PLoS Genetics: MiR-218 Hemmer invasjon og metastasering av magekreft ved å målrette Robo1 Receptor

Abstract

microRNAs spiller sentrale roller i tumormetastaser. Her beskriver vi regulering og funksjon av MIR-218 i magekreft (GC) metastaser. MIR-218 uttrykk er redusert sammen med uttrykk for en av sine verts gener, Slit3 i metastatisk GC. Imidlertid er Robo1, en av flere Slissede reseptorer, negativt reguleres av MIR-218, og dermed etablere en negativ tilbakekoblingssløyfe. Redusert MIR-218 nivåer eliminere Robo1 undertrykkelse, som aktiverer Slit-Robo1 sti gjennom samspillet mellom Robo1 og Slit2, og dermed utløser tumormetastaser. Restaureringen av MIR-218 undertrykker Robo1 uttrykk og hemmer tumorcelle invasjon og metastase in vitro Hotell og in vivo
. Til sammen våre resultater beskrive en Slit-MIR-218-Robo1 regulerende krets som avbrudd kan bidra til GC metastaser. Målrette MIR-218 kan gi en strategi for å blokkere tumormetastaser.

Forfatter Oppsummering

microRNAs har blitt identifisert som å spille viktige roller i tumormetastaser, men deres innvirkning på GC metastaser har vært dårlig utforsket. Vi har oppdaget MIR-218, som fungerer som en suppressor av tumormetastase og er korrelert med kliniske stadium, lymfeknutemetastase, og prognosen hos pasienter med GC. Våre resultater viser at MIR-218 er en del av en regulerende krets som involverer Slit-Robo1 veien. I metastatiske tumorceller, ble MIR-218 trykt sammen med Slit3, en av sine vertsgener. I mellomtiden er Robo1, en av flere Slissede reseptorer oppreguleres som respons på reduksjonen i MIR-218, som i sin tur induserte en reaktiv oppregulering av den Slit-Robo1 vei gjennom en interaksjon med Slit2, noe som fremmer tumorcelle-migrering og invasjon. Slike funn ikke bare gi ny innsikt i de metastatiske mekanismer i GC, men også gi bevis for en roman miRNA-mediert reguleringsmåte reseptor signalisering

Citation. Tie J, Pan Y, Zhao L, Wu K, Liu J, Sun S, et al. (2010) MiR-218 Hemmer invasjon og metastasering av magekreft ved å målrette Robo1 Receptor. PLoS Genet 6 (3): e1000879. doi: 10,1371 /journal.pgen.1000879

Redaktør: Bruce E. Clurman, Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA

mottatt: 15 juli 2009; Godkjent: 10 februar 2010; Publisert: 12 mars 2010

Copyright: © 2010 Tie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 30670970, nr 30873026, nr 30672369, nr 30530780) og National Basic Research Program of China (No.2010CB529300). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Fremskritt i diagnostiske og terapeutiske tilnærminger har ført til gode forventninger til langsiktig overlevelse for tidlig magekreft (GC). Men prognosen for avansert GC med omfattende invasjon og metastase forblir fattige [1]. For å metastasere, må tumorcellene passere gjennom en serie av sekvensielle og selektive hendelser, inkludert løsgjøring, migrering, lokal invasjon, angiogenese, intravasation, overlevelse i sirkulasjonssystemet, ekstravasasjon, og gjenvekst i forskjellige organer. I metastatisk kaskade, invasjonen av GC i det omkringliggende vev er en avgjørende tidlig skritt [2] - [4]. Men mekanismene for invasjonen har ennå ikke fullstendig klarlagt.

Et stort antall microribonucleic syrer (microRNAs eller mirnas) har nylig blitt innblandet i kreft metastase [5], inkludert MIR-10b, MIR-21, MIR-126, MIR-335, MIR-373, MIR-146, MIR-520C, og MIR-205 i brystkreft [6] - [11]; MIR-224 og MIR-21 i prostata kreft [12], [13]; MIR-29c i nasofaryngeale karsinom [14]; MIR-10a, MIR-222, MIR-125b, MIR-7, og MIR-452 i uroteliale karsinom [15]; MIR-182 i melanom [16]; MIR-92b og MIR-9/9 * i hjernesvulster [17]; og MIR-21 i kolorektal kreft [18]. Imidlertid har svært få mirnas kjent for å være involvert i metastaser GC blitt rapportert. mirnas er naturlig forekommende, korte, ikke-kodende RNA-molekyler som negativt regulerer genekspresjon [19]. Hos pattedyr er modne mirnas generert fra pri-mirnas og pre-mirnas via sekvensiell behandling av drosha og dicer og finnes i mange organismer. De består av 21-24 nukleotider, integrere i RNA-induserende Slå complexes, og pare seg med 3-utranslaterte regioner (3'-UTR) av spesifikke mål messenger RNA (mRNA) for å undertrykke oversettelse eller indusere nedbrytning av målet mRNA [20 ]. Emerging bevis har avslørt at mirnas spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser, herunder celledifferensiering, spredning, apoptose, stress motstand, fettstoffskiftet, tumorigenesis, og metastase [21] - [23]. En bedre forståelse av endringene i miRNA uttrykket under GC invasjon kan føre til en bedre forståelse av GC utvikling, samt mulige forbedringer i diagnostikk og behandling av avansert GC.

I denne studien har vi etablert høy (MKN28-M og SGC7901-M) og lave invasive celleunderlinjer (MKN28-NM og SGC7901-NM) med en repeterende transwell analysen in vitro
. Vi undersøkte den globale miRNA uttrykket profil i hver celle underlinjen ved hjelp av en miRNA microarray for å identifisere forskjellig uttrykt mirnas knyttet til menneskelig GC invasjon. I alt ble 45 mirnas vist seg å være forskjellig uttrykt i invasiv vs. ikke-invasive GC-celler. Blant disse MIR-218, en betydelig nedregulert miRNA i svært invasive celler, viste seg å være sterkt korrelert med GC tumorigenesis og metastaser hos pasienter. Mer nylig har en reduksjon i MIR-218 blitt rapportert i flere typer av faste tumorer, inkludert prostata cancer, GC, lungekreft, og cervikal karsinom [24] - [27], men denne reduksjonen i miRNA-218 er ganske enkelt vist seg som en av de mange potensielle mirnas av interesse i kreft som er beskrevet ovenfor. Ingen ytterligere studier er utført for å vurdere betydningen av MIR-218 i tumormetastaser. Her har vi funnet at redusert Mir-218 uttrykk ble korrelert med avansert klinisk stadium, lymfeknutemetastase, og dårlig prognose hos pasienter, og re-uttrykk for MIR-218 i metastatiske celler var i stand til å hemme migrasjon, invasjon og metastasedannelse både in vitro Hotell og in vivo
. Ved hjelp av en bioinformatikk søk ​​etter Mir-218 mål, fant frem vi reseptoren Robo1 som MIR-218 funksjonelle mål, og vi bekreftet at samspillet mellom MIR-218 og Robo1 var avgjørende for GC cellemotilitet ved å vise at det var en invers korrelasjon mellom MIR -218 og Robo1 i GC-cellelinjer, så vel som i GC pasienter. Videre har vi oppdaget en interessant negativ tilbakekoblingssløyfe som involverer Slit, MIR-218, og Robo1, hvori MIR-218 kan være avledet fra en av to gener befinner seg i intronene fra to forskjellige medlemmer av Slit proteinfamilie. I tillegg er medlemmer av denne familien er ligander av Robo1 reseptoren. Vi viste at uttrykket av de to miRNA forløper gener (MIR-218-1 og MIR-218-2) korrelerte med uttrykk av vertsgener (henholdsvis Slit2 og Slit3,) og at den modne MIR-218 ble i hovedsak hentet fra Mir -218-2 forløper, med en samtidig reduksjon av verts Slit3 men ikke fra Slit2 i metastatiske GC celler. Således oppregulering av Robo1 som reaksjon på reduksjonen i MIR-218 indusert en reaktiv oppregulering av den Slit-Robo1 vei gjennom dets interaksjon med Slit2, noe som fremmer tumorcelle-invasjon og metastase. Våre funn ikke bare gi ny innsikt i metastatiske mekanismer i GC, men de har også avdekket en ny reguleringsmekanisme reseptor signalisering.

Resultater

Etablering og karakterisering av celleunderlinjer med annen invasiv og metastatisk potensialer

For å etablere GC metastasemodeller, laget vi invasive og ikke-invasive celleunderlinjer fra de menneskelige GC cellelinjer SGC7901 og MKN28 hjelp av gjentatte transwell tilnærmingen (Figur 1A, se Materialer og metoder). I korthet ble en repeterende invasjon-målingen ble utført, og de celler som ikke klarte å invadere membraner og celler som hadde evnen til å migrere gjennom den kollagenbelagt membran i alle seleksjonsrunder ble separert. Etter ti runder med valg, fikk vi invasive (MKN28-M og SGC7901-M) og ikke-invasive celleunderlinjer (MKN28-NM og SGC7901-NM). De metastatiske egenskapene til hver celle underlinjen ble så preget in vitro Hotell og in vivo
. Som vist i figur 1B og 1C, migrering evne MKN28-M-celler var omtrent 4 ganger større enn den til MKN28-NM-celler. Likeledes, den invasive potensialet var omtrent fem ganger større for MKN28-M-celler sammenlignet med MKN28-NM-celler. I in vivo
studier ble tumorcelle metastase observert i nakne mus. Som vist i figur 1D og 1E, nesten ingen metastatiske GC-celler ble detektert i lungene eller leveren hos nakne mus 10 uker etter injeksjon av MKN28-NM-celler, mens de fleste av musene injisert med MKN28-M-celler som vises tydelig lunge eller lever metastaser. Lignende resultater ble observert for SGC7901-M og SGC7901-NM-celler (data ikke vist). Det ble ikke observert signifikante forskjeller i celleproliferasjon eller celle-syklus Fordelingen blant disse celleunderlinjer (Tekst S1, figur S1 og S2).

Identifikasjon av metastaserelaterte mirnas av matrise-basert hybridisering

å identifisere mirnas potensielt involvert i GC invasjon, undersøkte vi global miRNA uttrykket i hver celle underlinjen ved hjelp av mikroRNA array (v.10.0, Exiqon, Vedbæk, Danmark), som består av 847 fanger prober for modne mennesker miRNAs. Microarray Resultatene viste at uttrykket av 124 mirnas vesentlig forskjellig mellom meget inngripende variant MKN28-M og non-invasiv celle underlinjen MKN28-NM. Av disse 83 var oppregulert og 41 ble nedregulert. Sammenlignet med SGC7901-NM, ble 62 mirnas forskjellig uttrykt i SGC7901-M celle underlinjen, inkludert 47 downregulated og 15 oppregulert miRNAs. I alt ble 11 mirnas funnet å være oppregulert og 34 mirnas ble nedregulert i begge MKN28-M og SGC7901-M-celler sammenlignet med de i de tilsvarende ikke-invasive underlinjer (tabell S1).

Av de 45 forskjellig regulerte mirnas, MIR-218 var en av de som vises betydelig forskjells uttrykk. MIR-218 er blitt rapportert å bli nedregulert i livmorhalskreft [25], GC [26], lungecancer [27] og prostatakreft [28], noe som indikerer mulig involvering i både onkogen transformasjon og tumormetastase. Imidlertid miRNA-218 ble bare en av de mange mulige mirnas av interesse i kreft. I dette arbeidet har MIR-218 er undersøkt i mye større detalj. For å validere microarray resultater, vurdert vi Mir-218 uttrykk i GC celleunderlinjer som tidligere nevnt, og i den udødelige mage epiteliale cellelinje GES hjelp QRT-PCR [29]. MIR-218 uttrykk ble betydelig redusert i MKN28-M og SGC7901-M-celler og var lavere i alle fire GC celleunderlinjer i forhold til udødeliggjort menneskelige mage epitelceller GES celler (Figur 2A). Videre sammenlignet vi Mir-218 uttrykk i den primære GC svulst vs. metastatiske lymfeknuter i 10 pasienter med stadium III /IV GC bruker QRT-PCR. Som vist i figur 2B, modne MIR-218 nivåene var signifikant redusert i 7 av 10 metastatiske lymfeknuter, noe som indikerer at MIR-218 kan spille en kausal rolle i GC metastaser.

Redusert Mir-218 uttrykk i GC var assosiert med avansert klinisk stadium, lymfeknutemetastase, og dårlig pasient prognose

for å finne potensielle clinicopathological konsekvenser av endret Mir-218 uttrykk, undersøkte vi uttrykket nivåer av MIR-218 i 40 GC vev (T) og ikke-tumor slimhinne (N) ved QRT-PCR. Begrepet -ΔCt ble brukt for å beskrive ekspresjonsnivået av MIR-218. I overensstemmelse med de ovennevnte data, er resultatene bekreftet at den MIR-218 ekspresjonsnivået i GC (-13,81 ± 0,15, gjennomsnitt ± SE) vev var signifikant lavere enn i ikke-neoplastiske mucosa (-11,62 ± 0,15, gjennomsnitt ± SE) ( P
< 0,0001, t = 10,62, sammen t
-test) (figur 3A). Korrelasjoner mellom MIR-218 ekspresjonsnivået og clinicopathologic kjennetegn ved GC er oppsummert i tabell 1. Det ble ikke observert statistisk signifikant sammenheng mellom den MIR-218 ekspresjonsnivået og klinisk stadium og mellom MIR-218 ekspresjonsnivået og GC metastase i denne studien. Median uttrykk for MIR-218 var -14,25 ± 0,17 i de 22 tilfellene med avansert stadium (stadium III og IV) sykdom, mens median uttrykket var -13,27 ± 0,20 ( P
= 0,0010, Mann-Whitney test) i de 18 tilfellene med tidlig stadium (stadium i og II) sykdom. I de 29 tilfellene av GC med lymfeknutemetastaser, median uttrykk for MIR-218 var -14,09 ± 0,16, som var betydelig lavere enn medianen uttrykk (-13,07 ± 0,24) i de 11 ikke-metastatisk GC tilfeller ( P
= 0,0036). Uttrykket av MIR-218 i GC pasienter korrelerte ikke med alder, kjønn, tumorstørrelse, eller celledifferensiering. Videre undersøkte vi hvorvidt nivået av MIR-218-ekspresjon ble forbundet med overlevelse hos pasienter med GC. Pasientene ble deretter delt inn i lav uttrykket (n = 20) og høy ekspresjon grupper (n = 20) basert på MIR-218 nivåer større eller mindre enn den midlere (-13,81) (figur 3B). Kaplan-Meier overlevelsesanalyser viste at pasienter med primær svulster vises lavt uttrykk av MIR-218 hadde en kortere median overlevelsestid. De tre-års overlevelse for pasienter med lav Mir-218 uttrykk var 30%, noe som var betydelig lavere enn overlevelse hos pasienter med høyt Mir-218 uttrykk (65%; P
= 0,0012, log rang test;. Figur 3C)

Ektopisk uttrykk for MIR-218 hemmet tumorcelle invasjon og metastase in vitro Hotell og in vivo

for å studere rollen som MIR-218 i GC metastaser, ble MKN28-M-celler transfektert med pGenesil-en-MIR-218 eller en kontroll vektor uttrykker en uspesifikk miRNA, cel-MIR-67, ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ). Cellene ble deretter valgt med 400 mg /l G418 for å generere MKN28-M-MIR-218 og MKN28-M-MIR-kontroll stabile celler. Vi fant at ektopisk uttrykk for MIR-218 resulterte i en ca tre ganger reduksjon i migrasjon og invasivitet. For å finne ut om tapet av MIR-218 ville fremme migrasjon eller invasjonen av kreftceller, forstummet vi MIR-218 med en antisensoligonukleotid inhibitor i MKN28-NM cellelinje, noe som resulterer i en tre til fire ganger økning i celle migrasjon og invasivitet (figur 4A og 4B). For å teste om hemning av tumorinvasjon ved MIR-218 blir forårsaket ved å svekke den evnen invasive av tumorceller, utelukket vi effekten av MIR-218 på proliferasjon og cellesyklusfordelingen av magekreftceller. Over-uttrykk for MIR-218 ikke påvirker spredning og cellesyklus distribusjon av MKN28-M-celler in vitro plakater (Figur s5a og S5D). For ytterligere å undersøke inhiberingen av in vivo
tumormetastase ved MIR-218, implanterte vi MKN28-M-MIR-218-celler som var stabilt uttrykker MIR-218 eller kontrollcellene inn i nakne mus via den laterale halevenen. Lunge og levermetastaser fra GC var tydelig i mus injisert med MKN28-M-MIR-kontrollceller. I motsetning til dette ble noen metastatiske tumorer detektert i mus injisert med MKN28-M-MIR-218-celler (Figur 4C). Videre har vi observert samtidig veksten av de primære tumorer og forekomsten av fjernmetastaser i nakne mus injisert subkutant med MKN28-M-MIR-218 celler eller kontrollceller. Resultatene viste lunge eller levermetastaser var tydelig i 3 ut av 10 mus injisert med MKN28-M-MIR-kontrollceller; i sterk kontrast, ble ingen metastaser funnet hos mus injisert med MKN28-M-MIR-218 celler (Figur S5E). Disse resultatene er i samsvar med data oppnådd fra halevenen analyser som vurderer kreft metastase og indikerer at MIR-218 har evne til å undertrykke metastase uten at det påvirker celleproliferasjon.

Robo1 var en direkte funksjonell mål for MIR-218 i GC metastase

for å vurdere hvordan et lavt nivå av Mir-218 uttrykk bidrar til invasjonen og metastasering av GC, vi søkte etter potensielle regulatoriske mål for Mir-218 bruker prediksjon verktøy, inkludert Miranda, PicTar, og TargetScan. Selv om hundrevis av forskjellige målene ble forutsagt, kan de gener som er involvert i overføringen eller invasjon være relevante mål med hensyn til de biologiske funksjoner av MIR-218. Vi utførte en funksjonell klassifisering av de forut målene ved hjelp av DAVID program (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Av disse genene, er Robo1 anses som et proto-onkogen og havner migrasjons-fremmende aktivitet [30] - [35]. Mertsch et al.
Vist at Robo1 forenkler glioma cellemigrasjon formidlet av Slit2 [36]. Schmid et al.
Funnet at brystkreft svulst celle migrasjon er indusert av Slit2-Robo1 interaksjon in vitro product: [37]. Disse funnene tyder på at Robo1 kan være et mål for MIR-218. For ytterligere å teste vår hypotese, analyserte vi uttrykket av MIR-218 og Robo1 i GES og i ikke-invasiv (MKN28-NM og SGC7901-NM) og invasiv (MKN28-M og SGC7901-M) GC-celler. Resultatene viste en negativ sammenheng mellom nivåene av MIR-218 og Robo1 mRNA i disse cellene (Figur S3A). Videre observerte vi at Robo1 mRNA (Figur S3b) og protein (figur 5B2) nivåer ble redusert når MIR-218 ble uttrykt av pGenesil-en-MIR-218 i MKN28-M-celler (figur 5b1). Det motsatte ble observert for Robo1 uttrykk når MIR-218 ble slått ned i MKN28-NM celler (figur 5C1 og figur 5C2). Den omvendte forholdet mellom MIR-218 og Robo1 ekspresjon ble ytterligere bekreftet ved immunhistokjemi (Text S1) i 40 tilfeller av magekreft, i sammenfallende tilstøtende normale vev som ble også brukt i clinicopathological studier, og i 29 passet metastaser. Resultatene viser at Robo1 ble oppregulert i GC, spesielt ved metastatisk GC (figur S4), der MIR-218 har en relativt lav uttrykk.

For å oppnå ytterligere direkte bevis for at Robo1 er et mål på MIR-218 undersøkte vi bindingssetet av MIR-218 i det 3'-UTR av Robo1 mRNA (figur 5A). Vi konstruerte et luciferase reporter (Luc-Robo1) hvori nukleotider i Robo1 3'-UTR komplementært til MIR-218 (nt 971-978) ble satt inn i pMIR-RAPPORT miRNA uttrykk reporter vektor [38]. Tilsvarende har vi også genereres både en mutant reporter (Luc-Robo1-mu), der de første seks nukleotider i frø-regionen komplementære områder MIR-218 ble slettet, og en kontroll reporter, som inneholdt en ikke-relatert fragment av cDNA (Luc-Ctrl). MIR-218-ekspresjonsplasmider ble ko-transfektert med Luc-Robo1, Luc-Robo1-mu, eller Luc-Ctrl inn MKN28-M-celler. Analysene viste at luciferase aktiviteten i Luc-Robo1-transfekterte celler ble betydelig redusert sammenlignet med luciferase aktiviteten i mutant og negative kontrollceller ( P
< 0,05), noe som tyder på at MIR-218 redusert luciferaseaktiviteten av Luc-Robo1, men hadde ingen virkning på Luc-Robo1-mu (figur 5D). Derfor konkluderte vi med at det er satt inn fragment av Robo1 (nt 971 -
978). Var målet for MIR-218

Robo1 har vist seg å være over-uttrykt i kreftceller og er kjent for å fremme angiogenese og tumormetastase ved hjelp av en interaksjon med Slit [39], [40]. For å teste hvorvidt Robo1 er funksjonelt regulert av MIR-218, genererte vi en Robo1 ekspresjonskonstruksjon som inneholdt bare et fragment av den forutsagte MIR-218 bindingssete og Robo1 mutant ekspresjonsvektor som helt mangler 3'-UTR. Vi har også gjort Robo1 siRNA. MKN28-M-MIR-218 celler som stabilt uttrykte MIR-218 ectopically, ble transient transfektert med Robo1 konstruere eller mutant konstruksjon (uten MIR-218 bindingssete), og MKN28-M-celler ble transfektert med Robo1 siRNA eller en negativ kontroll siRNA. MKN28-M-MIR-218-celler transfektert med den mutante Robo1 konstruksjonen viste en 3,8-gangers økning i invasjon evne sammenlignet med celler transfektert med Robo1 konstruksjonen. Disse resultater indikerer at introduksjon av mutant Robo1 cDNA som manglet den MIR-218 bindingssete i de MIR-218-celler som overuttrykker reverseres effekten av MIR-218-formidlet hemming av celle invasjon. Effekten av Robo1 ble undertrykt ved MIR-218 i nærvær av det Robo1 3'-UTR inneholdende de MIR-218 bindingssteder. Knockdown av Robo1 av siRNA i MKN28-M-celler hemmet celle invasjon, som falt til nivåer tilsvarende de som er observert etter transfeksjon med MIR-218-uttrykke vektor (figur 5E og 5F). Disse observasjonene tyder på at Mir-218 direkte undertrykker Robo1-mediert celle invasjon.

Slit2, men ikke Slit3 kan samhandle med Robo1, beriket av fravær av MIR-218, for å fremme GC invasjon

To typer mirnas finnes: intergeniske og intronic. Den førstnevnte er plassert i ikke-kodende regioner mellom gener, og deres tilsvarende pri-mirnas er generelt transkribert fra sine egne promotorer av RNA-polymerase II. Sistnevnte befinner seg innenfor intronene vertsgener, og deres biogenese styres av verts genet promotorer [41], [42]. MIR-218 er en intronic miRNA. To gener kode for modne MIR-218, MIR-218-1 og MIR-218-2, som ligger innenfor intron 15 av Slit2 og intron 14 av Slit3 henholdsvis (figur 6A). Den intronic Plasseringen av de to MIR-218 gener bedt oss å spørre om MIR-218-1 og MIR-218-2 er transkribert sammen med sine verts genet mRNA. For å teste denne hypotesen, vi brukte QRT-PCR for å undersøke uttrykket av Mir-218-1 forløper, Mir-218-2 forløper, modne MIR-218, Slit2 mRNA, og Slit3 mRNA i GC vev som brukes i overlevelse analyse. Statistisk analyse av korrelasjonskoeffisienten av QRT-PCR-resultater viste en signifikant positiv korrelasjon mellom nivåene av Slit2 mRNA og MIR-218-1 og mellom nivåene av Slit3 mRNA og MIR-218-2 (figur 6B og 6C). Disse resultatene indikerer at Mir-218 gener, MIR-218-1 og MIR-218-2, er transkribert sammen med sine verts gener, henholdsvis Slit2 og Slit3,. En signifikant positiv korrelasjon mellom nivåene av MIR-218 og MIR-218-2 (figur 6D) ble observert i GC; Det ble imidlertid ikke en slik sammenheng sett mellom nivåene av MIR-218 og MIR-218-1 (figur 6E). Disse resultatene indikerer at nedregulering av MIR-218 i GC er fremmet av en nedgang i MIR-218-2, men ikke i MIR-218-1. I samsvar med denne konklusjonen, ble Slit3 uttrykk betydelig redusert i GC (-22,43 ± 0,21, gjennomsnitt ± SE) sammenlignet med normal mage vev (-20,79 ± 0,23, gjennomsnitt ± SE), ( P
< 0,0001, t = 7.67, sammen t
-test) (figur 6F), mens Slit2 uttrykk var ikke signifikant forskjellig ( P
= 0,0772, sammen t
-test) ( Figur 6G). Oppsummert våre eksperimentelle resultater tyder på at betydelig oppregulering av Robo1 genet i respons til fjerning av MIR-218 kan indusere en senere oppregulering av Slit-Robo1 sti gjennom sin interaksjon med Slit2, tilrettelegging svulst celle migrasjon og invasjon.

diskusjon

for å studere en sykdom, er det viktig å konstruere en ideell modell. I denne studien, isolert vi invasive og ikke-invasive cellepopulasjoner fra etablerte menneske GC cellelinjer ved hjelp av gjentatte transwell tilnærming, som har blitt brukt i mange studier å undersøke metastase [43] - [48]. Resultatene av metastatisk undersøkelse in vitro Hotell og in vivo
viste at etablerte celleunderlinjer hadde distinkte invasive og metastatiske evner. Her, vist vi ikke bare celleunderlinjer avledet fra GC cellelinjer med høy-invasiv potensial, men også de med lav-invasiv potensial. Med unntak av deres metastatiske evner, de utvalgte celleunderlinjer var begge ganske like, ettersom de har samme genetisk bakgrunn. Siden den store forskjellen mellom de to typene av underlinjer er metastatisk evne, bør de gener som er forskjellig mellom dem korrelere godt med metastasering. Dessuten er vår metode i stand til å skille invasjon stadier fra metastaser og gjør studiet av konkrete tiltak i metastasering, som ikke kan vurderes i live-dyremodell.

Nylig mirnas har blitt rapportert å fremme [49] [50] eller undertrykke [51] - [54] metastase, og gir et nytt perspektiv på metastatisk prosess. Likevel, er rollen til miRNAs i GC metastaser mangler. I denne rapporten har vi utforsket og fått for første gang 45 metastaserelaterte mirnas i GC basert på et veletablert metastase celle modell. Oppdagelsen av at MIR-218 ble nedregulert i metastatisk GC er interessant, som nedsatt har blitt rapportert MIR-218 nivåer i flere typer av faste tumorer [24] - [27], [55], noe som indikerer at tapet av MIR-218 kan være en vanlig hendelse i tumorigenesis. I denne studien har vi fokusert på effekten av MIR-218 på GC metastase og vist at MIR-218 fungerer som en tumor suppressor i GC metastaser. Restaurering av MIR-218 redusert celle migrasjon og invasjon in vitro Hotell og metastase in vivo
. For å oppnå stabile cellelinjer som over uttrykte MIR-218, transfektert vi MKN28-M-celler med MIR-218 plasmider og filtrert av G418. Vi valgte tolv cellekolonier i MIR-218-transfektert gruppe og fant 10 av 12 kolonier utstilt bemerkelsesverdig ensartet, stabil og høyt nivå uttrykk for MIR-218. Videre tre tilfeldig valgte monoklonale cellelinjer utstilt tilsvarende reduksjon i invasiv ablility. Imidlertid plasmid transfeksjon strategier ofte resultere i lavere integrasjon effektivitet sammenlignet med viral ekspresjon som fører til muligheten for stokastiske utvalg av sjeldne funksjonelt heterogene varianter fra den første hovedpopulasjon. Derfor fremtidig bruk av virus ekspresjonssystemer skal skape et mer objektivt utgangspunkt befolkningen til å teste vår hypotese.

Som en del av vår forskning på hvordan tapet av MIR-218 påvirker GC metastaser, vi viste at Robo1 var en kritisk nedstrøms mål av MIR-218. Det er kjent at Robo er et axon veiledning reseptor for Slit og er bevart i dyr som spenner fra frukt fluer til pattedyr. Hos pattedyr har tre Slit (Slit1-3) og fire Robo (Robo1-4) gener blitt beskrevet [56], [57]. De Slit-Robo interaksjoner formidle signaler medier frastøtende signaler om axoner og vekst kjegler under neural utvikling og delta i T-celle og monocytter kjemotaksien [58] - [64]. Som for andre utviklingsveier, avvikende ekspresjon av slissen -
Robo gener er blitt observert i en rekke forskjellige tumortyper [65] - [68]. For eksempel, i bryst karsinom vevsprøver, Robo1 har vist seg å være over-uttrykt, og det har vist seg å indusere migrering av brystkreftcellelinjer [37]. Slit2-Robo1 signale letter gliom cellevandring [36] og er involvert i angiogenese ved å øke microvessel tetthet og tumormassen i en tumor xenograft modell [30]. Wang et al.
Vist at overekspresjon av Robo1 i nye blodkar i tumorer induserer kreft neovaskularisering og vekst via en interaksjon mellom Robo1 og dens ligand, Slit2. De har også identifisert phosphoinositide-3-kinase (PI-3K) som en nedstrøms effektor av Slit2 /Robo1 signalering. Dette tyder på at det eksisterer en Slit-Robo1-PI-3K kaskade som kan føre til dannelse av phosphoinositol-3,4,5-trifosfat og den påfølgende aktivering av små GTPases som formidler celle bevegelse og ombygging av aktin cytoskjelettet [30] , [35]. I motsetning til dette har andre studier hevdet at nedregulering av Robo1 forårsaket av slettinger eller epigenetiske modifikasjoner kan spille en rolle i tumorprogresjon [69] - [73]. Vi foreslår at en vev-spesifikke uttrykk mønster finnes for de Slit-Robo gener.

I denne studien fant vi at Robo1 ble ofte uttrykt ved høye nivåer i invasive celler og på lave nivåer i ikke-invasive celler , mens MIR-218 vises det motsatte uttrykk mønster. Når vi transfektert Mir-218-ekspresjonsvektor og hemmer oligonukleotider inn MKN28-M og MKN28-NM celler henholdsvis ble det observert en invers uttrykk mønster mellom MIR-218 og Robo1, det vil si hvis MIR-218 uttrykk var høy, Robo1 uttrykket var lav, og vice versa. Dette resultatet ble ytterligere bekreftet i kliniske prøver og i luciferase-aktivitetsanalyser. Vi har også lagt merke til at induksjon av uttrykk for Robo1 av Robo1 mutant konstruere uten Mir-218 bindingssetet kunne reversere MIR-218-mediert hemming av tumorcelle invasjon. I kontrast, knockdown av Robo1 genuttrykk av RNAi hatt en effekt på å redusere tumorcelle invasjon lik som restaurering av MIR-218, selv om Robo1 knockdown alene viste en svak effekt. Dette kan være fordi Robo1 er ikke det eneste målet på MIR-218 som er relevant for metastase. Disse funnene tyder på at invasjonen undertrykkelse effekten av MIR-218 er i det minste delvis formidles gjennom en reduksjon i Robo1 uttrykk. Dette er også den første studie for å vise at de tumor-assosierte genet Robo1 er negativt regulert av MIR-218 via en bestemt målområde (nt 971-978) innenfor det 3'-UTR. Den Robo1 reseptoren er avgjørende for responsen til ekstracellulære signaler og cellulære fenotypiske endringer; Derfor kan tett regulering av Robo1 reseptoren ved MIR-218 lette mer robust signaltransduksjon. Anti-Robo1 monoklonalt antistoff har blitt rapportert å være en effektiv behandling for Robo1-uttrykkende kreftformer [30], [33]. I denne studien fant vi en ny hemmer av Robo1, MIR-218, som potensielt kan brukes til å behandle enkelte typer kreft.

Som nevnt ovenfor, Slit1, Slit2, og Slit3 omfatter Slit familien proteiner. Selv om genene overlapper hverandre, deres uttrykk mønstre og funksjoner er tydelig. De førstnevnte to proteiner er kjent å være involvert i akson veiledning og cellevandring [37], [74], mens Slit3 er involvert i utvikling av organer og organsystemer, deriblant membranen og nyre [75]. Etter avtale med disse dataene, fant vi at Slit2, men ikke Slit3, interaksjon med Robo1 å fremme GC invasjon.

I tillegg har vi vist at Mir-218 gener ble plassert i og transkribert sammen med Slit gener som var Robo1 ligander, og dermed skape en negativ feedback loop som regulerer Slit /Robo1 signalering. Sailen Barik viste at en intronic miRNA, MIR-338, forstummet gener som er funksjonelt antagonistisk til sin vert genprodukt, og dermed skape en positiv feedback loop som bistår i fysiologiske rollen til verten genet [76].

• PLoS ONE: Vaskulær CXCR4 uttrykk - en roman Antiangiogen Target i Gastric Cancer
• PLoS ONE: stanse av claudin-11 er assosiert med økt Invasivitet av magekreft Cells