PLOS ONE: MicroRNA-206: inibição eficaz de câncer gástrico progressão através do c-Met Pathway

Abstract

Os microRNAs são RNAs de nucleotídeos de cadeia curta endógenos que regulam a função do gene por ligação directa de mRNAs alvo. Neste estudo, nós investigamos os efeitos de microRNA-206 (miR-206) sobre o desenvolvimento de câncer gástrico. miR-206 foi confirmada primeiro a ser reprimidos em amostras de câncer gástrico. Por outro lado, a regulação positiva de c-Met foi confirmada em amostras de tecido de cancro gástrico humano, com o seu nível inversamente correlacionada com a expressão de miR-206. Introdução de miR-206 inibiu a proliferação celular através da indução de paragem em G1 do ciclo celular, bem como a migração e invasão. Além disso, importantes moléculas de proliferação e /ou migração relacionadas, tais como c-Met, CDK4, p-RB, P-Akt e ERK-P foram confirmados para ser regulada negativamente por análise de Western blot. Segmentação de c-Met também afetou diretamente a proliferação de células AGS, migração e invasão. In vivo
, miR-206 que expressam células tumorais também exibidos atraso de crescimento em comparação com as células tumorais não afetados. Os nossos resultados demonstraram que o miR-206 suprimiu a expressão de c-Met em cancro gástrico e poderia funcionar como um potente supressor do tumor em tumores que sobre-expressam c-Met. A inibição de miR-206 função poderia contribuir para a proliferação celular aberrante e migração, que conduz ao desenvolvimento do cancro gástrico

citação:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li L, et ai. (2015) MicroRNA-206: inibição eficaz de câncer gástrico Progressão através da via c-Met. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10.1371 /journal.pone.0128751

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 04 de fevereiro de 2015; Aceito: 01 de maio de 2015; Publicação: 17 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado, em parte, pela National Science Foundation Natural da China Grant 81100671 (DY), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation da China Grant Y2110609 ( DY), e Wenzhou Science & Tecnologia Bureau Grant Y20080096 (DY). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum ea segunda principal causa de morte relacionada com câncer em todo o mundo [1]. Sua morbidade e mortalidade é particularmente pronunciada em países asiáticos devido a uma variedade de influências [1]. Desde a sua apresentação é frequentemente associada com doença avançada, há uma necessidade urgente de avanços na sua detecção e, finalmente, a sua gestão. Actualmente, a compreensão dos microRNAs (miRNAs) em influenciar a formação de câncer gástrico está ocorrendo em um ritmo rápido.

Desde a primeira descrição de miRNA no nematóide C
. elegans
em 1993, o impacto destes pequenos RNAs não-codificantes transcendeu vários ramos da biologia molecular [2]. Os miRNAs são altamente tecido específico biomarcadores com potencial para alterar e transformar o tecido residente. Uma vez que a sobre-expressão e sob-expressão têm ambos sido associados com tumorigénese [3], os seus papéis como oncogenes e genes supressores de tumores são ambos bem estabelecido [4, 5]. Ao longo dos últimos anos, o seu impacto no desenvolvimento e na detecção de tumores de órgãos sólidos, incluindo câncer gástrico está lentamente a ser elucidado. Já existem vários miARNs identificados no mecanismo anti-apoptótica do cancro gástrico, tais como o miR-21 e miR-148a [6, 7]. Outras vias influenciados por miARNs incluem a progressão do ciclo celular que compreende de miR-222/221, o miR-106/93/25 e miR-24 [6, 7].

Um dos outros novos e promissores para miARNs órgão sólido tumores inclui o miR-206 [8]. Este miARN em particular pertence a um grupo de "myomiRs" que está envolvido no desenvolvimento do músculo esquelético [9]. Tendo sido associado com várias outras doenças, incluindo doença cardíaca, doença pulmonar obstrutiva crônica e doença de Alzheimer, o seu papel na oncogênese recebeu escrutínio, mais recentemente, incluindo rabdomiossarcoma, cancro do pulmão, cancro colo-rectal, schwannoma, e câncer gástrico [8, 9]. Embora elevados em alguns tipos de cancro do ovário e incluindo macroglobulinemia de Waldenstrom, miR-206 é suprimido principalmente tumores em órgãos sólidos [9]. miR-206 foi anteriormente mostrado para inibir a proliferação do cancro gástrico, em parte, através da supressão de ciclina D2 [10]. Nesta investigação, nós nos concentramos sobre o papel do miR-206 na oncogênese câncer gástrico através da via c-Met, que tem sido tradicionalmente uma via de sinalização influente para oncogênese em uma variedade de tumores [11]. c-Met tem sido previsto e mostraram ser o gene alvo de vários miARNs incluindo o miR-206 [9, 12].

Resultados

Supressão de miR-206 conduziu a um aumento de c-Met expressão em cancro gástrico

análise em tempo real de RT-PCR foi realizada para detectar a expressão de miR-206 em 40 espécimes de cancro gástrico e tecidos normais. níveis de miR-206 na maioria das amostras de tecido de tumor gástrico (34/40) foram encontrados como sendo significativamente mais baixo do que os tecidos normais (Fig 1A). expressão de miR-206 foi inversamente relacionada com o nível de c-Met observada em amostras de tumores (Fig 1B). A maioria das amostras de tumor, com diminuição da expressão de miR-206, mostraram elevada percentagem (> 50%) de coloração de c-Met. Por outro lado, os tumores com expressão normal de miR-206 mostrou expressão de c-Met muito fraco ou negativo.

miR-206 induzida prisão G1 e proliferação celular inibido, migração e invasão das células cancerosas gástricas AGS

Como expressão de miR-206 foi diminuída em amostras de câncer gástrico, procurou-se determinar se a introdução de miR-206 teve qualquer efeito biológico em células AGS. AGS células transfectadas com a molécula de miR-206 apresentaram inibição do crescimento das células, em comparação com o controlo negativo com base no ensaio de MTS (Fig 2A). A análise FACS das células apresentaram paragem do ciclo celular G1 (Fig S1). O número de colónias foi também reduzida com a transfecção de miR-206 (Fig S2).

miR-206 pode inibir a migração e a invasão de células de AGS (Figura 2B e Figura S3). Observou-se uma redução drástica da migração para as câmaras inferiores no miR-206 células AGS transfectadas (86 ± 15 vs 165 ± 16 nas células AGS, P Art < 0,01, n = 3). Além disso, as células transfectadas com o miR-206 mostrou que a invasividade induzida por HGF foi também significativamente dificultada seguinte miR-206 de transfecção (57 ± 12 vs 116 ± 14 em células AGS, P
< 0,01, n = 3).

miR-206 subregulado expressão de c-Met e proteínas relacionadas com o ciclo outra célula

Temos anteriormente identificados c-Met como um alvo direto de miR-206 [9]. A análise Western blot confirmou que a expressão de c-Met foi reduzida pela transfecção de miR-206 em células de AGS (Figura 3). Ao mesmo tempo, ectópica miR-206 também regulada a expressão de CDK4, p-Rb, p-Akt e p-ERK.

regulação negativa do c-Met inibiu a proliferação de células de câncer gástrico, migração e invasão
siRNA específica

em seguida, c-Met foi primeiro utilizada para diminuir a expressão de c-Met em células de AGS (Figura S4). Os ensaios de MTS foram realizados para detectar a proliferação de células. AGS células transfectadas com c-Met siARN mostraram uma redução de crescimento de células, em comparação com células de controlo negativo (Figura 4A; diminuição 25,10 ± 3,81%). Tanto a migração induzida por HGF e invasão diminuíram quando comparando com c-Met siARN células transfectadas para células de controlo transfectadas negativos. Tal como indicado na figura 4B e S5 Fig, diminuir em migração (88 ± 10 vs 155 ± 15, P < 0,01, n = 3) e invasão (72 ± 7 vs 126 ± 12, P < 0,01, n = 3) foram estatisticamente significativos.

crescimento do tumor Introdução de miR-206 suprimida in vivo

a seguir, investigou se a sobre-expressão de miR-206 pode reprimir o crescimento do tumor in vivo
. Após 8 semanas, os volumes tumorais médios foram significativamente menores a partir de células infectadas com lentivírus que expressam miR-206, em comparação com o controle (Fig 5).

Discussão

O câncer gástrico manteve-se um significativo para a saúde cuidar carga em todo o mundo, apesar de anos de pesquisa [1]. Segundo a OMS, o câncer gástrico continua sendo uma das principais etiologias de câncer com uma alta taxa de mortalidade [1]. Tal como acontece com outros tumores de órgãos sólidos, é cada vez mais claro que a melhor compreensão da oncogênese tumor é necessário melhorar o prognóstico desses pacientes. Sendo prevalente em países asiáticos, os dados estão emergindo sobre o papel dos miRNAs no desenvolvimento ou supressão de cancros gástricos [6].

miRNAs têm funções duplas em termos de desenvolvimento de câncer gástrico [6, 13]. Alguns miARNs são supressores de tumores e outros são oncomiRs [6]. Ueda et al. Encontrámos 22 miRNAs regulados positivamente e 13 reprimidos no plasma de pacientes com câncer gástrico [13]. Alvos que estão sob investigação no caso do câncer gástrico incluem reguladores de p16, através de miR-24 e p21 através de miR-222/221 e miR-106b /93/25 [6]. Outros, tais como o miR-21, pode ser regulada positivamente em até 92% das amostras de tecido de cancro gástrico [14]. Os candidatos identificados no câncer gástrico servir como supressores tumorais incluem miR-181b, miR-101 e miR-486 [6]. Por exemplo, o miR-101 é pensado para segmentar EZH2, Cox-2, Mcl-1 e Fos [15]. miR-486 é pensado para afetar OLFM4, possivelmente afetando a apoptose a jusante [16].

Tendo estabelecido que a maioria dos miRNAs servir como supressores de tumor, foi investigada a via c-Met no cancro gástrico. Ao estudar a via c-Met para rhadbomyosarcoma, encontramos a importância desta via no sarcoma [9]. c-Met é conhecida por estar desregulado no cancro gástrico [11, 17-19]. O proto-oncogene MET codifica uma proteína conhecida como receptor do factor de crescimento de hepatócitos (HGF), que possui actividade de tirosina-quinase [18]. Nós normalmente achamos que expressa apenas em células-tronco, mas também têm visto a sua desregulação na oncogênese [18]. Neste estudo, nós fomos capazes de confirmar que c-Met está significativamente envolvida no câncer gástrico e do seu papel como um alvo miR-206 é fundamental na oncogênese.

progressão do ciclo celular é desregulada no câncer gástrico. Com base em relatórios anteriores, ciclina D2 é elevada no câncer gástrico, quando miR-206 é afetado [10]. miR-206 foi mostrada para ser um marcador de prognóstico potente [10]. Sua regulação baixa está associada com sobrevida global mais curto. Restauração do miR-206 conduz a paragem do ciclo celular G0 /G1, confirmando o seu papel como supressor de tumor. Nosso trabalho também mostrou desregulação do ciclo celular com CDK4 e fosforilada-Rb sendo afetado. CDK4 é um membro da família da ciclina quinase dependente com actividade Ser /Thr proteína-quinase. Isso leva a progressão fase G1. Além disso, a quinase conduz à fosforilação de Rb, que é um supressor de tumores envolvidos na progressão do ciclo celular.

Embora resultados semelhantes foram confirmados em gástrico, cancros do ovário e da mama, o papel de miR-206 parece para ter um efeito oposto no cancro do cólon [6, 20]. Uma correlação inversa foi observada entre miR-206 e KLF4 em um painel de cancros do cólon humanos [20]. KLF4, que possui propriedades oncogénicas em outros cancros, tais como cancro da mama, pele e pulmão, funciona como um supressor tumoral no cancro do cólon [20]. O seu promotor é hiper-metilado com níveis elevados de miR-206 que conduzem para a regulação negativa de KLF4 [20]. Estes resultados indicam que o miR-206 pode não funcionar de forma semelhante em todas as células epiteliais, que nega a one size fits all abordagem em quimioterápicos.

No presente estudo, identificamos um mecanismo para a regulação da expressão do gene c-Met através de miR-206 em câncer gástrico. c-Met sobre-expressão seguinte miR-206 downregulation parece ser a etiologia comum para a patogénese do cancro gástrico na maioria das amostras examinadas neste estudo. Em resumo, demonstrámos que o miR-206 modula negativamente a via de sinalização de c-Met envolvidos na proliferação e migração celular. Nossos estudos venha a ter consequências clínicas importantes no tratamento do câncer gástrico. miR-206 é um candidato para tanto a detecção imuno-histoquímica de tumores pequenos e possível alvo para terapias biológicas.

Materiais e Métodos

cultura celular

A linha de células de cancro humano gástrico, AGS, adquiridas a partir de ATCC (Manassas, VA), foi cultivada em meio (Invitrogen, Carlsbad, CA) de Ham F-12 suplementado com 10% de soro fetal de bovino. (FBS; Hyclone, Logan, UT)

Ética declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações e aprovação do Comitê animal Care e Use Wenzhou Medical University (número de autorização: WZMCOPT-043011). Quarenta amostras tumorais gástricas e tecidos gástricos doadores normais foram obtidos a partir do segundo hospital afiliada de Wenzhou Medical University (Wenzhou, China). coleta de amostras foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Wenzhou em pesquisa envolvendo seres humanos, e consentimento informado por escrito foi obtido de cada caso. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki e as leis nacionais.

RT-PCR quantitativo

O RNA total foi extraído de amostras de tumor gástrico humano e controles normais com o reagente Trizol (Invitrogen). 10 ng de ARN total foram usadas para a síntese de ADNc por TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), e o nível de expressão de miR-206 foi quantificada pelo ensaio Taqman MicroRNA (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR foi realizada utilizando o Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

coloração imuno-histoquímica de c-Met

Seções do fixado em formalina parafina-embedded espécimes de tumor gástrico humano (5 uM) foram feitas e em seguida des-parafinado com xileno e etanol. As lâminas foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 0,3% e depois incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo de c-Met em 1: 300 de diluição (CST, Beverly, MA). coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando o sistema de detecção EnVision HRP /DAB (Dako, Glostrup, Dinamarca).

proliferação celular ensaio

AGS células foram plaqueadas a 2000 células por poço em placas de 96 poços ( Costar, High Wycombe, Reino Unido) para cada transfecção. As transfecções foram realizadas com o reagente (Lipofectamina RNAiMAX; Invitrogen), em triplicado. Para cada poço, foi empregue 50 nm miR-206 imita molécula (Ambion, Austin, TX), ou um controlo negativo de transfecção (Ambion). Após 72 horas de cultura, a proliferação celular foi avaliada por ensaio de MTS (CellTiter 96 aquoso; Promega, Madison, WI).

ensaios de migração Transwell

24 horas após a transfecção, as células foram colhidas por AGS tripsinização e lavadas uma vez com solução D-Hanks (Invitrogen). Para medir a migração de células ou invasão, 8 mícrons cultura tamanho de poro ou inserções Transwell (Matrigel; Costar) foram colocadas nos poços de placas de cultura de 24 poços. Na câmara inferior, 400 mL de F-12 contendo 10% de FBS e 20 ng /mL de HGF foram adicionados. Em seguida, células 5x10 ^{4 foram adicionadas à câmara superior. Após 20 horas de incubação, as células que tinham migrado através dos poros foram coradas com violeta de cristal e observada sob o microscópio (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) utilizando uma objectiva de 20X.}

análise de Western blot

células AGS (1x10 ^{5) foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas em F-12 durante 24 horas antes da transfecção. 72 horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS frio e submetido a um tampão de lise (35 mM de Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /L de sulfato de dodecilo e sódio [SDS], ditiotreitol 100 mM). os lisados ​​de proteína (20 ug cada) foram separados usando electroforese em gel de 8% SDS-poliacrilamida, seguida de electro-transferidas para membranas de filtro de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com um tampão contendo 5% de leite desnatado em PBS com 0,05% de Tween-20 durante 2 horas e incubou-se durante a noite com o anticorpo, a 4 ° C. Após uma segunda lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween-20, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Millipore, Darmstadt, Germany) e desenvolvido com um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Pierce, Rockford, IL). GAPDH foi usada como um controlo de carga. Anticorpos para CDK4, p-Rb, ERK, Akt, ERK-P, P-Akt, c-Met e GAPDH foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA).}

ensaios de siRNA

c-Met-specific siRNA (Ambion) e controlo negativo de siRNA (Ambion) foi utilizado para regular negativamente a expressão de c-Met em células AGS. 50 nM de c-Met-específico ou siRNA controlo negativo siARN foi transfectado em células AGS com Lipofectamina RNAiMAX. ensaio MTS foi realizado 72 horas após a transfecção, enquanto que os ensaios Transwell e Matrigel foram realizadas 24 horas após a transfecção, como descrito acima.

in vivo o crescimento tumoral
ensaio

A expressão pré-microRNA constrói pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vetor de controle lenti-miR-206 e foram adquiridos de Sistema de Biociências (mountain View, CA). células AGS foram infectadas com lentivírus que expressam miR-206 ou negativo controle. ratinhos nus do sexo feminino, de 6 semanas de idade, foram inoculados com células AGS (8x10 ^{6) que expressa o miR-206 ou os controlos negativos nos seus flancos, e depois sacrificados ao fim de 8 semanas. O tamanho do tumor foi medido e o volume foi calculado utilizando a fórmula: ( L
x W
2) x 0,5, ( L
, comprimento; W
, largura), de acordo com o método relatado anteriormente [21]. Todos os estudos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use a Wenzhou Medical University.}

A análise estatística

Todos os dados foram apresentados como a média ± SEM. Os resultados apresentados são expressos como o valor médio ± SEM dos resultados obtidos a partir de triplicados em um experimento. Os resultados representam os obtidos em três experiências separadas. As diferenças entre grupos experimentais e os grupos de controle foram analisados ​​por meio de Student t
-teste. A significância estatística foi aceite na P Art < 0,05.

Informações de Apoio
S1 Fig. A análise FACS das células transfectadas com AGS células AGS
miR-206. foram recolhidas 48 horas após a transfecção com o miR-206 ou NF, coradas com iodeto de propidio, e analisados ​​por citometria de fluxo. Dez mil células foram avaliadas em cada amostra. Os resultados mais representativos em três experimentos independentes são retratados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s001
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S2 Fig. A formação de colónias ensaio.
células AGS transfectadas com miR-206 ou NC foram semeadas a baixa densidade. Após 7 dias, a formação de colónias foi determinada por coloração com violeta de cristal. Os resultados típicos em três experimentos independentes são mostrados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s002
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S3 Fig. Os efeitos de miR-206 em células AGS foram avaliadas com ensaios Transwell e Matrigel.
O número de células que migraram através dos poros cultura de inserção (para cima) ou tinham invadido através dos poros de inserção de Matrigel (para baixo) foi fotografada utilizando um 20X objetiva do microscópio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s003
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S4 Fig. . Downregulation de c-Met por siARN
análise de Western blot foi realizada para confirmar a supressão da expressão de c-Met após a transfecção de células de lipofectamina AGS quer com c-Met siRNA ou um controlo negativo (NC): doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s004
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S5 Fig. Os efeitos de c-Met em células de siRNA AGS foram avaliadas com ensaios Transwell e Matrigel.
O número de células que migraram através dos poros cultura de inserção (para cima) ou tinham invadido através dos poros de inserção de Matrigel (para baixo) foi fotografada usando uma objetiva de microscópio 20X
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s005
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