PLOS ONE: A interacção Efeitos de pri-let-7a-1 rs10739971 com PGC e ERCC6 Gene Polimorfismos em câncer gástrico e atrófica Gastritis

Abstract

Fundo

O objetivo deste estudo foi para investigar os efeitos de interação de pri permitem-7A-1-rs10739971 com pepsinogen C
( PGC
) e reparo de excisão cruz grupo complementando 6
( ERCC6
) polimorfismos do gene e sua associação com os riscos de câncer gástrico e gastrite atrófica. Esperávamos para identificar miRNA polimorfismo ou uma combinação de vários polimorfismos que poderiam servir como biomarcadores para prever o risco de câncer gástrico e suas doenças pré-cancerosas.

Métodos

método plataforma Sequenom MassARRAY foi utilizado para detectar polimorfismos de pri-let-7a-1 rs10739971 G → A, PGC
rs4711690 C → G, PGC
rs6458238 G → A, PGC
rs9471643 G → C, e ERCC6
rs1917799 em 471 pacientes com câncer gástrico, 645 pacientes com gastrite atrófica e 717 controles.

resultados

Um efeito interação de pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 com ERCC6
polimorfismo rs1917799 foi observado para o risco de câncer gástrico ( P
_{interação = 0,026); e efeitos de interação de pri-let-7 ° 1 rs10739971 polimorfismo com PGC
rs6458238 polimorfismo ( P
interação = 0,012) e PGC
rs9471643 polimorfismo ( P
interação = 0,039) foram observadas para o risco de gastrite atrófica.}

Conclusão

a combinação de pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 e ERCC6
e PGC
polimorfismos poderia fornecer um potencial de previsão maior do que um único polimorfismo por conta própria. Estudos em larga escala e pesquisas mecanismo molecular são necessários para confirmar nossas descobertas

Citation:. Xu Q, Liu J-w, Ele C-y, Sun L-p, Gong Y-h, Jing J-j, et al. (2014) A interacção Efeitos de pri permitem-7A-1-rs10739971 com PGC
e ERCC6
Gene Polimorfismos em câncer gástrico e Gastrite atrófica. PLoS ONE 9 (2): e89203. doi: 10.1371 /journal.pone.0089203

editor: Xiaoping Miao, MOE chave do Laboratório de Ambiente e Saúde, Escola de Saúde Pública, Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia, China

Recebido: 20 de novembro de 2013; Aceito: 16 de janeiro de 2014; Publicação: 25 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Key Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa REF. 2010CB529304), a National Science Foundation Natural da China (Ref No. 31200968), e do Projeto Ciência Tecnologia na província de Liaoning (Ref No. 2011225002) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os indivíduos com hábitos de vida semelhantes e que vivem em ambientes similares possuem diferentes riscos de câncer. Identificar e prever os indivíduos com alto risco de desenvolver câncer pode indicar a necessidade de mudança de hábitos de vida. polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) desempenham um papel crucial na previsão de indivíduos com maior risco de câncer. Nos últimos anos, foram relatados polimorfismos de pri-miARN ser biomarcadores para risco de cancro prever, como pri-miR-34b /c rs4938723 polimorfismo [1], pri-miR-218 polimorfismo rs11134527 [2] e pri-miR-938 polimorfismo rs2505901 [3]. Estudos descobriram que o número de polimorfismos de um único gene foi associado com o risco de cancro gástrico [4]. No entanto, o cancro gástrico é uma doença complexa, de múltiplos passos com muitos genes envolvidos, e SNPs individuais têm capacidade limitada para prever o risco de cancro gástrico [5] - [7]. Diversos estudos relataram que as interacções do gene de gene são mais importantes do que o efeito principal de um único gene em doenças complexas, tais como cancros [7] - [9]. A abordagem de pesquisa básica para interações gene-gene é investigar a combinação de duas ou mais polimorfismos com menor ou nenhum efeito de anteriores estudos SNP individuais [10], [11]. No entanto, a maioria dos estudos anteriores têm-se centrado sobre o papel preditivo de um único SNP gene e esquecido a aplicação potencial de interações gene-gene.

Actualmente, os investigadores centram-se principalmente no gene interações SNP-SNP, que pode causar em proteínas interações proteína e poucos estudos têm investigado as interações entre polimorfismos de miRNA e polimorfismos do gene, que podem causar interações RNA-proteína. miRNA tem sido relatada a participar da rede multi-gene de carcinogênese gástrica [12]. O mesmo miARN foi relatado para regular várias proteínas alvo, e as mesmas proteínas podem ser moduladas por vários miARN [13]. Como resultado, os efeitos de miRNA e genes formada uma rede.

O nosso estudo de associação do gene candidato anterior investigou a associação de pepsinogen C
( PGC
) e reparo de excisão cruz grupo complementando 6
( ERCC6
) com o risco de câncer gástrico, e descobriu que PGC
rs4711690 do gene C → G, rs6458238 G → a e rs9471643 G → polimorfismos C teve efeitos protetores contra gastrite atrófica [4]. PGC teve efeitos protetores sobre o estômago normal e mostraram baixa expressão no câncer gástrico, e a perda da proteção foi associada com a ocorrência de câncer gástrico [14]. ERCC6 é um membro da família de reparação de ADN que participam na reparação de danos no ADN em carcinogénese [15]. ERCC6
rs1917799 T > G polimorfismo na região promotora foi associado com aumento do risco de câncer gástrico em uma população chinesa [16]. Deixe-7a é um supressor de tumor, e estudos recentes descobriram que a função de madura let-7a está intimamente relacionado com a incidência e desenvolvimento de cancro gástrico, e a diminuição da expressão de let-7a está associado com o comportamento biológico maligno [17], [ ,,,0],18]. No entanto, variantes genéticas deixá-7A não foram examinadas por suas associações e os riscos de câncer gástrico. Rs10739971 é um SNP localizado -559 bp a montante do let-7a-1, que pode ser uma região promotora da let-7a-1. No banco de dados HapMap, a frequência mínima alelo de rs10739971 é ≥5% em ambos os europeus e asiáticos. Mas se existe uma associação entre rs10739971 e risco de doença, e as interações entre rs10739971 e outros polimorfismos, permanecem desconhecidos. Nossa hipótese é que as variantes acima mencionadas podem ser candidatos ideais para investigar possíveis interacções SNP-SNP em dois ou mais loci que contribuem para a etiologia do câncer gástrico.

Neste estudo caso-controle utilizando uma população chinesa, foi investigada a associação de pri-let-7a-1 rs10739971 com risco de câncer gástrico, e os efeitos de interação de miRNA-let-7-1-polimorfismo rs10739971 e PGC
e ERCC6
polimorfismos em amostras do mesmo grupo, e discutir as suas perspectivas de aplicação em câncer gástrico e suas doenças pré-cancerosas. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a tentar avaliar potenciais interações SNP-SNP de miRNA SNPs e SNPs de genes em dois ou mais loci implicados na suscetibilidade ao câncer gástrico. Esperávamos encontrar combinações de polimorfismos do gene-gene que poderiam predizer o risco de câncer de estômago e suas doenças pré-cancerosas, e fornecer evidência experimental para o diagnóstico precoce do câncer gástrico.

Métodos

Os pacientes

neste estudo, um total de 1834 indivíduos, que incluiu 471 pacientes com câncer gástrico, 646 pacientes com gastrite atrófica e 717 controles, foram retrospectivamente recrutados a partir de pacientes submetidos a triagem exame gastroscopia na região Zhuanghe e os pacientes que se submeteram a exame de endoscopia digestiva ou cirurgia gástrica no primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica da China, província de Liaoning, China, entre 2002 e 2011. sangue venoso em jejum foi coletada e todos os participantes inscritos foram diagnosticados com base em sua gastroscópico e exames histopatológicos. O câncer gástrico foi diagnosticada com base em critérios da OMS, e gastrite e superficiais gastrite atrófica foram classificados pela classificação de Sydney. controles elegíveis foram os participantes com um estômago normal ou gastrite acordo com gastroscópico e patológicos exames e não tinha outras doenças.

O projeto do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Seres Humanos da China Medical University (Shenyang, China ). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. histórias médicas (incluindo idade, sexo, tabagismo e consumo de álcool) foram obtidos por questionário e os registros foram informatizadas. Cada pessoa envolvida no estudo forneceu consentimento informado por escrito para a investigação epidemiológica. características dos participantes detalhadas encontram-se resumidos na Tabela 1.

ADN genómico extraído

O ADN genómico foi extraído utilizando um método descrito anteriormente, com ligeiras modificações [19]. Em resumo, um coágulo congelado (500 mL) foi adicionado a 800 ul de tampão TE (triethanolamide), misturou-se bem e centrifugou-se a 10000 × g
durante 5 minutos para dispersar bem o coágulo. Após interrupção do coágulo, 400 uL de TE, 25 uL de SDS a 10% e 5 mL de 20 mg /ml foram adicionados proteinase K e incubou-se a 37 ° C durante a noite. O sobrenadante foi extraído e adicionou-se um volume igual de fenol. O tubo foi colocado num agitador rotativo durante 15 min e em seguida centrifugou-se a 10000 × g
durante 15 min. O sobrenadante foi removido e uma segunda extracção foi realizada com a adição de um volume igual de uma mistura de fenol e clorofórmio (1:01). A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi removido e uma terceira extracção foi realizada com a adição de um volume igual de clorofórmio. A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi absorvida e foram adicionados dois volumes de solução de precipitação de proteína (dois volumes de etanol absoluto contendo 10% de 3 mol /L-acetato de sódio) e incubou-se durante 2 h a -20 ° C. Cada amostra foi centrifugada a 10000 × g
durante 10 min. Após centrifugação, o sedimento de DNA resultante foi lavado com etanol a 75% e centrifugou-se a 10000 × g
durante 10 min. O etanol 75% foi decantado e o tubo invertido sobre papel absorvente limpo durante 30 min. O DNA resultante foi reconstituído em tampão TE e guardado a -20 ° C até à sua utilização.

genotipagem de SNP

As amostras de ADN foram diluídas para concentrações de trabalho de 50 ng /uL antes da genotipagem. Os ensaios, desenho de primers, e genotipagem de 29 locais de polimorfismo selecionados para um estudo gene candidato associado foram todos realizados por CapitalBio (Pequim, China) usando a plataforma Sequenom MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA, EUA), entre maio de 2011 e dezembro 2011 com base em indicações do fabricante [4], [20]. Cinco dos 29 polimorfismos foram ainda seleccionados para análise da interação no presente estudo. Para avaliar a qualidade da genotipagem, 5% das amostras repetidas foram genotipados e os resultados foram 100% consistente.

A detecção de H. pylori em soro

Os testes sorológicos para H. pylori
foram realizados para verificar o status de H. pylori
infecção utilizando ELISA ( H. pylori
IgG kit ELISA, BIOHIT Plc, Helsínquia, Finlândia), como descrito anteriormente [21]. Positivo foi julgado como o título de H. pylori
IgG maior que 34EIU (o valor de cut-off determinado pelo protocolo). Resumidamente, as amostras de soro foram diluídas 1:200 (5 mL + 995 ul) com tampão de diluição e misturou-se bem. Em seguida, 100 ul de solução em branco, calibradores, controles e amostras diluídas foram adicionados aos poços. A placa foi coberta com a tampa de incubação e incubados durante 30 min a 37 ° C. Após a incubação, os poços foram lavados cinco vezes com 350 ul de (1:100) tampão de lavagem e diluiu-se a placa suavemente aproveitado várias vezes em papel de filtro. Em seguida, 100 ul de solução de conjugado misturado foi adicionado aos poços e incubou-se durante 30 min a 37 ° C. Após a incubação, os poços foram lavados novamente e 100 ul de solução de substrato misto foi adicionada aos poços antes da incubação durante 30 min à temperatura ambiente (20-25 ° C) em um ambiente escuro. Por último, foram adicionados 100 mL de solução de paragem mista e a absorvância foi lida a 450 nm dentro de 30 min.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 16.0 (SPSS, Chicago , IL, EUA). χ de Pearson ^{2 testes foram utilizados para avaliar as diferenças entre os sexos em grupos de estudo e controle. ANOVA foi realizada para avaliar as diferenças entre as idades nos diferentes grupos. testes da razão de verossimilhança foram realizados para avaliar os efeitos de interação sobre o risco de câncer gástrico, comparando o modelo que só envolveu os principais efeitos e o modelo completo que também continha o termo de interação. A P
-valor. ≪ 0,05 para todos os testes de dois lados era considerada estatisticamente significativa
analisa}

Resultados

efeito principal de polimorfismos individuais

em nosso estudo anterior, verificou-se que pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 foi significativamente associada com maior risco de gastrite atrófica (OR = 2,59, P
= 0,018) na população estudada menor, mas nenhuma associação significativa foi encontrada em mais do estudo de validação de uma população maior (dados não publicados); PG C
rs4711690, rs6458238, e polimorfismos rs9471643 foram significativamente associados com aumento do risco de gastrite atrófica ( P
= 0,093, OR = 0,75; P
= 0,015, OR = 0,73; P
= 0,033, OR = 0,69, respectivamente) [4]; ERCC6
polimorfismo rs1917799 foi significativamente associada com o aumento do risco de câncer gástrico (OR = 1,38, P
= 0,035) [20].

A interacção nos dois sentidos da pri rs10739971 -let-7A-1 e PGC, polimorfismos ERCC6 no risco de câncer gástrico /atrófica gastrite

Para investigar se os polimorfismos de genes e polimorfismos miRNA teve um efeito de interação, foram analisadas as interações entre miRNA polimorfismo e cada polimorfismo do gene . Descobrimos que o polimorfismo miRNA e PGC
e ERCC6
polimorfismos mostrou uma forte associação estatística com câncer gástrico ou gastrite atrófica. Assim, analisamos o efeito da interação de deixá-7a-1-pri polimorfismo rs10739971 e PGC
e ERCC6
polimorfismos, e suas associações, com os riscos de câncer gástrico e gastrite atrófica. Os resultados indicaram que pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 e ERCC6
polimorfismo rs1917799 tiveram efeitos de interação para o risco de câncer gástrico ( P
_{interação = 0,026, Tabela 2). Este par SNP mostrou aumento do risco de câncer gástrico (OR IC = 2,59, 95% = 1,12-5,97). Pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 e PGC
rs65458238 e rs9471643 polimorfismos teve efeitos de interação para o risco de gastrite atrófica ( P
interação = 0,012 e 0,039, respectivamente, Tabela 3). Para o polimorfismo rs65458238, o par de SNP apresentaram aumento de risco de gastrite atrófica (OR = 2,77, IC 95% = 1,25-6,13); enquanto o outro par SNP apresentaram diminuição do risco de gastrite atrófica (OR = 0,52, 95% CI = 0,28-0,97) para o rs9471643 (Tabela 3).}

interações SNP-SNP envolvendo múltiplos SNPs utilizando regressão logística

Além disso, investigamos a interação SNP-SNP envolvendo três SNPs positivos (pri-let-7A-1 rs10739971- PGC
rs6458238- PGC
rs9471643) eo resultado foi estatisticamente significativa ( P
_{interação = 0,001, Tabela 4). A combinação SNP mostrou aumento do risco de gastrite atrófica (OR = 23,55, IC 95% = 3,73-148,71).}

Discussão

Os polimorfismos de genes ou miRNA pode servir como potenciais biomarcadores para prever risco de doença . Estudos anteriores têm-se centrado principalmente na associação de um único polimorfismo do gene com risco de doença, eo risco era frequentemente do efeito fraco (OR < 1,5). Tal como para a combinação de duas ou mais interacções SNP-SNP, o risco era muitas vezes moderada de (OR≥1.5) ou forte efeito (OR≥2) [4], [10], [22] - [24]. O presente estudo, pela primeira vez, investigou os efeitos de interação de polimorfismo miRNA e PGC
e ERCC6
polimorfismos em uma população chinesa do Norte. O estudo teve como objetivo fornecer evidência experimental para o diagnóstico precoce e mecanismos de câncer gástrico por encontrar combinações de polimorfismos do gene-gene que poderiam predizer o risco de câncer de estômago e suas doenças pré-cancerosas.

Entre os SNPs do nosso grupo investigado durante o nosso estudo de associação de genes candidatos, ERCC6
single-loco mostrou um efeito fraco para o risco de câncer gástrico (OR = 1,46) [16]; os três PGC
single-lócus demonstrou um efeito protetor fraco para o risco de gastrite atrófica (OR para rs4711690 = 0,75; OR para rs6458238 = 0,73; OR para rs9471643 = 0,69) [4]. Nós, portanto, a hipótese de que esses polimorfismos podem ser candidatos ideais para investigar possíveis interacções SNP-SNP em dois ou mais loci que contribuem para a etiologia do câncer gástrico. Realizamos a análise do efeito interação de miRNA polimorfismo e gene polimorfismos e encontrou três pares SNP-SNP associados a doenças, das quais a interação de um par (pri-deixá-7A-1 rs10739971- ERCC6
rs1917799) foi associado com o risco de câncer gástrico e as interações dos outros dois pares (pri-let-7A-1 rs10739971- PGC
rs65458238, e pri-let-7A-1 rs10739971- PGC
rs9471643) foram associados ao risco gastrite atrófica. ERCC6
polimorfismo rs1917799 e rs6458238
PGC e polimorfismos rs9471643 foram relatados anteriormente. Neste estudo, foram adicionalmente analisados ​​pri let-7a-1-rs10739971 polimorfismo no mesmo grupo. O par de polimorfismo rs10739971 pri-deixá-7a-1 e ERCC6
rs1917799 polimorfismo tiveram uma OR de sua interação de 2,59 para o risco de câncer gástrico, que foi maior do que os seus efeitos single-locus de individuais de 0,92 e 1,07, respectivamente. Da mesma forma, o par de pri-let-7 ° 1 polimorfismo rs10739971 e PGC
rs6458238 polimorfismo tiveram uma OR de sua interação de 2,77 para o risco de gastrite atrófica, que foi maior do que os seus efeitos single-locus de individuais de 0,74 e 1,23, respectivamente. O par de deixá-7a-1-pri polimorfismo rs10739971 e PGC
rs9471643 polimorfismo tiveram uma OR de sua interação de 0,52 para o risco de gastrite atrófica. Curiosamente, os seus efeitos de um único lócus individuais eram contrárias às conclusões acima, com OR de 1,65 e 1,06, respectivamente, o que merece a replicação ainda mais independente das nossas descobertas.

Porque polimorfismo pri-let-7a-1 rs10739971 demonstraram efeitos de interação com ambos PGC
SNPs sobre o risco de gastrite atrófica, que ainda realizada análise da interação dos três polimorfismos positivos. Os resultados mostraram que o OR para o risco de gastrite atrófica foi 23,55 ( P
= 0,001). Geralmente, um único locus tem um efeito fraco (OR < 1,5) em risco de doença, e a combinação de dois ou mais interacções SNP-SNP frequentemente demonstra uma moderada (OR≥1.5) ou um efeito forte (OR≥2). No presente estudo, o OR de pri-let-7a-1 único locus foi de 1,61; o para efeitos de interacção com ERCC6
e OR PGC
foram mais de 2; a combinação dos três loci positivo demonstrado um ou mesmo mais elevada de 23,55. Estes resultados indicaram as perspectivas de aplicação de uma combinação de duas ou mais SNPs como potenciais biomarcadores para prever risco de doença.

Investigando os efeitos de interação de polimorfismos de miRNA e polimorfismos do gene irá contribuir para a compreensão abrangente da rede gene ea papel de miARN no processo patogénico. Apreciação do interações SNP-SNP têm frequentemente mecanismos subjacentes ao invés de ser meramente resultados estatísticos [9]. Os três pares de SNPs indicou que miARN pode interagir com os genes na carcinogénese gástrica. PGC proteína tem um efeito protector no epitélio do estômago normais, e a sua expressão reduzida em um grupo gastrite atrófica, quando comparado com um grupo normal [14], [25]. O papel exato do PGC em gastrite atrófica ainda não está claro. ERCC6 está envolvido na via de reparação do ADN, e repetiu danos no ADN e reparação pode levar a carcinogénese células [15]. Com base nos resultados do presente estudo, é razoável sugerir que deixá-7a podem participar nos processos de PGC induzir gastrite atrófica e ERCC6 induzir câncer gástrico. De acordo com os resultados de software miRNA previsão alvo, havia possíveis locais de ligação de deixá-7a com 3'-UTR tanto para PGC
e ERCC6
. Se os efeitos de interação SNP-SNP observados neste estudo foram por causa da ligação de miRNA e seus genes-alvo ainda requer experiências funcionais adicionais.

Este estudo teve algumas limitações. Em primeiro lugar, embora o hotel teve um tamanho de amostra grande em relação de 471 pacientes de câncer gástrico, 645 pacientes com gastrite atrófica e 717 controles, este tamanho de amostra ainda podem ser inadequados para a detecção de efeitos de interação, especialmente para os alelos raros. Em segundo lugar, os mecanismos das interações SNP-SNP associados precisam ser esclarecidos, e as experiências funcionais posteriores são necessários. Em terceiro lugar, vários estudos de associação do genoma sugerem uma integração de dados de estudos de associação do genoma do câncer gástrico de populações chinesas; Portanto, os dados devem ser integrados, e podem ser utilizadas como locais de polimorfismo candidato a ser estudado no futuro. Em quarto lugar, a interação entre genes e ambiente para o risco de câncer gástrico é um fator importante a ser considerado, como fumar e beber. Neste estudo, foram coletados alguns dados sobre fumar e beber, mas permanece quase um terço dos dados em falta a partir das amostras. Interações entre genes e tabagismo e comportamento de beber no risco de câncer gástrico deve ser examinado.

Conclusão

Este estudo, pela primeira vez, relata que pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 e ERCC6
rs1917799 polimorfismo pode ter um efeito de interação sobre o risco de câncer gástrico; e pri-let-7a-1 polimorfismo rs10739971 pode ter um efeito de interação com o rs6458238
PGC e polimorfismos rs9471643 sobre o risco de gastrite atrófica. Alguns dados foram coletados fornecendo para a possível construção de uma via rede câncer gástrico. Futuro estudos em grande escala e experimentos mecanismo são necessários para confirmar os achados deste estudo.

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