Ploche ONE: infiltrácia makrofágy indukuje Žalúdočné Cancer invazivitě aktiváciou β-katenin Pathway

abstraktné

Pozadie

Napriek dôkazom, že Aktivované makrofágy konali v zápalové mikroprostredie, aby podporovali žalúdočné tumorigenezi cez β- katenin, účinky β-katenin na žalúdočné nádorových buniek metastáz a vzťah týchto buniek s obklopujúce tumor asociovaný makrofágy neboli priamo študovaný.

Methods

Imunohistochemické farbenie bol použitý pre analyzovať 103 pacientov. Test invázie bol použitý pre vyhodnotenie vzťahu medzi makrofágov a buniek karcinómu žalúdka. beta-katenin gain-of-funkcie a so stratou funkcie prístupy boli vykonané. Aby bolo možné posúdiť regulačné β-katenin mechanizmus v rakovinových bunkách žalúdka, Western blotting a reverznej transkripcie polymerázová reťazová reakcia boli použité.

Výsledky

Väčšia hustota makrofágov bola spojená s pokročilom štádiu a zlým prežitím , Žalúdočné rakovina bunkové línie ko-kultivujú s makrofágy kondicionovaného média preukázali zvýšenú jadrovú akumuláciu beta-kateninu a zvýšenej schopnosti napádať. AKT, ale nie EKR regulovaný β-katenin translokácii. MMP7 a CD44, a to ako β-katenin downstream génov, boli zapojené do makrofágov aktivovaných žalúdočné rakovina invázie buniek.

Záver (y)

Spoločne klinické údaje naznačujú, že infiltrácia makrofágy je vo vzťahu s zvýšená trieda a chudobní prognóza pre pacientov s rakovinou žalúdka, ktorí podstúpili radikálnu resekciu. Makrofágy môže vyvolať invasiveness aktiváciou β-katenin cestu

Citácia :. Wu MH, Lee WJ, Hua KT, Kuo ML, Lin MT (2015) infiltrácia makrofágy vyvoláva rakovina žalúdka invazivitě aktiváciou beta-katenin Pathway , PLoS ONE 10 (7): e0134122. doi: 10,1371 /journal.pone.0134122

Editor: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Taliansko

prijatá: 16. september 2014; Prijaté: 06.07.2015; Uverejnené: 30. júla 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje spadajú do papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie: .. Táto práca bola podporená dotácií z Národnej vedeckej rady, na Taiwane (NSC 98-2314-B-002-055-MY2)

Konflikt záujmov: autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je jedným z najčastejších nádorových ochorení na celom svete a takmer dve tretiny týchto pacientov zomrie. ich ochorenia. [1] GC je úzko spojená s Helicobacter pylori
infekcie, čo vedie k chronickému zápalu. [2] Tento zápalový mikroprostredie je charakterizovaná prítomnosťou hostiteľských leukocytov prevažne s makrofágy v oboch nosnej strómy a nádorového tkaniva. [3] Výskumy ukazujú, že tumor asociované zápalovej reakcie, a to ako lokálne a systémové, sú dôležitými nezávislými faktormi nádorové progresie a metastáz. [4, 5] Avšak väzby medzi týmito molekulárnych mediátorov a chronického zápalu, nie sú úplne .

Aktivácia Wnt dráhy je dôležitým krokom v procese karcinogenézy. Mutácie pozdĺž Wnt-β-katenin dráhy sa vyskytujú v približne 90% z hrubého čreva a hepatocelulárnych karcinómov a v približne 30% GC. [6, 7] Okrem toho, tumor nekrotizujúci faktor-α (TNF-α) odvodené z aktivovaných makrofágov podporuje β-katenin činnosť v GC buniek. [8, 9] Avšak, cez dôkaz, že aktivované makrofágy koná v zápalové mikroprostredie na podporu žalúdočné tumorigenezi pomocou β-katenin, účinky aktivovaného β-katenin na GC buniek metastáz a vzťah z týchto buniek s okolitými s nádorom spojených makrofágov (TAM), ktoré neboli priamo študované.

na základe uvedených zistení sme predpokladali, že β-katenin dráha môže byť tiež podieľa na regulácii makrofágov indukované GC metastáz. V tejto štúdii sme najprv skúmaná hustotu infiltrovaných makrofágov a expresiu p-kateninu v tkanivách karcinómu žalúdka pomocou imunohistochémia (IHC). Tieto klinicko-patologické charakteristiky karcinómu žalúdka a prognózy bola preukázaná. Ďalej sme zistili, že makrofágy indukuje nukleárnej translokácii beta-kateninu a zlepšiť schopnosť invázie GC buniek. Naše zistenia ukazujú aj naďalej podporovať dôležitou spojnicou medzi TAM a jeho signalizácia downstream mediátor, beta-cateninu, pri regulácii GC metastáz.

Materiál a metódy

Pacienti a vzorky

štúdia bola schválená predstavenstvom a Human etickou komisiou Institutional Review of National Taiwan University Hospital. Písomný súhlas na použitie vzoriek na výskumné účely bol získaný od všetkých pacientov pred chirurgickým zákrokom. Informácie pacient bol anonymizované a DE-identifikoval pred analýzou.

V štúdii retrospektívne zapísané 205 pacientov s diagnózou GC, ktorí dostávali radikálne chirurgickú resekciu na oddelenie všeobecnej chirurgie, National Taiwan University od januára 1998 do januára 2002. Z týchto 102 pacientov, ktorá postrádala následné údaje alebo ktorí zomreli z Perioperačná komplikácií boli vylúčené a zostávajúce 103 pacienti boli zahrnutí do analýzy. Klinicko-patologické premenné boli klasifikované podľa klasifikácie TNM (5. vydanie, 1997) a charakteristiky sú zhrnuté v tabuľke 1. Celkové prežívanie (OS) bola definovaná ako interval medzi operáciou a smrťou alebo medzi chirurgiou a posledný nadväznosti na prežívanie pacientov.

monoklonálne protilátky a IHC

resekované exempláre GC boli fixované vo formalínu a vložené do parafínu. Rezy boli skúmané na TAM infiltráciu a p-kateninu s použitím monoklonálnej anti-CD68 protilátky (klon KP1, DakoCytomation, Glostrup, Dánsko) a monoklonálnou β-katenin protilátkou (klon 15B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), v danom poradí.

vyhodnotenie imunologické

k vyhodnoteniu hustoty tkanív zasiahnutých CD68 + makrofágy, tkanivové rezy boli vyšetrované pomocou tabule potvrdila patológa (CI Jn) pri nízkom výkone (100 x) a päť najreprezentatívnejší pole bolo vybrané pri 400 x zväčšení. Výsledky boli počítané manuálne a boli vyjadrené ako súčet počtu buniek v piatich 400 x mikroskopických polí pre každú oblasť každej vzorky.

Cell Culture

GC buniek AGS, N87 (zakúpené od American Type Culture Collection (Manassas, VA)), MKN45 (zakúpené od Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japonsko)) a TSGH (zakúpené od BioResource Zber a Research Center (Hsinchu, Taiwan)) a ľudské monocytární bunky línia THP-1 (zakúpený od American Type Culture Collection (Manassas, VA)) bunky boli pestované v RPMI-1640 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) so sérom 10% hovädzieho zárodočného (FBS, Life Technologies, Inc. ) a 2 mM L-glutamínom (Life Technologies, Inc.).

THP-1 bunky boli vrúbľovať do kultivačných misiek a navodiť diferenciáciu na makrofágy inkubáciou s 100 ng /ml 12-o-tetradecanoylphorbol-13 acetát (TPA, Sigma-Aldrich) po dobu 24 hodín. Makrofágy boli trikrát premyté RPMI médiom obsahujúcim 10% FBS, inkubujú sa v tomto médiu po ďalších 24 h, aby sa eliminoval účinok TPA a inkubované v médiu bez séra za ďalších 24 hodín. Pozberané a Zhromaždené supernatanty kultúry boli použité ako makrofágov upravené médium (CM), ako bolo popísané vyššie. [5, 10]

proliferácie /životaschopnosti test

GC bunky boli nasadené na 96jamkové doštičky a ko-kultivujú s alebo bez makrofágov CM. Proliferácia /životaschopnosť bola stanovená kolorimetrickým testom za použitia 3- (4,5-dimetyl-thiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT) (Sigma-Aldrich).

in vitro test invázie

test invázie bolo vykonané s použitím bunkovej kultúry transwell komory (Millipore Corp, Billerica, MA). Invázne Bunky boli počítané pri 400 x zväčšení v 10 rôznych oblastiach pre každú vložku. Experiment bol opakovaný trikrát.

RNA extrakčnej a RT-PCR

Po stimulácii makrofágov alebo bez CM po dobu 6 h, GC boli bunky pozbierané a celková RNA extrahovaná s použitím reagenčnej súpravy TRIzolu ( Invitrogen, Carlsbad, CA) podľa inštrukcií výrobcu. cDNA bola amplifikovaná polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím primérov pre MMP7 (vpred: 5'AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, reverzné: 5'-GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (vpred: 5'-TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, reverzné: 5'-TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), cyklin D1 ( vpred: 5'-CCCAGCCATGGAACACCA, reverzné: 5'-GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-myc (vpred: 5'-AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, reverzné: 5'-TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) a GAPDH (vpred: 5'-GGGTGATGCAGGTGCTACTT, reverzné: 5'GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .

Jadrová a Cytoplasmic frakcionácia

po stimulácii makrofágov alebo bez CM po dobu 6 hodín, GC boli bunky lyžovanie v 300 ul lyzačného pufra na ľade a odstredí pri 5400 otáčkach za minútu. Supernatant sa oddelí ako cytosolické frakcie. Nukleárna frakcie boli spojené, potom spustiť v dodecylsulfát sodným elektroforézou na polyakrylamidovom géle (SDS-PAGE) pre Western blot analýzu.

Western Blotting Analýza

Po stimulácii makrofágov CM, bunky boli premyté PBS , poškriabaný do RIPA pufrom a odstredí. Fragmenty buniek boli podrobené 10% SDS-PAGE a prenesené na polyvinylidénfluorid (PVDF) membránu (Millipore Corp.) Membrána bola sondoval pomocou primárnych protilátok pre beta-kateninu, AKT, EKR, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), MMP7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, CA, USA), CD44 (ab51037, abca, Cambridge, MA, USA), c-myc (GTX103436, GeneTex, Hsinchu City , Taiwan), cyklin D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-aktínu (ab8226, abca), HDAC1, p-AKT, p-EKR, p-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA) a sekundárnou protilátkou (Santa Cruz Biotechnology).

imunocytochemie

anti-totálnej β-katenin protilátka bola použitá ako primárna protilátka a anti myšou imunoglobulín G (IgG), Alexa 594 bola použitá ako sekundárna protilátka. Krycie sklíčka potom boli namontované pomocou montážnej médium obsahujúce DAPI pre jadrovú farbenie.

Lentivirový výroba a infekcie

Short vlásenky RNA (shRNAs) boli zakúpené od hlavného nástroja na Akademickom Sinice (Taipei National RNAi, Taiwan). Cieľová sekvencia beta-kateninu zhrňme 1 je 5'-CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 '; že beta-kateninu zhrnieme 2 bol 5'-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 '. Lentivirovým vektorom a jeho obal vektory boli transfekovány do buniek 293T obalových fosforečnanom vápenatým transfekciu. Stručne povedané, 293T bunky boli rozdelené (10 ^{6) do 10 cm 2 misky 1 deň pred transfekcia. Potom boli bunky transfekovány 10 ug zhrnie vektorov a 10 ug pCMVΔR8.91 (balenie vektor) a 1 ug pMD.G (obálka vektor). Po 5 hodinách inkubácie, transfekční médium nahradí čerstvým médiom. Štyridsaťosem hodín neskôr sa médium lentivirus obsahujúce bola odobraná z transfekcia a odstredí sa pri 1500 otáčkach za minútu po dobu 5 minút na usadenie bunkovej zvyšky, supernatant filtroval cez 0,45 um filter, a cieľové bunky boli infikované s čerstvým lentivirus obsahujúcim médium (doplnené 8 ug /ml polybrenu po dobu 24 hodín).}

Štatistická analýza

Štatistická analýza klinických príznakov bolo vykonané s využitím × ^{2 testu a stupeň infiltrácie medzi obe skupiny sa porovnali pomocou t-testu. Krivky prežitia boli konštruované za použitia metódy Kaplan-Meierovej a štatistická významnosť bola analyzovaná s použitím log-rank testu. P-hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významné.}

Výsledky

Korelácia imunohistochemických premenných s patologickým funkcie v GC pacientov

Imunohistochemické analýza ukázala cytoplazmatický CD68 vzor farbenie pre makrofágy. CD68 + makrofágy boli distribuované po celom peritumorálního a nitronádorových tkanivách, ale len riedko rozptýlené v normálnej sliznici (Obr 1A-1C). Hustota CD68 + makrofágov boli vysoké najmä v patologických nádorových stupňa 4 (v PT4) nádorových lézií v porovnaní s PT1 lézií (obr 1D). Na stanovenie asociácie medzi klinickými charakteristikami a CD68 + makrofágov hustote, počty CD68 + makrofágov boli rozdelené na tie, nad a pod strednou hodnotou. Bolo zistené, že počet CD68 + makrofágov, ktoré majú byť spojené s hĺbkou a stavu nádoru (p = 0,001 a p = 0,043, v danom poradí) (Tabuľka 1). Toto pozorovanie naznačuje, že CD68 + makrofágy môžu byť dôležité v podpore invázie tumoru. Pre ďalšiu analýzu, Kaplan-Meierove krivky prežitia boli vynesené do grafu na stanovenie asociácie makrofágov prežitie (obrázok 2). Hustota CD68 + makrofágov v nádorovom tkanive bol negatívne spojené s celkovým prežitím (p = 0,0073). Pacienti s vysokým počtom nádorových CD68 + makrofágov mal kratšiu prežitia ako pacienti s nízkym počtom CD68 + makrofágov.

Zvýšená expresia a silnejší signál p-kateninu boli pozorované IHC farbenie v nádoroch. Vo väčšine prípadov, β-katenin expresie bola v prvom rade sa nachádza v cytoplazme (obr 3A). Zaujímavé je, že silná nukleárna farbenie β-katenin GC buniek bolo spojené s CD68 + makrofágov v nádorových lézií, a to najmä v prednej časti invázie nádoru (obrázok 3B). Na základe týchto výsledkov sme predpokladali, že infiltrácia makrofágy môžu aktivovať β-katenin v žalúdočných nádorových buniek, ktoré sa potom pravdepodobne vedie k invázii v žalúdočnej malignity.

Požiadavka makrofágov pre invázie tumoru v GC a Activated makrofágov indukované invázie GC buniek

Ak chcete ďalej potvrdzujú naše klinické nálezy in vitro
, sme sa prvýkrát spoločne kultivované makrofágy s rôznymi GC bunkových línií (AGS, N87, MKN-45 a TSGH) , Všetky GC Testované bunkové línie by nábor makrofágy k migrácii a makrofágov regrutovanie schopnosť bola závislá na stupni malignity nádorových buniek, ako sú stanovené ich invazívnosti (obr 4A). [11] Pre vyhodnotenie, či invazívnosť alebo proliferácie GC buniek môže byť upravené makrofágy, AGS, N87, MKN45 a TSGH boli spoločne kultivované s a bez makrofágov alebo CM z makrofágov po dobu 24 hodín a ich invázie a šírenie schopností testovaných. Všetky typy buniek ko-kultivujú s makrofágy alebo CM z makrofágov preukázala u 2-násobné zvýšenie počtu inváziu buniek (v porovnaní s negatívnymi kontrolami, p menšie ako 0,05), ktorá nie je spojená s ich proliferačnej schopnosťou (obr 4B-4D ).

nukleárnej translokácii beta-kateninu v GC buniek aktivovanými makrofágy

sme vykonali experiment in vitro pochopiť, či β-katenin bol zapojený do makrofágov aktivovaných GC invázie buniek. Ako je znázornené na obr 5A, β-katenin imunoreaktivita bola zistená v nukleárnej frakcii N87 buniek, ako je už po 15 minútach po ošetrení makrofágov cm a množstvo β-katenin proteínu jadrového zvýšenie v závislosti na čase. V súlade s týmito zisteniami, imunofluorescencie ukázali, hromadenie a nukleárnej lokalizáciu p-kateninu v GC buniek ko-kultivovaných s makrofágov cm v porovnaní s kontrolami cocultured v n87 (obrázok 5B). Tieto výsledky jasne ukazujú, že rozpustné faktory, odvodené od makrofágov pomôcť sprostredkujú hromadeniu a nukleárnej translokáciu beta-kateninu v GC buniek. My prechodne zrazil beta-katenin o zhrnie a bolo zistené, znížená expresia β-katenin bielkovín počas 24 hodín. Genetická ablácia beta-kateninu do N87 buniek nedokáže zvýšiť ich schopnosť invazívne po ošetrení makrofágov CM. Naproti tomu, non-transfekované a riadenie zhrnie neboli žiadne zmeny na invazívnu schopnosť v N87 buniek za makrofágov CM liečby (obr 5C). Množstvo β-katenin proteínu jadrového bola tiež zvýšená v AGS a MKN45 buniek po makrofágov CM liečby (S1 Obr).

Efekty makrofágov na expresiu beta-kateninu a následný gény v bunkách N87

Vyhodnotili sme tradičný Wnt /β-katenin downstream génov MMP7, CD44, c-myc a cyklin D1 determinovať v prípade, že sa aktivujú makrofágy. Hladiny mRNA a proteínovej MMP7, CD44 a c-myc génov boli v N87 bunkách inkubovaných s makrofágov CM a hladiny cyklin D1 mierne zvýšil (obr 6a) všetko výrazne zvýšil. Po vyzvaní sa znížila invázii aktivitu od porazí beta-katenin, MMP7, CD44 a cyklin D1, ale nie c-myc proteínu ukázalo down-regulácia (obr 6B). Pre potvrdenie vzťahu medzi inváziou schopností a MMP7 a CD44, sme testovali schopnosť neutralizačné protilátky blokovať MMP7 a CD44 aktivitu. Invasion schopnosť bola značne ohrozená predchádzajúcom ošetrením s 2,5 ug /ml anti-MMP7 a 10 ug /ml anti-CD44 (obr 6C) v tomto poradí, čo naznačuje zapojenie oboch génov v makrofágy aktivovanej GC invázie buniek. Zistili sme, že hladina proteínu v CD44 a cyklin D1 gény boli v iných GC bunkových línií (AGS a MKN45) inkubovaných s makrofágov cm, ale MMP7 a c-myc neboli významné zmenená (S2) Obr vzrástol.

Ostatné hlásili možný priesečník MAPK s Wnt /β-katenin signalizačné dráhy. [12, 13] preto sme vykonali štúdiu časový priebeh a zistil, že iba fosfo-AKT a fosfo-ERK expresie bola up-regulovaná, ak boli liečení makrofágov CM (S3A obr). Pre potvrdenie interakcie medzi Akt /EKR a p-kateninu sme vopred bunky s buď inhibítora EKR (U0126) alebo inhibítora AKT (LY294002). Zníženie β-katenin translokáciu do jadra sa vyskytuje len v bunkách ošetrených inhibítorom AKT, ale nie inhibítora EKR, čo naznačuje, makrofágov-avtivated Wnt /β-katenin signálne dráhu môže byť regulovaná AKT (S3B Obr). V GC buniek sa AKT efekt sa zdá byť dominantné v makrofágy aktivovanej Wnt /β-katenin signálne dráhy. Predchádzajúce štúdie tiež navrhol, že TNF-α produkovaný makrofágy je kľúčovým mediátorom zápalu a môže podporovať β-katenin aktivitu v nádorových bunkách. Zistili sme, že s využitím neutralizačné protilátky proti TNF-alfa aktiváciu potlačiť β-katenin N87 za vystavenie makrofágov CM (S4 Obr).

Diskusia

mikroprostredie nádoru má zásadný význam v určujúce funkciu leukocytov a fenotyp. Konfliktné údaje ukázali antitumorigenic alebo protumorigenic funkcie na makrofágy, najmä však naše údaje naznačujú, makrofágy hrajú úlohu protumorigenic u pacientov s GC. Vo väčšine nádorov, TAM produkujú nespočetné množstvo faktorov, ktoré podporujú rast nádorov a angiogenézy. [14, 15] Stupeň infiltráciu makrofágov do nádorových buniek hniezda je tiež významným prediktorom prežitia u pacientov s GC. [16-18] výsledky IHC tejto štúdie jasne ukazujú, že hustota makrofágov v tkanive GC je v korelácii so stupňom klinickom štádiu (najmä v nádore [T] fáza) a prežitie u pacientov. Súčasné štúdie tiež vyplýva, že makrofágy môžu hrať úlohu v pokročilom škodlivé GC. Toto zistenie je v súlade so štúdiami, ktoré naznačujú, že imunitný mikroprostredia môže byť protumoral skôr ako protinádorové, aj cez niektoré protichodných údajov. [19, 20]

Nukleárna akumulácie beta-kateninu bolo hlásené približne u jednej tretiny žalúdočných adenokarcinómov, ako črevné a difúznej typov. [18] β-katenin je 92 kDa proteín, ktorý funguje priamo v adhézii bunky do bunky. [21] Mutácie beta-kateninu a aberantne expresiou svojich bielkovín sú zapojené do nádorové invázie a metastáz. [22, 23] v našich zistení IHC, β-katenin sa nachádza v jadre na invazívne pred nádorových buniek, ale nie v najviac centrálnej oblasti primárnych nádorov, kde sa lokalizuje do plazmatické membrány , Tieto zistenia môžu byť tiež nájdené v kolorektálnych vzorkách nádoru. [24] Wnt /β-katenin aktivácia v rakovinových bunkách umiestnených na prednej strane invazívnej bola stanovená ako dôležitý krok v raste nádoru a progresiu. [25]

Zaujímavé je, že sme tiež zistené, p-katenin sa nachádza v jadre nádorových buniek s makrofágy sa nachádzajú vedľa seba, čo naznačuje možnú súvislosť medzi makrofágy a jadrovej translokácii beta-kateninu v nádorových bunkách. β-katenin na invazívnej pred GC je čiastočne vysvetliť interakcií v mikroprostredie nádoru. Potvrdili sme in vitro
že makrofágy zvýšiť invazívne schopnosť GC buniek. Za použitia imunofluorescencie konfokálna mikroskopia, sme zistili, lokalizáciu a akumuláciu beta-kateninu v jadre v ošetrených makrofágy. Preto sme podozrenie, že cytokíny vylučované makrofágy vyvolávať β-katenin nukleárnej translokácii v GC buniek, čím sa zvyšuje ich invázii schopnosti. Invazívne Predné epiteliálnych nádorov predstavuje mikroprostredie, v ktorom makrofágy interagovať s parenchymálnych bunkách produkciu extracelulárnej matrix, a tým, že vylučuje cytokíny a rastové faktory, ktoré lokálne podporujú bunkovú proliferáciu a inváziu. [26, 27] Avšak, v našej štúdii, zvýšenie β-katenin výraz in vitro
neovplyvnilo proliferáciu, čo naznačuje, že sama o sebe nestačí k rozšíreniu nádoru malignity. Toto zistenie je tiež už skôr preukázané, že β-katenin podporuje iba adhéznych miest tvoriť fokálne a stimuluje smerové migrácie a invázie nádorových buniek hrubého čreva, ale nie je zapojený do šírenia žalúdočných a prostaty rakovinových buniek. [28-30] Napriek tomu, stromálne bunky parakrinný modulácia Wnt signalizácie v epitelových bunkách je pravdepodobné, že koordinuje viac zložité siete podporovať a inhibíciu sekrécie faktorov. Následný vplyv rôznych úrovniach Wnt /β-katenin (a najmä tie, ktoré ovplyvňujú bunkovú proliferáciu, EMT a miestnej invázie), sú napriek tomu zle pochopený. β-katenin premiestni do jadra, kde sa viaže na transkripčné faktory T buniek faktor /lymfocyt enhancer faktor (TCF /LEF), rodiny a iniciuje transkripciu cieľových génov, ako je napríklad cyklin D1
, c- myc stroje a MMP-7
[31, 32], zapojený do proliferácie, nádorové invázie a metastáz. [33, 34] Naše výsledky naznačujú, že signálne dráhy, cez ktorý makrofágy vyvolať beta-katenin tiež prinútiť expresie cieľových génov. V súlade s našou predchádzajúcou prácu, [5], MMP-7 a CD44 boli dva PCR pole zistené po kultivácie s makrofágy sú odlišne exprimovaných génov spojených s metastázy GC buniek. Degradácia extracelulárnej matrix sprostredkovanej matrixu metaloproteinázy (MMP), je kľúčovým mechanizmom v priebehu nádorovej invázie a metastáz. Ako je degradácia je nutné vytvoriť mikroprostredie, ktorá podporuje rast primárnych nádorov a metastáz. Β-katenin /TCF komplex následne aktivuje veľké množstvo onkogénov, vrátane VEGF, c-myc, c-Jun, fra-1 a gastrínu, ktoré môžu byť tiež zapojený do makrofágov aktivovať β-katenin následných udalostí. [35]

rôznymi cestami, pravdepodobne modulovať môže byť podobne zložité Wnt /β-katenin dráha a regulácia β-katenin. Nedávne štúdie zistili, že makrofág CM spúšťa EKR a Wnt aktivuje EQF v endotelových bunkách. [36, 37] Tu sme zistili, že makrofágy indukuje fosforyláciu oboch EKR a Akt v GC buniek. Preukázali sme, že liečba inhibítory AKT, ale nie inhibítora EKR znižuje β-katenin translokácii. Tieto výsledky ukazujú, že Akt hrá úlohu v aktivácii makrofágov β-katenin v žalúdočných typov buniek.

Závery

Spoločne klinické údaje naznačujú, že infiltrácia makrofágy je v korelácii so zvýšenou stupňa a horšie prognózou pre pacienti GC, ktorí podstúpili radikálnu resekciu. Makrofágy môžu vyvolať GC invazívnosti aktiváciou β-katenin dráhu. V súlade s tým potlačenie infiltráciu makrofágov a potlačenie aktivácie β-katenin dráhy predstavujú potenciálne stratégie pre liečbu GC.

Podporné informácie
S1 Obr. . Účinok makrofágov CM na β-katenin dráhy
β-katenin hromadí v jadre po ošetrení makrofágov CM po dobu 30 minút v AGS a MKN45 buniek
doi :. 10,1371 /journal.pone.0134122.s001
(TIFF)
S2 obr. Vplyv makrofágov cm na proteínovú expresiu beta-katenin down-streamu gény AGS a MKN45 buniek
doi :. 10.1371 /journal.pone.0134122.s002
(TIFF)
S3 Obr. (A) makrofágov indukovanej CM Akt a aktivácia EQF v bunkách N87. (B) N87 Bunky boli predbežne ošetrené 10 uM inhibítorov β-katenin :. LY294002 alebo U0126 po dobu 1 hodiny a potom kultivované v prítomnosti makrofágov cm pre 1 ďalšiu hodinu
AKT, EKR a β-katenin expresie proteínov boli stanovené westernovým prenosom
doi :. 10,1371 /journal.pone.0134122.s003
(TIFF)
S4 obr. . Neutralizačných protilátok proti TNF-a
N87 buniek v prítomnosti makrofágov CM po dobu 24 hodín aby sa ošetrili s alebo bez inhibítora TNF-a po dobu 1 hodiny
doi :. 10,1371 /journal.pone.0134122.s004
(TIFF)

• Ploche ONE: PRR11 Je prognostický marker a potenciál Oncogene u pacientov s karcinómom žalúdka
• Ploche ONE: lymfatických uzlín, Unique nezávislý prognostický faktor v skorej rakoviny žalúdka