Фон
<р> Несмотря на доказательства того, что активированные макрофаги действуют в воспалительной микросреды способствовать желудочный туморогенез посредством сигнализации β-катенина, эффекты передачи сигналов β-катенина на желудочную раковых клеток и метастазов взаимосвязь этих клеток с окружающими, ассоциированных с опухолью макрофаги непосредственно не изучены.
Методы
<р> Иммуногистохимическое окрашивание использовали для анализа 103 пациентов. Анализ вторжения был использован для оценки отношения между макрофагами и клеток рака желудка. -катенин усиления из-функции и с потерей функции подходов были выполнены. Для оценки механизма регулирования β-катенина в клетках рака желудка, Вестерн-блоттинга и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции были использованы.
Citation:. У MH, Ли WJ, Хуа KT, Kuo ML, Лин MT (2015) макрофагальная инфильтрация Индуцирует рака желудка инвазивности путем активации бета-катенина Pathway , PLoS ONE 10 (7): e0134122. DOI: 10.1371 /journal.pone.0134122
<р> Редактор: Фабрицио Маттеи, Istituto Superiore ди Санита, ИТАЛИЯ
<р> Поступило: 16 сентября 2014; Принято: 6 июля 2015 года; Опубликовано: 30 июля 2015
<р> Copyright: © 2015 Wu и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование:.. Эта работа была поддержана грантами от Национального научного совета Тайваня (NSC 98-2314-B-002-055-MY2)
<р> Конфликт интересов: авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных видов рака во всем мире, и почти две трети таких больных умирают от. их болезнь. [1] ГК тесно связана с <ЕМ> Helicobacter Pylori
инфекция, которая приводит к хроническому воспалению. [2] Это воспалительное микроокружение характеризуется наличием принимающих лейкоцитами с главным макрофагами в обоих опорной стромы и ткани опухоли. [3] Исследования показывают, что ассоциированные с опухолью воспалительные реакции, как местные, так и системные, являются важными независимыми факторами прогрессирования опухоли и метастазов. [4, 5] Тем не менее, связи между этими молекулярными посредниками и хроническим воспалением, полностью не поняты .
<р> Активация пути Wnt является важным шагом в процессе канцерогенеза. Мутации вдоль Wnt-β-катенина пути встречаются приблизительно 90% от ободочной и прямой кишки и гепатоцеллюлярной карциномой и примерно в 30% ГКС. [6, 7] Кроме того, фактор некроза опухолей-α (ФНО-α), полученный из активированных макрофагов способствует β-катенин активность в GC клетках. [8, 9] Тем не менее, несмотря на доказательства того, что активированные макрофаги действуют в воспалительной микросреды способствовать желудочный туморогенез посредством сигнализации β-катенина, эффекты активированной сигнализации β-катенина на GC клетки метастаза и отношения из этих клеток с окружающими, ассоциированных с опухолью макрофаги (ТАМ) не были непосредственно изучены.
<р> на основании приведенных выше выводов, мы предположили, что β-катенин путь может также участвовать в регулировании макрофаг-индуцированной GC метастаз. В этом исследовании мы впервые исследовали плотность проникших макрофагов и экспрессию бета-катенина в желудочных тканях карциномы с помощью иммуногистохимии (IHC). Были продемонстрированы клинико-патологические характеристики карциномы желудка и прогноза. Кроме того, мы обнаружили, что макрофаги индуцируют ядерную транслокацию бета-катенина и повысить способность вторжения GC клеток. Наши результаты демонстрируют, и в дальнейшем поддерживать важную связь между TAM и ее вниз по течению сигнализации посредника, бета-катенина, в регулировании GC метастазирование.
Пациенты и образцов
<р> исследование было одобрено советом директоров и комитета по этике Human Institutional Review Национального университета Тайваня больницы путем. Письменное согласие на использование образцов для исследовательских целей было получено от всех пациентов до операции. Информация для пациентов была анонимной и обезличенной перед анализом.
<р> В исследовании ретроспективно зачислены 205 пациентов с диагнозом GC, который получил радикальной хирургической резекции на кафедре общей хирургии, Национальный университет Тайваня с января 1998 г. по январь 2002 г. Из них 102 больных, не имевшие последующие данные или которые умерли от осложнений послеоперационных были исключены, а остальные 103 пациента были включены в анализ. Переменные клинико-патологическими классифицированы в соответствии с классификацией TNM (5-е издание, 1997) и характеристики приведены в таблице 1. Общая выживаемость (OS) была определена как интервал между операцией и смертью или между операцией и последним следить за выживших пациентов.
Моноклональные антитела и IHC
<р> резецированные образцы GC фиксировали в формалине и заливали в парафин. Срезы исследовали на TAM инфильтрации и бета-катенина с использованием моноклональных анти-CD68-антителом (клон КР1, DakoCytomation, Glostrup, Дания) и моноклональные β-катенин-антителом (клон 15B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), соответственно.
Оценка иммунным окрашиванием
<р> Для того, чтобы оценить плотность ткани-инфильтрации CD68 + макрофаги, тканевые срезы подвергали скринингу советом сертифицированных патологоанатом (CI Ян) на малой мощности (100 ×) и пяти наиболее представительных поля были выбраны при 400-кратном увеличении. Результаты были подсчитаны вручную и были выражены как сумма числа клеток в пяти 400 × микроскопических полей для каждой области каждого образца.
GC клетки AGS, N87 (приобретается из американской коллекции типовых культур (Manassas, VA)), MKN45 (приобретен у науки здоровья Research Resources Bank (Осака, Япония)) и TSGH (приобретенной у биоресурсов сбора и научно-исследовательский центр (Синьчжу, Тайвань)) и моноцитов клетки человека линии ТНР-1 (приобретенный у американской коллекции типовых культур (Manassas, VA)) клетки выращивали в среде RPMI-1640 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Life Technologies, Inc. ) и 2 мМ L-глутамина (Life Technologies, Inc.).
<р> клетки ТНР-1 высевали в чашки для культивирования и дифференцироваться в макрофаги путем инкубации со 100 нг /мл 12-О-тетрадеканоилфорбол-13 уксусной кислоты (ТФК, Sigma-Aldrich) в течение 24 ч. Макрофаги три раза промывали средой RPMI, содержащей 10% FBS, инкубировать в этой среде в течение еще 24 ч, чтобы исключить влияние ТРА и инкубировать в не содержащей сыворотки среде в течение еще 24 ч. Собранный и объединенные супернатанты культуры использовали в качестве макрофаг-кондиционированной среды (см), как описано выше. [5, 10]
Пролиферация /Жизнеспособность Пробирной
<р> GC клетки высевали в 96-луночные планшеты и совместно культивировали с или без макрофага CM. Пролиферация /жизнеспособность определяли с помощью колориметрического анализа с использованием 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) (Sigma-Aldrich).
Ядерная и цитоплазматический Фракционирование
<р> После стимуляции с помощью или без макрофага см в течение 6 часов, GC клетки лизируют в 300 мкл буфера для лизиса на льду и центрифугируют со скоростью 5400 оборотов в минуту. Супернатант собирали как цитозольной фракции. были собраны Ядерные фракции, а затем запустить в сульфатной электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) для Вестерн-блот-анализа.
Вестерн блот анализ
<р> После стимуляции с помощью макрофагального CM, клетки промывали PBS , соскабливают в RIPA буфере и центрифугируют. Клеточные лизаты подвергали 10% SDS-PAGE и переносили на поливинилиденфторид (PVDF) мембрану (Millipore Corp.) Мембрану зондировали с использованием первичных антител для бета-катенина, АКТ, ЭРК, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), MMP7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, CA, USA), CD44 (ab51037, Abcam, Кембридж, Массачусетс, США), с-Мус (GTX103436, GeneTex, Синьчжу Город , ТАЙВАНЬ), циклин D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-актина (ab8226, Abcam), HDAC 1, п-AKT, п-ЭРК, п-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz лаборатории, Santa Cruz, CA), и вторичное антитело (Santa Cruz Biotechnology).
Иммуноцитохимическая
<р> Анти-общее антитело β-катенин, использовали в качестве первичного антитела, и анти мышиного иммуноглобулина G (IgG), Alexa 594 был использован в качестве вторичного антитела. Покровных стеклах были затем монтируется с помощью монтажной среды, содержащей DAPI для ядерного окрашивания.
Статистический анализ Соотношение иммуногистохимических переменных с клиникопатологическими функций в GC пациентов Для дальнейшего подтверждения наши клинические результаты в пробирке Ядерный Транслокация бета-катенина в клетках GC активированными макрофагами Мы оценивали ниже по течению генов традиционного Wnt /β-катенин MMP7, CD44, с-Мус и циклин D1 детерминированным, если они активируются макрофагами. Уровни мРНК и белок из MMP7, CD44 и с-Мус генов были значительно увеличена в клетках N87, инкубированных с макрофагами СМ и уровни циклина D1 слегка повышается (Фиг.6А). После того, как побуждая уменьшилось вторжения активности с сбивание -катенин, MMP7, CD44 и циклин D1, но не с-Мус показал белок понижающей регуляции (рис 6В). Для того, чтобы подтвердить связь между вторжением способности и MMP7 и CD44, мы тестировали способность нейтрализующих антител блокировать MMP7 и CD44 активностью. Способность инвазии значительно нарушена за счет предварительной обработки с 2,5 мкг /мл анти-MMP7 и с 10 мкг /мл анти-CD44 (фиг.6С), соответственно, что указывает на вовлечение обоих генов в дс инвазии клеток макрофагальной активированные. Мы нашли уровни протеина CD44 и циклин D1 генов были увеличены в других клеточных линиях GC (AGS и MKN45), инкубированных с макрофагами СМ но MMP7 и с-Мус были изменены не имеет существенного значения (S2) Рис. Другие сообщили о возможном пересечение МАРК пути с сигнальной Wnt /β-катенин пути. [12, 13] поэтому мы провели исследование течения времени и обнаружили, что только выражение фосфо-AKT и фосфо-ERK были повышающей регуляции при обработке макрофагами CM (S3A рис). Для подтверждения взаимодействия между АКТ /ERK пути и бета-катенина, мы предварительно обработанные клетки либо с ингибитором ERK (U0126) или ингибитор AKT (LY294002). Уменьшение β-катенина транслокации в ядро можно было обнаружить только в клетках, обработанных ингибитором АКТ, но не ингибитором ERK, что указывает на макрофаг-avtivated Wnt /β-катенин сигнальный путь может регулироваться AKT (S3B рис). В GC клетках, эффект AKT, как представляется, доминирует в макрофагах активированного Wnt /β-катенин сигнальный путь. Предыдущие исследования также предположил, что TNF-α продуцируется макрофагами является ключевым медиатором воспаления и может способствовать β-катенина активности в опухолевых клетках. Мы обнаружили, что использование нейтрализующих антител против TNF-alpha в N87 активации β-Подавить катенина под воздействием макрофагами CM (S4 рис). разнообразие маршрутов, вероятно, модулировать Wnt /β-катенин пути и регулирование сигналов β-катенина может быть так же сложно. Недавние исследования показали, что макрофаг CM запускает ERK пути и Wnt активирует ERK в эндотелиальных клетках. [36, 37] Здесь мы обнаружили, что макрофаги вызывают фосфорилирование как ERK и AKT в GC клетки. Мы показали, что лечение с помощью ингибитора AKT, но не ингибитором ERK уменьшает β-катенина транслокации. Эти результаты указывают на то, что Akt играет роли в макрофаг активируется сигналов β-катенина в желудочном типах клеток.
<р> Статистический анализ клинических особенностей проводилось с использованием х 2 теста и степень инфильтрации между этими две группы сравнивали с использованием критерия Стьюдента. Кривые выживаемости были построены с использованием метода Каплана-Мейера и статистическая значимость была проанализирована с использованием лог-рангового теста. Р-значение менее 0,05 считали статистически значимыми.
Результаты
<р> иммуногистохимический анализ показал цитоплазматический картина CD68 окрашивание для макрофагов. CD68 + макрофаги были распределены по перитуморальной и внутриопухолевых тканей, но только скудно разбросанные в нормальной слизистой оболочке (рис 1А-1С). Плотность CD68 + макрофагов была особенно высока в патологический опухоли 4-й стадии (pT4) опухолевых поражений по сравнению с рТ1 поражения (рис 1D). Для того, чтобы установить связь между клиническими характеристиками и CD68 + макрофаги плотности, отсчеты CD68 + макрофагов были разделены на те, выше и ниже среднего значения. Было обнаружено, что количество CD68 + макрофаги ассоциироваться с опухолевой инвазии и стадии (р = 0,001 и р = 0,043, соответственно) (таблица 1). Это наблюдение позволяет предположить, что CD68 + макрофаги могут играть важную роль в развитии опухолевой инвазии. Для дальнейшего анализа, кривые выживаемости Каплана-Мейера были построены, чтобы определить ассоциацию макрофагов выживания (рис 2). Плотность CD68 + макрофагов в опухолевой ткани была связана с отрицательно общей выживаемости (р = 0,0073). Пациенты с высоким числом опухолевыми CD68 + макрофагов были короче общей выживаемости, чем те, с низким количеством CD68 + макрофагов.
<Р> Повышенная экспрессия и сильный сигнал -катенина наблюдали IHC окрашивания в опухолях. В большинстве случаев выражение β-катенина в основном расположены в цитоплазме (Фиг.3А). Интересно отметить, что сильное окрашивание ядер ГХ клеток β-катенина ассоциируется с CD68 + макрофагов в опухолевых очагов, особенно в передней части инвазии опухоли (фиг.3В). На основании этих результатов, мы предположили, что макрофагальной инфильтрации может активировать передачу сигналов β-катенина в желудочном опухолевых клеток, которые затем, вероятно, приводит к вторжению в новообразованиях желудка.
Требование макрофаги опухолевыми вторжения в GC и Activated макрофаги-индуцированные Вторжение GC клеток
, мы сначала совместно культивированные макрофаги с различными линиями ГХ клеток (AGS, N87, MKN-45 и TSGH) , Все линии GC клеток испытанные бы рекрутировать макрофаги мигрировать и способность макрофагов рекрутинга зависит от степени злокачественности раковых клеток, как определено их инвазивности (рис 4А). [11] Для того, чтобы оценить, насколько инвазии или пролиферации GC клеток может регулируются макрофагами, AGS, N87, MKN45 и TSGH культивировали совместно с и без макрофагами или КМ от макрофага в течение 24 ч и их инвазия и пролиферация способностей испытуемых. Все типы клеток культивировали совместно с макрофагами или КМ от макрофага показал около 2-кратное увеличение числа вторжении клеток (по сравнению с отрицательным контролем, р ≪ 0,05), которое не связано с их способностью пролиферации (Фиг.4В-4D ).
<р> Мы провели эксперимент в пробирке, чтобы понять, была ли передача сигналов β-катенина участвует в GC инвазии клеток макрофагами активируется. Как показано на фиг.5А, β-катенин-иммунореактивность была обнаружена в ядерной фракции клеток N87 еще 15 минут после обработки макрофаг см, а количество белка ядерного β-катенина увеличилось в зависимости от времени. В соответствии с этими выводами, иммунофлуоресценции показали накопление и ядерной локализации -катенина в GC клетки культивировали совместно с макрофагами СМ по сравнению с контрольной группой сокультивировали в N87 (рис 5B). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что растворимые факторы, полученные из макрофагов помочь посредничать накопление и ядерную транслокацию бета-катенина в клетках GC. Мы скоротечно нокдауне -катенин по shRNA и обнаружили снижение экспрессии белка β-катенина в течение 24 часов. Генетическая абляция бета-катенина в клетках N87 не удается увеличить свою инвазивной способность после обработки макрофагов CM. Напротив, не трансфицируются и контроль shRNA не было никаких изменений в инвазивной способности в клетках N87 при лечении макрофаг CM (фиг.5С). Количество белка ядерного β-катенина была также увеличена в AGS и MKN45 клетки после обработки макрофагов CM (S1 рис).
Эффекты макрофага на экспрессию бета-катенина и нижестоящих генов в клетках N87 <бр>
Обсуждение
<р> Микроокружение опухоли имеет решающее значение в определения функции лейкоцитов и фенотип. Противоречивые данные показали, противоопухолевые или protumorigenic функции на макрофагах, в частности, однако наши данные указывают на то макрофаги играют роль protumorigenic в пациентах GC. В большинстве опухолей, ТАМ производят множество факторов, которые способствуют росту опухоли и ангиогенез. [14, 15] Степень макрофагальной инфильтрации в раковых клеток гнездо также является важным прогностическим фактором выживаемости у больных ГЦ. [16-18] IHC выводы, содержащиеся в данном исследовании, четко показывают, что плотность макрофагов в дс ткани коррелирует со степенью клинической стадии (особенно в опухоли [Т] стадия) и выживаемость у пациентов. Современные исследования также предполагают, что макрофаги могут играть вредные роли в передовых GC. Этот вывод находится в согласии с исследованиями, которые свидетельствуют о том, что иммунная микросреда может быть protumoral, а не противоопухолевых, несмотря на некоторые противоречивые данные. [19, 20]
<р> Ядерная накопление бета-катенина было сообщено в примерно одной трети желудочной аденокарциномы, как желудочно-кишечные и диффузные типы. [18] β-катенин представляет собой 92 кДа белок, который функционирует непосредственно в межклеточной адгезии к клетке. [21] Мутации -катенина и аберрантной экспрессией его белка участвуют в инвазия опухоли и метастазирование. [22, 23] в наших результатов IHC, β-катенин располагалась в ядре при инвазивном фронте опухолевых клеток, но не в самой центральной зоне первичной опухоли, где она локализуется в плазматической мембране , Такие наблюдения также могут быть найдены в образцах колоректальной опухоли. [24] Wnt /β-катенин активации в раковых клетках, расположенных на инвазивной фронте было предположено в качестве важного шага в росте и прогрессии опухоли. [25]
<р> Интересно отметить, что мы также обнаружили -катенином, расположенный в ядре опухолевых клеток с макрофагами, расположенными рядом друг с другом, что свидетельствует о возможной взаимосвязи между макрофагами и ядерной транслокации -катенина в опухолевых клетках. β-катенин при инвазивной перед ШС частично объясняется взаимодействиями внутри опухоли микроокружения. Мы подтвердили в пробирке
что макрофаги увеличивают способность вторжения GC клеток. С помощью иммунофлюоресценции конфокальной микроскопии, мы определили локализацию и накопление бета-катенина в ядре в обработанных макрофагах. Таким образом, мы полагаем, что цитокины, секретируемые макрофагами индуцирует β-катенина ядерную транслокацию в GC клетки, тем самым увеличивая их способность вторжения. Инвазивная фронт эпителиальных опухолей представляет собой микросреду, в котором макрофаги взаимодействуют с паренхимных клеток, производя внеклеточный матрикс и секретирующих цитокины и факторы роста, которые на местном уровне способствуют клеточной пролиферации и инвазии. [26, 27] Тем не менее, в нашем исследовании, увеличение β-катенин выражение в пробирке
не изменяли пролиферацию, указывая, что само по себе, не является достаточным для увеличения опухоли злокачественности. Этот вывод также было показано ранее, что β-катенин только способствует адгезии участков с образованием централизовано и стимулирует направленную миграцию и инвазию клеток рака толстой кишки, но не участвует в пролиферации желудка и простаты раковых клеток. [28-30] Тем не менее, стромальных клеток паракринная модуляция сигналов Wnt в эпителиальных клетках, вероятно, координироваться более сложной сети поощрения и ингибирующих факторов секреции. Вниз по течению эффекты различных уровней Wnt сигнализации /β-катенина (и, в частности, те, которые затрагивают клеточную пролиферацию, EMT и локальная инвазия) являются пока еще плохо изучены. β-катенин транслоцируется в ядро, где связывается с факторами транскрипции фактора фактора Т-клеток /лимфоцитов энхансер (TCF /LEF) семьи и инициирует транскрипцию генов-мишеней, таких как циклин D1
, C- Myc
и ММР-7
[31, 32] участвует в пролиферации, инвазии и метастазирования опухолей. [33, 34] Наши данные свидетельствуют о том, что сигнальные пути, с помощью которых макрофаги вызывают бета-катенин также побудить экспрессию генов-мишеней. В соответствии с нашей предыдущей работе [5] ММР-7 и CD44 были две PCR-массивы, идентифицированные после совместного культивирования с макрофагами, как дифференциально экспрессированных генов, ассоциированных с метастазами ГЦ клеток. Деградация внеклеточного матрикса, опосредованной металлопротеиназ матрикса (ММР) является ключевым механизмом во время опухолевой инвазии и метастазировании. Такая деградация необходимо создать микросреду, которая поддерживает рост первичных опухолей и метастазов. Β-катенин /TCF комплекс затем активирует большое количество онкогенов, в том числе СЭФР, с-Мус, C-Цзюнь, Fra-1 и гастрина, что также могут быть вовлечены в последующих событий макрофаг активируется β-катенина. [35]
Выводы
<р> В совокупности, клинические данные свидетельствуют о том, что макрофаг инфильтрация коррелирует с повышением степени и плохим прогнозом для пациенты, перенесшие GC радикальную резекцию. Макрофаги могут индуцировать GC инвазивность путем активации β-катенина пути. Соответственно, подавление макрофагальной инфильтрации и подавление активации β-катенина пути представляют собой потенциальные стратегии для лечения GC.
Поддержка Информация
S1 Рис. . Влияние макрофагами СМ на β-катенина пути
β-катенин накапливается в ядре после обработки с макрофагами КМ в течение 30 минут в AGS и MKN45 клетки
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s001
(TIFF)
S2 рис. Влияние макрофагов CM на экспрессию белка бета-катенин вниз потока генов AGS и MKN45 клеток
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s002
(TIFF)
S3 Рис. (A) Макрофаг CM индуцированное AKT и активацию ERK в клетках N87. клетки (В) N87 были предварительно обработаны с помощью 10 мкМ ингибиторов β-катенин:. LY294002 или U0126 в течение 1 часа, а затем, культивированных в присутствии макрофагального см в течение 1 дополнительного часа
АКТ, ЭРК и β-катенин экспрессии белка определяли с помощью Вестерн-блоттинга
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s003
(TIFF)
S4 рис. . Нейтрализацию антител против TNF-alpha
клетки N87 в присутствии макрофагального см в течение 24 часов, были предварительно обработаны с или без ингибитора TNF-alpha в течение 1 часа
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0134122.s004
(TIFF)
Болезнь Паркинсона можно предотвратить с помощью кишечных микробов
Домашние собаки вряд ли будут передавать SARS-CoV-2,
Кормить домашних животных сырой пищей безопасно,
Ротавирус играет роль в развитии диабета 1 типа
Молодая кровь восстанавливает жизненные силы у пожилых людей
Общий генетический вариант объясняет, почему иммунотерапия часто не помогает при болезни Крона.
Фастфуд может быть главной причиной подростковой депрессии
Почему депрессия становится такой растущей проблемой среди подростков в Америке? Один ответ - это то, что они едят, согласно новому исследованию исследователей из Университета Алабамы в Бирмингеме.
Ротавирус играет роль в развитии диабета 1 типа
Новая статья опубликована в журнале PLOS Pathogens 10 октября, 2019, утверждает, что обычный ротавирус может быть причиной некоторых случаев диабета 1 типа, форма диабета, которая возникает у детей и
Исследователи надеются, что анализ крови, который точно диагностирует фибромиалгию, станет доступен в течение пяти лет.
У исследователей из Университета штата Огайо есть доказательства того, что образцы крови могут надежно обнаружить фибромиалгию, заболевание, которому часто ошибочно ставят диагноз из-за его общих симп