PLoS ONE: уменьшенная экспрессия проангиогенные факторов роста и их рецепторов в язвенной болезни желудка с циррозом Patients

Абстрактный

Цели
<р> Патогенез высшего возникновения язвенной болезни у пациентов с циррозом является сложный. Тромбоциты могут стимулировать ангиогенез и способствовать заживлению язвенной болезни желудка. Мы сравнили выражения проангиогенные факторов роста и их рецепторов в желудочном края язвы между циррозом пациентов с тромбоцитопенией и те, не-пациентов с циррозом для выяснения возможных механизмов.

Методы

Приемлемые пациентов с циррозом ( п = 55) и не циррозом пациентов (n = 55), которые имели язвы желудка были зарегистрированы. Слизистая от желудочных маржевых болезнь желудка и неязвенной областей были отобраны и мРНК выражения проангиогенные факторов роста (эндотелиальный фактор роста сосудистого [VEGF], тромбоцитарный фактор роста [PDGF], основной фактор роста фибробластов [bFGF]) и их рецепторы (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) были измерены и сравнены. Количество тромбоцитов и выражения этих факторов роста и их рецепторов были соотнесены друг с другом.

Результаты
<р> Обе группы были сопоставимы по полу, размер язвы и скорость зараженности . хеликобактерной
тем не менее, группа цирротический были моложе по возрасту, имели более низкий уровень тромбоцитов, чем те, в не цирротической группе (р &л; 0,05). Циррозом пациентов уменьшилась мРНК выражения PDGFB, VEGFR2, FGFR1 и FGFR2 в желудочном края язвы по сравнению с таковыми не-пациентов с циррозом (р &л; 0,05). Уменьшенные выражения PDGFB и VEGFR2, FGFR1 и FGFR2 были хорошо коррелируют со степенью тромбоцитопении у этих пациентов с циррозом (ρ > 0,5, р &л; 0,001).

Выводы
<р> Наши выводы подразумевает, что уменьшенная активность проангиогенные факторов и их рецепторов могут участвовать в патогенезе язвенной болезни желудка в больных циррозом
<р> Образец цитирования:. Ло JC, Пэн Ю.Л., Hou MC, Хуан KW, Huang HC, Wang YW и др. (2013 г.) уменьшенная экспрессия проангиогенные факторов роста и их рецепторов в желудочном язвах пациентов с циррозом. PLoS ONE 8 (4): e61426. DOI: 10.1371 /journal.pone.0061426
<р> Редактор: Матиас А. Авила, Университет Наварры школы медицины и Центра прикладных медицинских исследований (CIMA), Испания
<р> Поступило: 24 декабря 2012; Принято: 9 марта 2013 года; Опубликовано: 19 апреля 2013
<р> Copyright: © 2013 Ло и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Настоящее исследование проводилось при поддержке исследовательских грантов от Тайбэя ветеранов General Hospital (V101-028 и V102C-006). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Предыдущие исследования показали, что у пациентов с циррозом имеют более высокую распространенность язвенной болезни (ЯБ), чем среди населения в целом [1], [2]. Недавние крупные, популяционные когортные исследования из Тайваня показали, что у больных циррозом печени, имеют более высокий риск развития язвенной болезни кровотечения (PUB) и язва рецидива кровотечения [3], [4]. Патогенез высоким уровнем заболеваемости ЯБ в пациентов с циррозом является сложным и многофакторным. Теоретически, портальная гипертензия участвует которая вызывает спланхнической заторы, нарушенные репаративные процессы гастродуоденальной слизистой оболочки, и желудка микро-сосудистой патологии [5], [6], все из которых приводят к повышенной восприимчивости к кислоты и пепсина. Кроме того, было показано, что циррозом условие приводит к нарушению слизистой оболочки желудка защиту /восстановление механизмов, таких, как нарушение бикарбоната и секреции слизи, снижение эндогенного синтеза простагландинов, слизистой оболочки желудка кровоток, а также сниженную слизистого оксигенации [7], [8], [9 ].
образование <р> Язва представляет собой динамический дисбаланс между агрессивными факторами слизистых оболочек и защитных факторов /восстановление. Когда эти оборонительные и лечебные факторы менее чем агрессивных факторов, слизистых оболочек травмы ухудшаются и язвы развиваются [10]. Ангиогенез является ключевым процессом при язвенной болезни желудка исцеления [11]. Несколько проангиогенные факторы сохраняются в тромбоцитах, в том числе фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста, полученного из тромбоцитов (PDGF) [12]. Эти факторы роста выделяются в язве базы из тромбоцитов и активации и способствуют образованию новых кровеносных сосудов во время фазы гемостаза заживления язвы [13]. Это, вероятно, объяснить способность тромбоцитов стимулировать ангиогенез и поощрения желудка заживление язв [12], [14]. Тромбоцитопения обычно наблюдается у пациентов с циррозом вследствие селезеночной секвестрации тромбоцитов и снижению уровня и активности тромбопоэтина [15].
<Р> В данном исследовании мы сравнили выражения проангиогенные факторов роста (VEGF, PDGF, bFGF ) и их рецепторы (VEGFR1, VEGFR2, PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, FGFR2) над желудочной язвы края между циррозом пациентов с тромбоцитопенией и те, не-пациентов с циррозом без тромбоцитопении. Кроме того, мы исследовали роль проангиогенные факторов и их рецепторов при язвенной болезни желудка и исцеление в больных циррозом.

Материалы и методы

Пациенты Зачисление

циррозу и не пациентов с циррозом с диагнозом язвы желудка с помощью проверенных видео эзофагогастродуоденоскопии (EGD) (Olympus GIF-XQ260 желудочно-кишечного тракта видеоскоп, Aizo Olympus, Фукусима, Япония) были последовательно Поступил. Диагноз цирроза печени в данном исследовании было основано на характерных результатов, в том числе физической стигматами цирроз печени, компьютерной томографии или ультразвукового исследования по узловой поверхности печени, огрубевшей эхогенности паренхимы печени, увеличение селезенки, а также выявления варикозного расширения вен пищевода с помощью эндоскопии [ ,,,0],16]. Критерии исключения тех, кто принимал аспирин, нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), клопидогрел, тиклопидин, стероиды, ингибиторы протонной помпы, гистаминовых рецепторов 2 антагонисты, мизопростола или сорафениба, и те, кто пил алкоголь или курили, имели тромбоцитопения (тромбоциты &лт; 30000 /мм ^{3), гепатоцеллюлярной карциномы или других злокачественности, включая злокачественные язвы, язвы с активным кровотечением, в анамнезе операции на желудке, склонность к кровотечениям, уремии, нестабильной активности болезни или плохое общее состояние [17]. Это исследование было одобрено Комитетом по институциональному обзору Тайбэй ветеранов больницы (TVGHIRB: 98-12-04) путем и был проведен в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации. Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в данном исследовании, в предположении, что они имели язвы желудка во время ФГДС.}

Измерения
<р> медицинские и личные истории пациентов были проанализированы, и лабораторные данные, включая тромбоцитов подсчитывать, сывороточный альбумин, гемоглобин, и креатинин были записаны. Во время процедуры EGD, размер язвы желудка измеряли с помощью щипцов калиброванные биопсии [18], и ткани слизистой оболочки от края язвы была взята в качестве стандартной процедуры гистологические исследования, чтобы исключить злокачественность и обнаружить Helicobacter Pylori (H. пилори)
инфекции (Гимза) [17], [18]. Слизистые ткани (суммарно около 15 мг, два куска образцов) от края язвенного и неязвенной областей (антрального) было принято соответственно с помощью эндоскопической биопсии и немедленно замораживали в жидком азоте, а затем хранили при -80 ° C до дальнейшего анализа. Язвы были определены как через слизистую оболочку брейки ≥3 мм [17], [18]. Все эндоскопические процедуры были выполнены и фотокопии двумя старшими эндоскопистов (Ло и Хоу), а диагноз язвенной болезни желудка была подтверждена еще двух эндоскопистов, которые были ослеплены клинического состояния испытуемых.

Выделение мРНК и ПЦР в реальном времени
<р> Общую РНК экстрагировали из слизистой оболочки желудка с использованием 500 мкл реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, USA) в соответствии с протоколом производителя. РНК подвергали дальнейшей очистке с использованием 100 мкл хлороформа обработку, и затем осаждают с помощью 250 мкл изопропанола до синтеза комплементарной ДНК. Геномную ДНК загрязненный в извлеченной РНК была разрушена с использованием DNAseI (Invitrogen, США) при комнатной температуре в течение 15 мин. Качество выделенной РНК была проверена с помощью электрофореза в 1,0% агарозном геле с формальдегидом, и его количество определяли путем измерения его оптическую плотность при длине волны 260- и 280-нм. Одноцепочечной комплементарной ДНК синтезировали с использованием GoScript ™ обратной транскриптазы (Promega, США) и олиго дТ праймера [19].
<Р> Для количественного определения гена выражения VEGF, VEGFR1, VEGFR2, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, bFGF, FGFR1, FGFR2, количественные в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с использованием LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Последовательности прямого и обратного праймеров приведены в таблице 1.
<р> в режиме реального времени количественный ПЦР проводили на LightCycler®480 использованием GoTag® КПЦР Master Mix (Promega, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественная ПЦР состояла из первоначальной выдержкой при 95 ° С в течение 10 мин, затем 45 циклов при 95 ° С в течение 15 с и 54 ° С в течение 1 мин, при 40 нг кДНК шаблона и 2 мкМ праймера используют для каждого образца , Сигналы, поступающие от каждого образца были нормированы к значениям, полученным для гена домашнего хозяйства GAPDH, который протекал одновременно с экспериментальными образцами. Метод сравнительного порогового цикла (Ct) (ΔΔCt) использовали для расчета относительных выражений генов (изменение раза) между измерительными и контрольными образцами [19]. Элементы управления без стадии RT или без шаблона были включены для каждой пары праймер для проверки любых загрязнений. В качестве еще одной меры контроля качества, плавление (диссоциации) кривые реакции ПЦР контролировали, чтобы гарантировать, что существует только один продукт ПЦР и нет диммеры праймеров [19]. Все измерения был дубликатом в каждом образце.

Статистический анализ
<р> Данные выражали в виде средних значений ± стандартное отклонение (SD) и результаты были сопоставлены между группами с использованием критерия хи-квадрат, точный критерий Фишера , критерий Стьюдента или непараметрический критерий Манна-Уитни U, когда это необходимо. Корреляция между этими двумя группами были проанализированы с использованием метода корреляции Спирмена. Непараметрический Уилкоксона ранг испытаний были использованы для сравнения непрерывных данных для того же пациента между язвой и неязвенной областях. Все статистические анализы проводились с использованием программы SPSS для Windows, версии 14.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Все значения р
были двухвостый и значение менее 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Демографические данные
<р> С февраля 2010 года по январь 2012, 55 право циррозом и 55, имеющие право без пациентов с циррозом, которые эндоскопически доказали язвы желудка были включены последовательно. Из общего числа 110 зачисленных, средний возраст составил 60,3 ± 11,8 лет (диапазон, 27-86 лет). Шестьдесят девять (62,7%) пациентов были мужчины и 41 (37,3%) составляли женщины. Демографические данные всех пациентов приведены в таблице 2. Обе группы были сопоставимы по полу, размеру язвы, гемоглобина, сывороточного креатинина и скорости зараженности H. . Пилори
Тем не менее, группа цирротический были моложе по возрасту и имели более низкое количество тромбоцитов и сывороточного альбумина, чем у не-циррозом группы (р &л; 0,05). (Таблица 2)

мРНК Выражения проангиогенных факторы роста и их рецепторов
<р> Там не было никаких существенных различий в мРНК выражения проангиогенные факторов роста (VEGF, bFGF, PDGF) и их рецепторы (VEGFR1, VEGFR2, Fgfr1, FGFR2, PDGFRA, PDGFRB) над не -ulcer участки слизистой оболочки желудка между циррозом и без цирроза групп (таблица 3). Над краем язвы слизистой оболочки желудка, циррозом группа и не цирротический группы были сопоставимы в выражениях VEGF, VEGFR1, bFGF, PDGFA, PDGFRA и PDGFRB (рис. 1). Тем не менее, группа циррозом имели более низкие мРНК выражения PDGFB, VEGFR2, FGFR1 и FGFR2, чем не-циррозом группы (рис. 1).
<Р> Дальнейший анализ с использованием Уилкоксона ранга испытаний было проведено с целью сравнения данных для Тот же больной между неязвенной и маржинальных областях язвенной болезни. Были значительные возвышенностей в мРНК выражений bFGF и PDGFRB на полях областей язвенных по сравнению с неязвенной областей в обоих не-циррозом и пациентов с циррозом (таблица 4). Там не было никаких существенных возвышенностей в мРНК выражения VEGF, VEGFR1, PDGFA и PDGFRA на полях областей язвенных по сравнению с неязвенной областей в обоих не-циррозом и пациентов с циррозом (таблица 4). Были значительные возвышенностей в мРНК выражения VEGFR2, PDGFB, FGFR1 и FGFR2 на полях областей язвенных по сравнению с неязвенной областей (р &л; 0,05) в не цирротической группе, но не было никаких существенных возвышений мРНК выражения PDGFB, VEGFR2, FGFR1 и FGFR2 на полях областей язвенных по сравнению с неязвенной областей в цирротической группе (рис. 2 и таблица 4).

Корреляция между проангиогенные факторов роста /рецепторов и тромбоцитарный Count
<р> мРНК выражения PDGFB, VEGFR2, FGFR1 и FGFR2 на полях язву районах пациентов с циррозом имели хорошую корреляцию с количеством тромбоцитов (ρ &GТ; 0,5, р &л;. 0,001, рис 3).

Обсуждение
<р> Мы обнаружили, что у пациентов с циррозом уменьшилась мРНК выражения проангиогенные факторов роста (PDGFB) и их рецепторов (VEGFR2, Fgfr1 и FGFR2) в желудочном краях язвенных по сравнению с теми, из не- пациентов с циррозом. Эти уменьшенные выражения PDGFB, VEGFR2, FGFR1 и FGFR2 были хорошо коррелируют со степенью тромбоцитопении в пациентов с циррозом. Эти находки указывают на нарушение язвенной болезни желудка исцеление пациентов с циррозом и обеспечить возможное объяснение более высокого возникновения язвенной болезни у пациентов с циррозом.
<Р> Факторы, которые могут оказать влияние на желудочную заживлению язвы включают возраст, пить, курить, использование НПВС, аспирин, стероиды, клопидогрел, тиклопидин, ингибиторы протонной помпы, 2 антагонисты рецепторов гистамина, мизопростол, статус H. пилори
инфекции, и питания состояние [20]. Мы исключили пациентов, которые употребляли алкоголь, курили, принимали вышеуказанные лекарства, а также с нестабильной активностью болезни, плохое общее состояние, или лежащих в основе злокачественных новообразований во время регистрации, чтобы избежать этих сопутствующих факторов. Цирротической пациенты были моложе по возрасту, и имели более низкий сывороточный альбумин по сравнению с не-пациентов с циррозом. Тем не менее, они были сопоставимы креатинина в сыворотке крови, желудочном размер язвы, и скорость H. Pylori
инфекция.
<р> PDGF, гликопротеин, хранится в тромбоцитах и ​​высвобождается при стимуляции. ФРПТ составляет приблизительно 50% от тромбоцитарных митогенной активности [21], стимулируя пролиферацию гладкомышечных артериальных клеток и фибробластов. PDGF, вместе с bFGF, играет важную роль в восстановлении соединительной ткани, в том числе кровеносных сосудов и ускоряет заживление язв [21], [22]. Хорошая корреляция между количеством тромбоцитов и экспрессии PDGFB позволяет предположить, что тромбоцитопения у пациентов с циррозом могут оказывать влияние на секрецию PDGFB влияя тем самым на Язва желудка заживление.
<Р> bFGF, активизируя FGFR-ERK трансдукции сигнала пути, было показано, что значительно ускоряют заживление язв за счет увеличения плотности микрососудов в язвенные ткани и содействие пролиферации эпителиальных клеток [19], [22], [23]. Наши результаты показали, что мРНК выражения bFGF были значительно увеличены в желудочном края язвы обоих циррозом и без цирроза пациентов (таблица 4). Однако мРНК выражения FGFR1 и FGFR2 были значительно уменьшились в Язва желудка полях циррозом пациентов по сравнению с теми из не больных циррозом, а также, что экспрессия мРНК FGFR хорошо коррелирует с количеством тромбоцитов в пациентов с циррозом. Из-за ограниченного количества образцов желудочного, мы не смогли прояснить отношения между bFGF-FGFR-ERK пути передачи сигнала, ангиогенез и пролиферацию эпителиальных клеток в больных циррозом. Дальнейшие исследования с использованием цирротический крысиной модели необходимы для уточнения роли тромбоцитопении в передаче сигналов bFGF-FGFR-ЭРК, ангиогенез и заживление язвы.
<Р> Присутствие мРНК VEGF и белка в мегакариоцитов обеспечивает убедительные доказательства, что синтез VEGF во время тромбопоэза происхождение тромбоцитов VEGF [24]. СЭФР, которая хранится в тромбоцитарных альфа-гранул, секретируемых из агрегацию тромбоцитов, вызванную тромбином, коллагеном или АДФ [25]. VEGF и его рецептор, VEGFR, значительно ускоряет заживление язвенной болезни желудка путем расширения кровеносных сосудов, включая пролиферацию эндотелиальных клеток, миграцию и трубчатых образований на месте язвы [22], [26]. Одно исследование показало, что животное тромбоциты ускоренное заживление язв желудка путем представления VEGF [27]. Тем не менее, наше исследование показало, что только экспрессия мРНК VEGFR2 значительно в язвенных полях не-пациентов с циррозом, но не увеличена в циррозом пациентов, которые имели значительно более низкие количества тромбоцитов. Ни VEGF, ни PDGFA был возведен в желудочном края язвы циррозом и не-циррозом в нашем исследовании, которое не согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими увеличение VEGF и экспрессии PDGF во время язвы желудка исцеления как у человека и у экспериментальных животных [11], [ ,,,0],12], [22], [26]. Возможное объяснение состоит в том, что мы просто взяли поверхностный (неглубокой) биопсию с маленькими щипцами, чтобы получить слизистой ткани края язвы как в циррозом и не-циррозом, чтобы избежать после биопсии кровотечение в циррозом при этической рассмотрении.
<Р> Это первое клиническое исследование, чтобы показать уменьшенные мРНК выражения проангиогенные факторов роста (PDGFB) и их рецепторов (VEGFR2, Fgfr1 и FGFR2) при язвенной болезни желудка полях пациентов с циррозом, и что эти уменьшенные выражения были хорошо коррелируют с более низким количеством тромбоцитов в у этих пациентов. Тромбоциты играют важную роль в заживлении язвы [12]. Тромбоцитопеническая крыс было показано, демонстрируют замедленное Язва желудка заживление по сравнению с здоровых крыс [28]. Это отсталый заживление язвы может быть отменено трансфузии тромбоцитов у здоровых крыс, а также увеличение числа циркулирующих тромбоцитов у крыс улучшилось желудка заживление язв путем введения thrombopoeitin [27], [28].
<Р> Неожиданно было обнаружено, уменьшилось выражение СЭФР и PDGFA-проангиогенные факторы роста не был найден, в то время как уменьшенного выражение VEGFR2, FGFR1 и FGFR2 -proangiogenic факторы роста рецепторов было отмечено. Все больные с циррозом печени мы зачислены в этом исследовании имели в анамнезе пищеводного варикозного кровотечения и получил лигирование варикозно расширенных вен и регулярное наблюдение, что предполагает у них есть более серьезные портальной гипертензии. Вполне вероятно, что у пациентов с более низким количеством тромбоцитов была более тяжелой портальной гипертензии и сосудистых расстройствах вторичным по отношению к портальной гипертензии приводят к сниженной экспрессии рецепторов для проангиогенные факторов, таких как FGFR1, FGFR2 и VEGFR2. Таким образом, дальнейшее исследование с использованием экспериментальных животных необходимо для прояснения этого вопроса.
<Р> Есть несколько ограничений настоящего исследования. Во-первых, хотя средний размер язвы была сопоставима в обеих группах, отбор проб смещения (биопсию из желудка краев кишки) не удалось избежать. Во-вторых, было ограниченное количество образцов желудочного от каждого субъекта по выяснению отношений между выражениями факторов проангиогенные роста, их рецепторов, сигнальных путей для ангиогенеза и клеточной пролиферации с помощью Вестерн-блоттинга или другие методы. В-третьих, заживление язвы и экспрессию факторов роста являются динамическими. Поэтому невозможно и неэтично имитировать исследования на животных [28] и оценить изменения в проангиогенные факторов роста, их рецепторов, а также механизмы процесса заживления после переливания тромбоцитов у пациентов с циррозом или после истощения тромбоцитов в не больных циррозом.

Вывод
<р> патогенез ЯБДПК в больных циррозом является сложным, а также механизмы, связанные с задержкой заживления язвы может быть одной из основных причин. Мы обнаружили, что уменьшенные мРНК выражения проангиогенные факторов роста (PDGFB) и их рецепторов (VEGFR2, Fgfr1 и FGFR2) в желудочном краях язвенных были хорошо коррелируют со степенью тромбоцитопении в пациентов с циррозом. Эти результаты свидетельствуют о том, что уменьшенная активность проангиогенные факторов и их рецепторов могут внести свой вклад в патогенезе язвенной болезни желудка у пациентов с циррозом.

Выражение признательности
<р> Авторы выражают благодарность г-жа Пуй-Чинг Ли ( Отдел медицины, Тайбэй ветеранов больницы) за помощь в статистической консультации и редактирования фигуры.

• PLoS ONE: Влияние ВВЦУ вариации на язве желудка Восприимчивость
• PLoS ONE: Метаболомика в сочетании с данными и многовариантного анализа Pathway на потенциальных биомаркеров при яз…