tumorigénese, promovendo a angiogénese e migração de células tumorais para locais metastáticos [17] - [19], foram selecionados CXCL12 e seu receptor CXCR4 para posteriores análises

Transcrição de. CXCL12 e CXCR4 no câncer gástrico

A expressão diferencial de CXCL12- e CXCR4-mRNA foi validado por real-time RT-PCR em um conjunto independente de amostras de carcinoma gástrico 37 do tipo intestinal. Nós comparamos mucosa não-neoplásica com o tumor primário, bem como tumores primários do nó negativo com tumores primários de cancros positivos nó.

CXCL12 expressão foi significativamente aumentada em comparação com carcinoma gástrico mucosa não-neoplásicas (p = 0,033 ). Confirmando os dados da matriz, expressão CXCL12 também foi regulado para cima em carcinoma gástrico positiva nodal comparação com casos negativos nodais. No entanto, essa diferença não alcançou significância estatística (p = 0,132; Figura 1A). Quanto ao crescimento local do tumor, não houve diferença significativa na expressão de CXCL12 no tumor fase /T2 pT1 contra tumores /T4 PT3. Mas, curiosamente, expressão CXCL12 mostrou uma associação significativa em pT1 /pT2a contra pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; Figura 1B)

Não houve uma diferença de expressão CXCR4 em carcinoma gástrico contra o tecido não-neoplásica. (p = 0,229), nem em negativo nodal contra carcinoma gástrico positiva nodais (p = 0,22; Figura 1C). Comparando expressão CXCR4 com a extensão local do tumor, os níveis de CXCR4-mRNA aumentou com o crescimento do tumor local. (P = 0,079; Figura 1D)

Tradução de CXCL12 no carcinoma gástrico, correlação com os parâmetros clínico e análise de sobrevivência

A tradução e distribuição histoanatomical de CXCL12 foi posteriormente estudada por imuno-histoquímica em 347 amostras de carcinoma gástrico. Em 291 casos, a imunorreactividade foi CXCL12 avaliável. As células de tumor expressas CXCL12 em 244 de 291 (84%) amostras. Um forte imunorreacção citoplasmática e membranoso foi observada em 143 (49%) casos, e uma coloração fraca em 101 (35%). 47 tumores (16%) não tinham CXCL12-imunorreactividade. Todas as amostras de tumor mostrou uma positividade CXCL12 distinta das células endoteliais vasculares, que serviu como um controlo positivo interno (Figura 2A-C). A análise estatística mostrou uma correlação significativa entre a expressão de CXCL12 em células tumorais e metástases distantes (p = 0,043), bem como o grau do tumor (p = 0,0064). Todos os outros parâmetros clínico mostrou nenhuma associação com a expressão em células tumorais CXCL12 (tabela 1). Ao dividir a coorte em dois grupos, isto é, do tipo intestinal e carcinoma gástrico tipo difuso, não houve correlação entre a expressão de CXCL12 e qualquer parâmetro clínico-patológico de um ou outro grupo (dados não mostrados). A expressão CXCL12 em células tumorais não teve impacto na sobrevida dos pacientes (grupo inteiro: p = 0,830; tipo intestinal carcinoma: p = 0,766; difusa tipo carcinoma: p = 0,817).

Tradução de CXCR4 em carcinoma gástrico, correlação com os parâmetros clínico e análise de sobrevivência

Tradução de CXCR4 também foi estudada por imuno-histoquímica. Imunoreatividade em células tumorais foi avaliável em 293 amostras de tumores, dos quais apenas 6 (2%) apresentaram uma coloração membranoso inequívoca (categoria 2+; Figura 2D). A maioria das amostras de tumor positivo CXCR4 só revelou uma imuno CXCR4 citoplasmática fraca (categoria 1+, 44 casos, 15%; Figura 2E). CXCR4 imunorreactividade nuclear não foi observado em qualquer caso, e qualquer tipo de célula. Um total de 83% (243 de 293) dos carcinomas gástricos foram immunonegative para CXCR4, a maioria deles mostrando concomitantes leucócitos positivos CXCR4 como um controlo positivo interno (Figura 2F). Curiosamente, tal como anteriormente observado em carcinomas colorectais, 86 de 293 carcinomas gástricos (29%) mostraram microvasos CXCR4 positivos no estroma do tumor com uma forte imunorreactividade CXCR4 de células endoteliais (Figura 3A). A natureza vascular dessas estruturas delicadas foi confirmada por um imuno CD34 (3b figura).

Ao correlacionar expressão CXCR4 em células tumorais com vários parâmetros clínico, expressão CXCR4 foi significativamente associada com maior extensão local do tumor (T-status; p = 0,030). No entanto, há outras associações de expressão de CXCR4 tumoral e outras variáveis ​​clinicopatológicas foram encontrados (tabela 2). Ao analisar o subgrupo de carcinomas gástricos do tipo intestinal, não foram encontradas associações com qualquer parâmetro clínico-patológico (dados não mostrados).

Em seguida, estudou-se a correlação entre a expressão CXCR4 em células endoteliais (expressão CXCR4 vascular, vCXCR4) de tumor microvasos e vários parâmetros clínico. Curiosamente, a expressão de CXCR4 em microvasos correlaciona altamente significativamente com o crescimento local do tumor (T-categoria; p = 0,0001) bem como com o estágio UICC-tumoral (p = 0,0059). Mesmo nos subgrupos de tipo intestinal e carcinoma gástrico tipo difuso, expressão vCXCR4 foi significativamente associada com extensão local do tumor (tipo intestinal: p = 0,004; difusa Tipo: p = 0,030) e estágio UICC-tumor (tipo intestinal: p = 0,020) . Além disso vCXCR4 expressão foi significativamente associado com a idade do paciente (p = 0,0148) em todo o grupo (tabela 3).

Análise de sobrevivência mostraram que a expressão de CXCR4 em células tumorais de carcinoma gástrico, bem como em microvasos de tumor não teve impacto . na sobrevivência

concomitante expressão CXCL12 /vCXCR4 no carcinoma gástrico

Uma vez que o eixo de CXCL12-CXCR4 foi mostrado estar envolvida em progressão tumoral [17] - [19], foi investigada a correlação da expressão concomitante de CXCL12 e vCXCR4 com os parâmetros clínico. Na verdade, os tumores positivos CXCL12-vCXCR4 foram associados com maior extensão local do tumor (p = 0,0014) e estágios UICC maior (p = 0,017). No entanto, ele não teve impacto na sobrevida dos pacientes, mesmo nos subgrupos de carcinoma gástrico tipo intestinal e difuso.

Padrão de expressão de CXCL12 e CXCR4 na correspondência de metástases linfáticas

O eixo CXCL12-CXCR4 foi referida como estando envolvida em processos metastáticos em diversas entidades tumorais. Portanto nós examinamos CXCL12 e CXCR4 imunorreatividade em um subconjunto de 61 correspondentes de metástases linfáticas. O padrão de expressão CXCL12 estava disponível para 46 metástases. No geral, 4 de metástases linfáticas foram CXCL12 negativo como seu tumor primário correspondente. 40 de metástases linfáticas, mostrou uma positividade CXCL12 clara de acordo com o tumor primário. A intensidade da coloração foi muito heterogêneo mostrando células tumorais fortemente positivos aglomerados de células tumorais adjacentes ao fracamente manchado. No entanto, revelou duas metástases CXCL12 imunorreactividade embora nenhuma expressão CXCL12 foi detectada no tumor primário.

CXCR4 imunorreactividade foi avaliada em 54 metástases de nódulos linfáticos. Interessantemente, nenhum deles mostrou qualquer expressão de CXCR4. Mesmo aqueles tumores (n = 6), mostrando uma positividade CXCR4 fraca no tumor primário, não tinha expressão CXCR4 nas metástases em linfonodos correspondentes. No entanto, todas as metástases linfáticas, revelou claramente linfócitos positivos CXCR4, que serviram como controle interno positivo. Curiosamente, em três casos intratumoral microvasos CXCR4 positivos eram detectáveis.

Discussão

receptores acoplados à proteína G representam a maior família de receptores transmembranares. Cinco por cento de todo o código genes humanos para mais de 800 GPCRs diferentes e cerca de 80 ligantes diferentes foram identificados até agora [20]. Os GPCRs são os alvos farmacológicos mais comuns em medicina, ou seja, quase 30% de todos os fármacos são dirigidos contra os GPCRs. A evidência está aumentando que GPCRs também podem ser alvos promissores para a terapia do cancro. Neste estudo teve como objetivo encontrar GPCRs que são diferencialmente expressos em câncer gástrico positivos nó e, portanto, podem ser considerados como alvos futuros para o tratamento do câncer gástrico. Encontramos 52 GPCRs e genes relacionados com o GPCR que são para cima ou para baixo-regulado no tecido de câncer de nódulo positivo primário gástrica em comparação com câncer negativo nó. Vários dos GPCRs foram anteriormente mostrado para ser envolvido na biologia dos tumores, tais como AT1R, EDG2, DARC, e FPR1 [10], [11], [14], [15]. Mais interessante, a lista também incluídos LGR5 [16], o qual foi recentemente mostrado ser um marcador de células estaminais no intestino delgado e cólon. Além disso, a perda específica do APC em células LGR5-positivos em neoplasias progressivamente crescentes. Assim, in silico
validação dos nossos dados suportam a hipótese de que os GPCRs estão envolvidos na biologia do tumor do cancro gástrico.

Os nossos estudos de validação subsequentes utilizando um grupo de pacientes independentes mostraram que o GPCR- ligando CXCL12 é expresso em células tumorais da maioria de carcinomas gástricos. Além disso, a expressão CXCL12 é negativamente associado com metástases à distância e grau do tumor. Ao contrário, apenas 17% dos carcinomas gástricos mostrou células tumorais imuno CXCR4, que foi associado com maior extensão do tumor local. Curiosamente, cerca de um terço dos carcinomas gástricos mostrou CXCR4 microvasos de tumor positivo. expressão Vascular CXCR4 foi significativamente associada com maior extensão local do tumor, bem como maiores UICC-estágios. Ao expressar ambos, CXCL12 nas células tumorais e CXCR4 em microvasos tumorais, estes tumores também foram significativamente associados com maior T e UICC-estágios, apoiando o papel do eixo CXCL12-CXCR4 em neoangiogênese de câncer gástrico
.

Entre os GPCRs, o sistema de quimiocina contribui significativamente para a progressão do tumor por meio da modulação da reacção inflamatória local, a proliferação de células de tumor, migração e sobrevivência, bem como a neoangiogénese [4]. O CXCR4 do receptor de quimiocina, inicialmente, foi encontrada para regular o homing de linfócitos na inflamação e representa um co-receptor para o vírus da imunodeficiência humana (VIH) [21]. Fisiologicamente, o eixo CXCL12-CXCR4 está envolvido na migração de células embrionárias do sistema nervoso central, de medula óssea e de coração [22], [23]. Ela desempenha um papel crítico em processos metastáticos, como mostrado para a mama [24], [25], do ovário [26] e o cancro da próstata [27] e CXCL12 é altamente expresso em órgãos que são locais frequentes de metástases distantes como pulmão, fígado e da linfa nodos [28]. No carcinoma gástrico, os dados relativos a via de CXCL12-CXCR4 são escassos [29]. Existe alguma evidência de que o CXCR4 expressando carcinomas gástricos mais propensos a desenvolver uma propagação peritoneal do tumor, e ascites malignos contém altas concentrações de CXCL12 [30].

Comparando os dados da matriz de genes com os obtidos por RT-PCR e imuno-histoquímica, foi interessante notar que a expressão diferencial de CXCL12 no carcinoma gástrico positiva nó foi confirmada na transcrição, mas não no nível translacional. Aqui, a detecção imunohistoquímica da CXCL12 em células tumorais correlacionada apenas com metástases à distância e grau do tumor, mas não com propagação nodal. No entanto, CXCL12 foi encontrada não só em células tumorais, mas também em células endoteliais e células do estroma [31], e a expressão global no compartimento todo o tecido é mais difícil de avaliar por imuno-histoquímica. Pelo contrário, os nossos estudos de transcrição utilizado homogenatos de tecido que integram toda a CXCL12 células do tecido tumoral que expressa. No entanto, tem que ser mantido em mente que a transcrição do gene nem sempre se correlaciona com a tradução do mRNA e que o efeito biológico do tumor de CXCL12 pode também depender da presença e distribuição histoanatomical de CXCR4. Em apoio desta tese, fomos capazes de mostrar que a expressão concomitante de CXCL12 em células tumorais e CXCR4 em microvasos tumorais correlacionados com o crescimento local do tumor e estágio UICC-tumor.

Foi relatado que tumoral positividade CXCR4 correlaciona-se significativamente com o desenvolvimento de carcinomatose peritoneal [30]. Além disso, a forte expressão CXCR4 foi significativamente associada com metástases linfáticas, estágios UICC mais elevados e uma taxa de sobrevivência de 5 anos reduzida [32]. Os nossos resultados parecem diferir a partir destes estudos anteriores. Ao avaliar CXCR4 imunorreatividade nas células tumorais, foi observada uma taxa baixa expressão. Apenas 17% das amostras de tumor mostrou uma imunorreactividade fraca principalmente CXCR4. Além disso, todos os 61 correspondentes de metástases linfáticas, faltava expressão CXCR4. Este padrão de coloração pode explicar, porque por exemplo em carcinomas gástricos tipo intestinal, a expressão de CXCR4 só foi significativamente associado com o crescimento local do tumor (T-categoria), mas não com outros factores clinicopatológicas como anteriormente descrito. Foi utilizado um anticorpo CXCR4 completamente caracterizada com uma especificidade mais elevada do que os anticorpos comercialmente disponíveis, como mostrado por Fisher e colegas [33]. Esta diferença na especificidade poderia servir para diferentes padrões de coloração. Por exemplo, uma expressão CXCR4 nuclear, que foi relatado para ser associado a metástases linfáticas em câncer colorretal, não foi visto em nossa série [34]. Além disso, nunca detectada positividade CXCR4 nas células do estroma, como descrito num estudo de Saigusa e colegas [35]. Para esclarecer, se a via de CXCR4-CXCL12 em última análise, contribui para a geração de metástases no carcinoma gástrico, especialmente metástases linfonodais, são necessários mais estudos.

Cerca de um terço dos carcinomas gástricos analisados ​​mostraram CXCR4 ao tumor positivo em torno microvasos . As células tumorais requerem fornecimento adequado de oxigênio e nutrientes para manter a sobrevivência. Mesmo com anormalidades genéticas que desregular o crescimento e a sobrevivência de células individuais, tumores não pode aumentar para além de 1-2 mm ^{3 sem vascularização e a morte celular induzida por hipoxia ocorre. Demonstrou-se que o CXCR4 é expressa por células endoteliais e estimulação dos receptores CXCR4 por CXCL12 tem um efeito pró-angiogénico [36]. Além disso, o CXCR4 é um gene induzível hipoxia, regulada pelo factor 1α induzida por hipoxia (HIF1α). Quando o oxigênio é escasso, como em tumores que crescem rapidamente, HIF1α aumenta a expressão CXCR4 [37]. O aumento da expressão de CXCR4 nas células endoteliais observadas no nosso colectiva do tumor pode ser parte de uma resposta hipóxica integrada do tumor em crescimento que permite a geração de novos vasos sanguíneos. Em nosso grupo de estudo, a expressão CXCR4 vascular significativamente correlacionada com a extensão do crescimento do tumor local. Em 8% dos tumores T1 /pT2a (4 de 52) e em 34% dos T2b /T3 /tumores pT4 (81 de 239) microvasos CXCR4 positivos eram detectáveis. carcinomas gástricos T2b /T3 /T4 em estágio mais provável abrigar um microambiente hipóxico que os tumores /T2a em estágio T1 e, assim, pode induzir a expressão do gene CXCR4 e angiogênese. Detecção de microvasos positivos CXCR4 em grandes metástases linfáticas (> 9 mm de diâmetro) confirmaram essas observações. Além disso, temos mostrado anteriormente resultados comparáveis ​​em carcinoma colorectal [38]. Além disso, como mostrado na glioblastoma multiforme [39], as amostras tumorais, revelando ambos, CXCL12 células tumorais positivas e microvasos positivos CXCR4 foram altamente significativamente associada com elevada extensão local do tumor e estágios elevados UICC, apoiando ainda mais o significado de um eixo CXCL12-CXCR4 funcionais biologia do cancro gástrico}

em resumo, mostra-se que os GPCRs são expressos diferencialmente em tecido de cancro gástrico e podem contribuir para a biologia do tumor:. tumores expressando ambos, CXCL12 em células tumorais e CXCR4 em torno do tumor microvasos, mostram uma altamente associação significativa com o crescimento do tumor local e estágios UICC. Estes resultados, em conjunto com os nossos dados anteriores sobre o carcinoma colorrectal, substanciar o papel do eixo CXCL12-CXCR4 no tumor-neoangiogénese em tumores gastrointestinais. A via CXCL12-CXCR4 pode ser novo alvo antiangiogênico promissora para o tratamento de carcinomas gástricos.

Materiais e Métodos

amostras de tumor

As amostras de tecido de câncer gástrico foram obtidas cirurgicamente Charité University Hospital Berlim (1995-2008). tecido fresco congelado de 6 casos de carcinoma gástrico tipo intestinal foi utilizado para análise GeneChip (nodal negativo: 3 pacientes; nodal positivo: 3 pacientes; feminino-masculino-ratio: 1:02). Uma série independente de tecidos normais e tumorais cancerosas adjacentes emparelhados de 37 carcinomas gástricos tipo intestinal foram examinados por em tempo real de RT-PCR (nodal negativo: 12 pacientes; nodal positivo: 25 pacientes;-fêmea macho-rácio: ~1:1 , por características detalhadas paciente ver tabela S3). Para as análises de imuno-histoquímica, um grupo de pacientes de 347 pacientes consecutivos com câncer gástrico foi examinada, compreendendo 194 tipo intestinal e 122 difusas tipo carcinomas de acordo com a classificação de Lauren. 31 amostras apresentaram outros subtipos histológicos (isto é mucinoso, tubular, indiferenciada). Resumidamente, a coorte consistiu em 220 homens e 127 mulheres. A média de idade dos pacientes no momento do diagnóstico foi de 64 anos. Dados de sobrevivência foi disponível a partir de 196 destes pacientes. Follow-up de dados para os outros pacientes estava faltando porque esses pacientes não eram residentes perto do hospital e foram perdidos para follow-up. Fora de 196 pacientes, 124 morreram durante o acompanhamento. Median follow-up para aqueles pacientes ainda vivos no ponto final da análise foi de 33 meses. De 61 pacientes, o tecido de correspondentes metástases linfáticas estava disponível (27 tipo intestinal, 26 de tipo difuso, 8 outros subtipos histológicos). Somente os pacientes com diagnóstico histológico de câncer gástrico e adequada dos tecidos disponíveis foram incluídos. Os doentes com carcinoma gástrico neoadjuvantly tratados ou outras malignidades conhecidas foram excluídos do estudo. Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética local (ref. Número EA1 /06/2004).

análise GeneChip

O RNA total foi isolado com fenol-clorofórmio utilizando o kit de isolamento Mirvana ™ miRNA ( Ambion, Austin, EUA). ADN contaminante foi removido por tratamento com DNase (kit Turbo DNAfree; Ambion, Austin, EUA) a 37 ° C durante 30 min. Utilizou-se o GeneChip® Human Genome U133 mais 2,0 matrizes (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante para analisar os níveis de expressão de ARNm. Affymetrix Software Operacional GeneChip® (GCOS 1.4) automatiza o controle de estações Fluidics GeneChip® e GeneChip® Scanner 3000.

Bioinformatics

Os dados brutos foram analisados ​​com o Software Operacional GeneChip Affymetrix (GCOS 1.4) . O valor de p de detecção de um transcrito determina a chamada detecção, que indica se a transcrição é detectado de forma segura (p < 0,05; presente) ou não foi detectada (ausente). Para possibilitar a comparação entre os chips os dados foram dimensionadas para uma intensidade global 500. O Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) e pacote de software GeneSpring 7,2 (Silicon Genética, Redwood City, CA) foram usadas para resultados médios a partir de amostras diferentes e realizar estatística análise para comparar entre câncer gástrico com (N1) e sem metástases (N0) linfáticos. Os dados de seis matrizes foram normalizados para explicar a variabilidade na hibridação de pares de sondas e outros artefactos de hibridização. A normalização consiste nas três etapas a seguir: primeiro, a transformação de dados (medições a menos de 300,0 para 300,0); segundo, por chip (normalizar cada chip ao percentil 50 das medições realizadas a partir desse chip); e em terceiro lugar, por gene (normalizar cada gene para a mediana das medições para aquele gene). A mudança de dobragem foi calculada para cada gene como a média aritmética dos valores de expressão normalizados de N1 dividido pela média aritmética dos valores de expressão normalizados de N0. dados brutos de microarrays experimentos foram enviados para o Gene Expression Omnibus Banco de Dados (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).

Real-time inverter reacção em cadeia de polimerase transcriptase

Para a síntese de cDNA, 2 ug de RNA total foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de Omniscript RT (Qiagen). Os iniciadores específicos para o gene foram concebidos pelo BioTeZ Berlim-Buch GmbH (Berlin, Alemanha). As sequências dos iniciadores eram as seguintes: CXCR4 5 'CAG GTA CAG GCA AAG TGA CG, 3' CAG GGT TCC TTC GAG ATG TC; CXCL12 5 'GT CAT CGA TTC TTC GAA AGC, 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG; beta2-microglobulina 5 'ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA, 3' ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG. Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (em tempo real de RT-PCR) foi realizada utilizando o Kit ™ QuantiTect SYBR ® verde de PCR (Qiagen) e o sistema LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Os sub <> valores comparativos C T que foram normalizados para o gene doméstico de beta2-microglobulina. Sem controles de modelo (sem cDNA em PCR) foram executados para cada gene para detectar a amplificação inespecífica ou genômica e dimerização primer.

Histologia

Para as análises histológicas, amostras de tecidos foram fixados em formol a 10% neutralizado e embebidos em parafina. seções desparafinados foram coradas com hematoxilina e eosina. carcinoma gástrico foi classificada de acordo com a classificação da OMS [1]. O estágio pTNM foi determinada de acordo com as diretrizes da UICC

microarray Tissue construção

amostras de tecido embebidos em parafina fixado em formalina e foram usados ​​para gerar microarrays de tecido, como descrito anteriormente [40], [41. ]. Resumidamente, foram escolhidos três a seis regiões morfologicamente representativos dos blocos de parafina 'doadores'.

• PLOS ONE: Assinaturas Gene-expressão pode Distinguir os tipos e estágios do câncer gástrico
• PLoS Genetics: miR-218 inibe a invasão e metástase de câncer gástrico, visando os Robo1 Receptor